琥珀酸放線桿菌的固定化及利用纖維床反應器生產丁二酸的研究

陳鵬程，鄭璞

(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

琥珀酸放線桿菌的固定化及利用纖維床反應器生產丁二酸的研究

陳鵬程，鄭璞*

(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

以甘蔗渣殘渣、聚丙烯微米纖維膜和棉纖維分別作為載體固定琥珀酸放線桿菌進行丁二酸的發(fā)酵生產，通過優(yōu)化載體使用量獲得較高的丁二酸產量并進行反復分批發(fā)酵，以研究載體重復使用性能。研究發(fā)現(xiàn)，聚丙烯微米纖維膜產丁二酸相對最優(yōu)，且相對使用量最少，而棉纖維材料重復使用穩(wěn)定性最優(yōu)。以棉纖維材料構建轉動式纖維床反應器，研究不同pH調節(jié)劑對反應器運行效率的影響，發(fā)現(xiàn)以MgCO3作為pH調節(jié)劑時，丁二酸質量濃度分別比以NH3·H2O-Na2CO3和KOH-K2CO3作為調節(jié)劑時提高32%與20%。在反應器中采用反復補料分批發(fā)酵的操作方式，平均每35 h一個批次，發(fā)酵運行175 h，丁二酸平均質量濃度為87.8 g/L，平均生產強度為2.51 g/(L·h)，平均轉化率為0.86 g/g。結果表明，構建的纖維床反應器有利于實現(xiàn)丁二酸的高濃度、高生產強度和高轉化率。

丁二酸；固定；發(fā)酵；反應器

丁二酸是一種常見的天然有機酸，也是一種重要的C4平臺化合物，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、可降解塑料和化工行業(yè)。工業(yè)上通常通過丁烯二酸催化或者丁二腈水解還原制得丁二酸。2004年美國能源部將丁二酸列為最有希望實現(xiàn)生物法產業(yè)化的12種化合物之一[1]。生物基丁二酸的開發(fā)對于擺脫對化石資源的依賴，減少環(huán)境污染并減輕大氣溫室效應有著重要意義。

自2000年后，通過發(fā)酵法生產丁二酸取得的進展主要體現(xiàn)為：(1)以天然產丁二酸的琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes130Z[2]、NJ113[3]、CGMCC No.1593[4]和BasfiasucciniciproducensDSM 18541[5]為代表的厭氧發(fā)酵技術，產酸水平為40～108 g/L，生產強度0.9～1.3 g/(L·h)，糖酸轉化率0.50～0.87 g/g；(2)以E.coli工程菌NZN111、AFP111[6]、KJ122和KJ134[7]為代表的好氧-厭氧兩階段發(fā)酵技術，產酸55～99 g/L，生產強度0.9～1.1 g/(L·h)，產率0.90～1.10 g/g；(3)以E.coli工程菌HL27659k[8]、酵母工程菌Suc-297[9]為代表的好氧發(fā)酵技術，產酸43～58 g/L，生產強度0.2～1.1 g/(L·h)，產率0.20～0.60 g/g；(4)以CorynebacteriumglutamicumΔldhA-pCRA717為代表的生長限制工藝，最高產酸146 g/L，生產強度3.17 g/(L·h)，產率0.92 g/g[10]。雖然利用Corynebacteriumglutamicum工程菌的產酸達到了高產酸濃度、高轉化率和高生產強度，但這種生長限制工藝需要較高的細胞濃度(60%)，為達到高細胞濃度，往往先生長培養(yǎng)，再通過離心分離或者膜分離方法收集細胞、重懸于反應液，這樣的操作在實際生產中面臨著困難。

生物法發(fā)酵產丁二酸屬于常規(guī)的微生物厭氧發(fā)酵過程，傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝有分批、補料分批、半連續(xù)以及連續(xù)發(fā)酵等，新型的發(fā)酵工藝則是將傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝與固定化技術或生物反應器結合以增加細胞濃度、除去產物積累，從而達到提高總產物濃度或生產效率的目的。本課題組前期通過基因組改組手段，獲得高產菌株AcitnobacillussuccinogenesF3-ZK(CCTCCNO：M2012036)[11]，其最高產酸達到95.6 g/L，糖酸轉化率0.71 g/g。然而利用琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產丁二酸的過程中，細胞濃度低及生長速度緩慢是主要限制因素。本工作針對該問題，提出采用固定化的方式將琥珀酸放線桿菌與載體結合，以期實現(xiàn)菌體從體系中的快速分離與重新使用，進而給連續(xù)生產帶來便利。在固定化載體方面，分別使用甘蔗殘渣、聚丙烯微米纖維膜以及棉纖維作為載體，通過優(yōu)化載體使用量并研究載體的重復使用穩(wěn)定性，進而構建琥珀酸放線桿菌固定化的轉動式纖維床反應器，以期提高丁二酸生產效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和原材料

琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)CCTCC M2012036，由本實驗室自主篩選誘變得到，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)[11]；甘蔗渣殘渣由本實驗室自制[12]；聚丙烯微米纖維膜由浙江省紡織測試研究院提供；棉纖維購買于孚日集團股份有限公司(山東，中國)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基配制方法見文獻[13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基制方法見文獻[13]，其中初始葡萄糖質量濃度為50 g/L。

MgCO3粉末在170℃條件下滅菌2 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 游離細胞搖瓶發(fā)酵方法

25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中以體積分數(shù)2.5%的接種量接入琥珀酸放線桿菌，加入1 g滅過菌的MgCO3，在厭氧培養(yǎng)箱中38℃靜置培養(yǎng)48 h。

1.2.2 固定化細胞搖瓶發(fā)酵方法

將載體放入25 mL種子培養(yǎng)基中，以體積分數(shù)2.5%的接種量接入琥珀酸放線桿菌，放在厭氧培養(yǎng)箱中38℃下靜置培養(yǎng)12 h后，取出載體，投入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同時加入1 g滅過菌的MgCO3，在厭氧培養(yǎng)箱中38 ℃靜置培養(yǎng)48 h。反復分批發(fā)酵時，將載體從發(fā)酵液中取出投入新鮮培養(yǎng)基。

1.2.3 纖維床反應器發(fā)酵產丁二酸

發(fā)酵罐上纖維床反應器吸附琥珀酸放線桿菌是將培養(yǎng)好的種子以體積分數(shù)2.5%的接種量添加到裝有2 L種子培養(yǎng)基的反應器中，在38 ℃下培養(yǎng)6 h，當pH降低至6.2時，用蠕動泵將種子液排出，補加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基1.6 L，38 ℃，攪拌轉速120 r/min，每隔3～4 h取樣測葡萄糖質量濃度，當葡萄糖質量濃度低于5 g/L時，發(fā)酵結束。發(fā)酵過程中控制pH為6.5。當使用NH3·H2O-Na2CO3以及KOH-K2CO3作為調節(jié)劑時，當發(fā)酵液pH下降至6.5以下，通過蠕動泵自動流加NH3·H2O-Na2CO3以及KOH-K2CO3水溶液；使用MgCO3作為調節(jié)劑的時候，當發(fā)酵液pH下降至6.5以下，手動從進料口加入MgCO3固體粉末。纖維床反應器反復補料分批發(fā)酵是當發(fā)酵液中殘?zhí)琴|量濃度降低至10 g/L時，一次性加入高質量濃度的葡萄糖，使得發(fā)酵液中葡萄糖質量濃度達到55 g/L左右，待殘?zhí)琴|量濃度再一次降低到5 g/L以下時，將發(fā)酵液排出，添加新鮮培養(yǎng)基重復上述補料分批發(fā)酵，反復操作4批次。

1.2.4 分析方法

發(fā)酵液中生物量采用比濁法[14]，糖、有機酸的測定采用高效液相色譜法[15]。

2 結果與分析

2.1 不同載體對琥珀酸放線桿菌的固定化及產酸穩(wěn)定性

2.1.1 甘蔗渣殘渣作為固定化載體

甘蔗渣是甘蔗提煉甘蔗汁后留下的纖維性物質，主要組分為纖維素、半纖維素和木質素。甘蔗渣經堿預處理聯(lián)合纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果膠酶復合處理后的殘渣為甘蔗渣殘渣。從圖1(a)可以看出，經過預處理以及酶解之后的甘蔗渣殘渣空間結構松散，為菌體提供了附著空間。因此嘗試使用甘蔗渣殘渣作為載體吸附琥珀酸放線桿菌，以減少種子的培養(yǎng)操作進而縮短發(fā)酵周期。

圖1 載體(a)甘蔗渣殘渣、(b)聚丙烯微米纖維膜和 (c)棉纖維掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of supports (a) sugarcane bagasse residue,(b) polypropylene microfiber membrane and (c) cotton cloth

對甘蔗渣殘渣在發(fā)酵過程中的用量進行優(yōu)化，初糖質量濃度為50 g/L，結果見表1。從表1可以看出，隨著甘蔗渣殘渣添加量的增加，丁二酸的質量濃度、發(fā)酵液中的生物量開始呈上升趨勢；當甘蔗渣殘渣的添加量為10 g/L時，丁二酸質量濃度達到了40.0±3.25 g/L，丁二酸對糖的轉化率達到0.81±0.06 g/g的最高值。當甘蔗渣殘渣的添加量由10 g/L增加到20 g/L時，丁二酸的產量下降，可能是過高的甘蔗渣殘渣添加量影響了發(fā)酵液的傳質。對生物量進行生物學統(tǒng)計分析，差異顯著性檢驗，所得p>0.05，說明平均數(shù)之間差異不顯著。

表1 不同甘蔗渣殘渣添加量對丁二酸生產的影響Table 1 The effect of sugarcane bagasse residue usage on the production of succinic acid

進一步，將甘蔗渣殘渣用于反復分批發(fā)酵，3個批次的丁二酸產量分別為40.2、40.0和39.8 g/L。然而，由于甘蔗渣殘渣顆粒小，因此從發(fā)酵體系中分離回收不方便，為了便于載體的回收利用，接下來將使用連續(xù)的纖維材料作為固定化載體。

2.1.2 聚丙烯微米纖維膜作為固定化載體

聚丙烯微米纖維膜(圖1(b))具有纖維細、比表面積大、孔隙小而孔隙率大的特性。本實驗中使用的聚丙烯微米纖維膜主要性能參數(shù)為：膜外徑約3.24±0.57 μm、微孔孔徑約0.1～0.2 μm、孔隙率約40%～50%。在發(fā)酵液中初始葡萄糖質量濃度為35 g/L時，研究載體的表面積與發(fā)酵液體積比對琥珀酸放線桿菌生長和產酸的影響，結果如表2所示。當載體表面積與發(fā)酵液體積比為1.0∶1和1.5∶1 (cm2∶cm3)時，丁二酸的轉化率高達0.87±0.05 g/g和0.88±0.04 g/g。考慮到經濟效益，確定載體用量為載體表面積/發(fā)酵液體積比為1.0∶1 (cm2∶cm3)。對生物量進行生物學統(tǒng)計分析進行差異顯著性檢驗，所得p<0.05，說明平均數(shù)之間差異顯著。

表2 聚丙烯微米纖維膜用量對丁二酸生產的影響Table 2 Effect of polyproplene microfiber membrane usage on the production of succinic acid

在這一載體用量下，進行丁二酸的反復分批發(fā)酵。每一次發(fā)酵結束后，取出載體，置于無菌水中清洗并重新投入新鮮發(fā)酵液中，連續(xù)進行6批次發(fā)酵，結果如表3所示。在前5個批次的發(fā)酵實驗中，體系內的琥珀酸放線桿菌具有較強活力，丁二酸的平均轉化率為0.85±0.07 g/g。到了第6次發(fā)酵，菌體對葡萄糖的消耗和丁二酸生成能力開始下降。

表3 聚丙烯微米纖維膜吸附琥珀酸放線桿菌反復分批發(fā)酵產丁二酸Table 3 Repeated batch fermentation of Actinobacillus succinogenes-immobilized polypropylene microfiber membrane

2.1.3 棉纖維作為固定化載體

棉纖維材料具有大量的空隙(圖1(c))，通過物理吸附的方式，能夠將細胞吸附在棉纖維表面以及內部空隙之間。初糖質量濃度為50 g/L時考察了棉纖維材料用量對琥珀酸放線桿菌發(fā)酵丁二酸的影響。結果(表4)表明，當纖維載體表面積與裝液量之比為2.0∶1時，產丁二酸質量濃度最高，為37.4±2.97 g/L；繼續(xù)增加比例可能使得棉纖維載體相對發(fā)酵培養(yǎng)基體積過大，阻礙了傳質的進行，丁二酸的質量濃度降低至34.2±3.00 g/L。綜上所述，載體表面積與發(fā)酵液體積之比選擇2.0∶1最合適。對生物量進行生物學統(tǒng)計分析進行差異顯著性檢驗，所得p<0.05，說明平均數(shù)之間差異顯著。

表4 棉纖維用量對丁二酸發(fā)酵產量的影響Table 4 Effect of cotton cloth usage on the production of succinic acid

進一步考察棉纖維吸附琥珀酸放線桿菌反復利用情況，搖瓶反復分批發(fā)酵進行了10批次，結果(表5)表明，丁二酸的產量在10批次內沒有明顯的變化，平均產酸36.5±3.50 g/L，平均轉化0.85±0.06 g/g。

表5 棉纖維吸附琥珀酸放線桿菌搖瓶反復分批發(fā)酵產丁二酸Table 5 Repeated batch fermentation of Acitnobacillus succinogenes-immobilized cotton cloth

綜合上述實驗結果，甘蔗渣殘渣、聚丙烯微米纖維膜和棉纖維材料均可以作為載體吸附琥珀酸放線桿菌，其中在搖瓶水平，當載體使用量都在最優(yōu)條件時，聚丙烯微米纖維膜產丁二酸相對最優(yōu)。從載體材料使用量來看，在25 mL的搖瓶發(fā)酵液體系中，3種載體的使用量分別是0.25 g甘蔗渣殘渣、0.17 g聚丙烯微米纖維膜和1.76 g棉纖維，聚丙烯微米纖維膜使用量最少。從載體的來源來看，甘蔗渣是常見的農業(yè)廢棄物，聚丙烯微米纖維膜和棉纖維目前均已工業(yè)化生產且棉纖維的成本更低廉。從載體的分離來看，當使用甘蔗渣殘渣作為載體時，由于其呈粉末裝分散在發(fā)酵液里，給載體的分離帶來一定操作困難，棉纖維和聚丙烯微米纖維膜均易于從發(fā)酵體系中分離。從重復使用穩(wěn)定性來看，棉纖維材料使用穩(wěn)定性相對最優(yōu)?？紤]到反應器放大發(fā)酵時，載體的穩(wěn)定性和強度至關重要，后續(xù)以棉纖維材料為例研究纖維床反應器。

2.2 纖維床反應器的構建及其對丁二酸的生產

2.2.1 纖維床反應器的構型

在棉纖維載體表面積與發(fā)酵液體積比為 2.0∶1 (cm2∶cm3)的基礎上，將棉纖維載體平鋪于鐵絲網上并固定在3 L發(fā)酵罐(Biotech-3BG，上海市寶興生物設備有限公司)的攪拌軸上，構建了轉動式纖維床反應器(圖2)。棉纖維材料吸附琥珀酸放線桿菌主要是依靠靜電力，將細胞吸附在棉纖維載體表面，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基的更換以及跟隨攪拌轉軸的同時轉動，衰老的細胞從棉纖維材料上脫落下來，同時強壯的新細胞附著在棉纖維載體上；另一方面，由于吸附作用并不穩(wěn)定，細胞在攪拌作用下從棉纖維載體上脫落，同時又隨著徑向的作用重新吸附到棉纖維載體上，這樣更加有利于細胞對底物的利用。

圖2 內置式轉動纖維床反應器實物圖Fig.2 Image of rotary fibrous-bed bioreactor

2.2.2 不同pH調節(jié)劑對反應器運行效率的影響

丁二酸發(fā)酵過程中隨著產酸的積累，pH會逐漸降低，當pH低于5.0時，細胞生長與產酸均停止；根據(jù)電子守恒理論計算方程可得：1 mol葡萄糖在0.86 mol CO2參與下，理論生成1.71 mol丁二酸[16]。這說明發(fā)酵過程中pH調節(jié)劑不僅需要調節(jié)pH，還需要提供CO2。因此，本實驗在纖維床反應器的基礎上研究不同pH調節(jié)劑對反應器產酸的影響。在這里選擇的pH調節(jié)劑包括NH3·H2O-Na2CO3、KOH-K2CO3以及MgCO3。

利用上述pH調節(jié)劑將pH恒控制為6.5，對丁二酸生產的實驗結果如表6所示。發(fā)現(xiàn)以MgCO3作為pH調節(jié)劑時，丁二酸濃度分別比其他二者提高了32%與20%。這可能是因為MgCO3是弱堿，Mg2+容易取代H+與丁二酸分子螯合形成絡合物，減輕了未解離形式的丁二酸對細胞的抑制；此外有報道稱K+、Na+與細胞膜的運輸有關，因此可能會影響菌體對葡萄糖的利用。

2.2.3 纖維床反應器的運行穩(wěn)定性

在3 L發(fā)酵罐的纖維床反應器中，反復補料分批發(fā)酵5批次，發(fā)酵運行175 h，發(fā)酵曲線如圖3所示。平均每35 h一個批次，丁二酸平均質量濃度為87.8 g/L，平均生產強度為2.51 g/(L·h)，平均轉化率為0.86 g/g，在這5個批次中，剩余葡萄糖濃度均為5 g/L以下。其中第3批次時，獲得的丁二酸質量濃度最大，為98.7 g/L，生產強度為2.77 g/(L·h)，轉化率為0.89 g/g。發(fā)酵第5個批次后，產酸下降，說明纖維床反應器采用補料分批發(fā)酵的操作方式的操作周期為5批次(175 h)左右，后續(xù)希望對反應器的材料和內部結構細節(jié)進行深入研究，從而進一步延長操作周期。

表6 不同pH調節(jié)劑對丁二酸生產的影響Table 6 Effect of pH regulator on the production of succinic acid

■丁二酸;▲葡萄糖;◇生物量圖3 纖維床反應器反復補料分批發(fā)酵圖Fig.3 Repeated fed-batch fermentation behavior of fibrous-bed bioreactor

3 結論

本文系統(tǒng)地研究了吸附琥珀酸放線桿菌的載體材料及其發(fā)酵產丁二酸性能，并構建轉動式纖維床反應器實現(xiàn)丁二酸的高效生產。研究表明，棉纖維、聚丙烯微米纖維膜和甘蔗渣殘渣均可以吸附琥珀酸放線桿菌，其中采用棉纖維作為載體，反復分批發(fā)酵運轉10批次，結果平均產酸為36.5±3.50 g/L，平均轉化率為0.85±0.06 g/g。進而利用棉纖維構建轉動式纖維床反應器，采用補料分批發(fā)酵的操作方式，可實現(xiàn)同時高產酸、高生產強度以及高轉化率，運行周期約為175 h，有較好的穩(wěn)定性。

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ImmobilizationofActinobacillussuccinogenesandtheproductionofsuccinicacidusingfibrous-bedbioreactor

CHEN Peng-cheng,ZHENG Pu*

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China)

In this paper,sugarcane bagasse residue,polypropylene microfiber membrane and cotton cloth were adopted as supports to immobilizeActinobacillussuccinogenesfor the fermentative production of succinic acid.The usage of supports was optimized to improve the yield of succinic acid and repeated batch fermentation was conducted to study the reusable stability of supports.Polypropylene microfiber membrane was preferred in the production of succinic acid while cotton cloth was preferred in the reusable stability test.As a result,cotton cloth was used in the construction of a fibrous-bed bioreactor.In the study of the effect of pH regulator on bioreactor efficiency,there were 32% and 20% increase in succinic acid concentration when using MgCO3as the pH regulator compared with that using NH3·H2O-Na2CO3and KOH-K2CO3.Repeated fed-batch fermentation was operated in the bioreactor with the average batch time of 35 h and the total operation time of 175 h.Results showed that the average concentration,productivity and yield of succinic acid were 87.8 g/L,2.51 g/(L·h) and 0.86 g/g,respectively.Results showed that the fibrous-bed bioreactor reported in this paper should be helpful for high concentration,high productivity and high yield of succinic acid.

succinic acid; immobilization; fermentation; bioreactor

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015305

博士，講師(鄭璞教授為通訊作者，E-mail：zhengpu@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(21604032)；“十二五”農村領域國家科技計劃課題(2015BAD15B04)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(JUSRP116031)；江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室開放課題(KLIB-KF201501)

2017-07-25，改回日期：2017-08-03