納豆激酶分離純化研究進展

黃妍，張勛力，張迎慶*

1(湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢，430068)2(北京納百恩食品有限公司，北京，102200)

納豆激酶分離純化研究進展

黃妍1，張勛力2，張迎慶1*

1(湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢，430068)2(北京納百恩食品有限公司，北京，102200)

納豆激酶是枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶，具有較強的溶栓作用。與其他溶栓劑相比，納豆激酶易被吸收，作用迅速，安全性好，可做為新型溶栓劑。文中概述了納豆激酶的理化性質(zhì)和作用機制，著重介紹了納豆激酶的幾種常見的分離純化方法，包括柱層析法、超濾法、萃取法和親和顆粒法，以及集成化分離純化技術，并對納豆激酶分離純化的新方法進行了展望，以促進納豆激酶的深入開發(fā)和應用。

納豆激酶；分離純化；親和；吸附

納豆，起源于中國古代，是一種歷史悠久的風味食品。納豆一般的制作工藝是將精選的大豆洗干凈，浸泡一段時間，然后煮熟、攤涼，接種納豆芽孢桿菌，發(fā)酵一段時間即可得到成熟納豆[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，納豆的營養(yǎng)豐富，在發(fā)酵過程中不僅沒有損壞黃豆的營養(yǎng)，還產(chǎn)生了許多具有生物活性的物質(zhì),包括：納豆激酶、VK2、γ-多聚谷氨酸、環(huán)脂肽、2，6-吡啶二羧酸等[2]。這些活性物質(zhì)在幫助蛋白質(zhì)吸收的同時，還使納豆具有溶血栓、降血脂、降血壓、防止骨質(zhì)疏松、消除疲勞、抗菌消毒、抗氧化、延緩衰老的功能[3-4]，而其中研究最多的是具有溶栓作用的納豆激酶，高活性的納豆激酶提取分離純化技術又是其深入開發(fā)應用的關鍵，本文主要就納豆激酶的分離純化方法的研究進展進行綜述。

1 納豆激酶的性質(zhì)及溶栓機制

1.1 納豆激酶的性質(zhì)特點

納豆激酶是納豆在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，由275個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為27.7 ku，等電點pI值為8.6[5]。雖然納豆激酶與絲氨酸蛋白家族的許多枯草桿菌蛋白酶的序列相似，并且具有高度的同源性，但是對底物表現(xiàn)出了明顯的特異性[6]。

納豆激酶比較穩(wěn)定，在pH 6～12時表現(xiàn)了出較好的纖溶活性，但在酸性環(huán)境中由于缺乏功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性而無活性。因此有研究者為防止含有納豆激酶的口服藥物被胃液破壞，將丙烯酸樹脂L 100-55和羥丙基纖維素混合制成腸溶衣包裹在納豆激酶片劑表面，來控制納豆激酶藥物在體內(nèi)的釋放速率[7]。

隨著溫度的升高，納豆激酶的活性逐漸降低，到60 ℃徹底失活。為減小溫度對納豆激酶穩(wěn)定性的影響，有研究者發(fā)現(xiàn)采用γ-聚谷氨酸作為納豆激酶微膠囊的涂層材料后可提高納豆激酶對溫度和pH的穩(wěn)定性[8]。經(jīng)過5次反復凍融，納豆激酶的活性仍可以保持在95%以上，表明凍融對納豆激酶的活性影響不大[9]。

1.2 納豆激酶的溶栓作用機制

血栓疾病是嚴重威脅人類生命健康的疾病，因此溶栓藥物的研究受到了廣泛的關注。納豆激酶是納豆發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)之一，而溶解血栓是其最重要的活性。

納豆激酶在體內(nèi)還是體外都有纖溶活性，不僅可以直接溶解纖維蛋白，而且可以促進細胞釋放組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，激活組織型纖溶酶來降解纖維蛋白[10]。此外納豆激酶還能激活產(chǎn)生纖溶酶原來增加內(nèi)源纖溶酶，催化尿激酶原轉(zhuǎn)化成尿激酶來促進纖維蛋白的溶解。雖然納豆激酶對纖維蛋白原不敏感，但是對交聯(lián)纖維蛋白裂解起有效促進作用，并且能使纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)失活，通過阻止血栓素形成來抑制血小板的聚集[11]。

在血液中納豆激酶的纖溶活性能保持3 h以上[12]，降低血漿中的纖維蛋白原、凝血因子VII和凝血因子VIII的含量是納豆激酶的另一個特點，因此，納豆激酶可作為治療心血管疾病的藥物或營養(yǎng)品[13]，并且有安全、高效、經(jīng)濟的特點，也是溶栓藥物的研究重點[14]。

2 納豆激酶的提取純化方法

目前工業(yè)化生產(chǎn)納豆激酶主要從納豆芽孢桿菌的發(fā)酵液中提取，納豆激酶是胞外酶，將其發(fā)酵液經(jīng)過一系列分離純化處理即可得到納豆激酶。然而發(fā)酵液成分復雜，納豆激酶并不能在其中穩(wěn)定存在，容易由于其存在環(huán)境的過酸、過堿或高溫等極端條件而失活。因此在純化納豆激酶的同時要保證其活性，常常需要多步操作。

2.1 柱層析法

由于生物大分子對分離純化的條件比較嚴格，大部分采用的都是傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離純化的方法，即色譜分離技術，也稱柱層析法。柱層析法純化或回收蛋白酶時通常涉及到幾個步驟，包括硫酸銨或有機溶劑沉淀、過濾或離心、透析等，然后進行色譜分離，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水作用層析和親和層析。最后得到的濾液再進行濃縮、冷凍干燥。一般可將凝膠層析、親和層析、疏水層析和離子交換層析中的一種單獨使用，也可將兩種以上的層析方法配合使用。

近年來，部分研究者采用柱層析法分離納豆激酶的研究成果見表1。

表1 柱層析法分離納豆激酶的部分研究成果Table 1 Research on separation of nattokinase by column chromatography

柱層析法在納豆激酶的分離純化方面應用廣泛，雖然可以得到較高的回收率，但也存在著一些缺點，比如成本高、操作復雜、消耗時間長且不易于放大用于工業(yè)生產(chǎn)，并且當利用有機溶劑沉淀雜蛋白時，也極易使蛋白變性失活。因此為保證得到的純化酶具有較高的催化活性，就需要找到提取條件溫和、操作過程簡單、成本不高的分離純化技術，應用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.2 超濾法

超濾技術的核心部分為具有微小孔徑的超濾膜。超濾膜可以將流經(jīng)其表面，大于其孔徑的分子截留，小于其孔徑的分子則透過，從而達到濃縮大分子的目的。這種方法雖然不會對酶活力有損害，但單獨使用得到的酶純度不高，因此多與其他方法聯(lián)用。

陳景鑫等[23]將超濾法和層析法聯(lián)用，先使用超濾法處理實驗室制備的納豆激酶粗酶液，探究了超濾壓力、超濾溫度、料液pH值等主要參數(shù)對膜通量的影響，確定了超濾分離納豆激酶的最佳工藝條件后，再用層析法分離得到納豆激酶的比活力為9 610.46 IU/mg、回收率為92.3%，酶液經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳表現(xiàn)為單一蛋白條帶，相對分子質(zhì)量為28 000 u。

MURAKAMI等[24]將納豆激酶發(fā)酵液離心除菌后使用反滲透膜處理，再將濾液通過截流分子質(zhì)量為10 ku的超濾膜除去小分子量雜質(zhì)，之后使用CM-瓊脂凝膠柱洗脫，得到的較高活性的濾液經(jīng)超濾設備進一步濃縮，再次用凝膠柱S-100過濾后，經(jīng)12 000 r/min離心得到純化度較高的納豆激酶。因此若將超濾技術代替鹽析法進行發(fā)酵液的前處理，再上色譜柱進一步純化濾液得到的納豆激酶活性很可能較鹽析法高，且方法可行。但是鹽析操作也有一定的優(yōu)點，一定濃度的鹽溶液在沉淀雜蛋白的同時，也可以去除一定量的離子，既可以減少大分子堵塞濾膜的概率，又能降低雜離子對離子交換柱的吸附影響。王建[25]先將發(fā)酵液用鹽析法進行前處理，再根據(jù)納豆激酶的分子量選用不同孔徑的超濾膜純化納豆激酶。選用30%飽和度的硫酸銨沉淀雜蛋白，再用70%飽和度的硫酸銨沉淀納豆激酶，根據(jù)納豆激酶的分子量，將納豆激酶的粗酶液經(jīng)30 ku的超濾膜過濾，并將透過的溶液收集再經(jīng)10 ku的超濾膜，收集沒有透過膜的濾液。通過單因素實驗和正交實驗研究了操作壓力、料液溫度和料液pH值等超濾工藝參數(shù)對膜通量和納豆激酶含量的影響，最后分離純化得到的納豆激酶比活力達到1 052.41 IU/mg，純化倍數(shù)為2.5，回收率達到81%。與僅用硫酸銨鹽析法分離純化納豆激酶相比較，雖然進一步使用超濾法提純后回收率有所下降，但納豆激酶的純化倍數(shù)得到很大提高，并且超濾法步驟比較簡單,對納豆激酶的含量也不會有特別大的損失。蔡立濤與黃婷[26-27]等都將發(fā)酵液經(jīng)過鹽析法將雜蛋白進行初步除雜后再經(jīng)超濾法過濾，得到的混合液經(jīng)SDS-PAGE,顯示的分子質(zhì)量約為27 000 u左右，纖溶蛋白平板顯示結(jié)果具有較好的纖溶活性。因此可以得出鹽析與超濾法聯(lián)用可以取得活性較好，回收率較高的納豆激酶。

2.3 萃取法

傳統(tǒng)的萃取法用到的有機溶劑易破壞蛋白質(zhì)的生物活性，所以用萃取法分離純化生物大分子時，使用最多的為雙水相萃取法以及反膠團萃取法。

雙水相萃取法是一種行之有效的液液萃取的分離方法，在純化目標蛋白時能同時去除雜質(zhì)，達到短時間濃縮的目的。當水溶液中含有兩種聚合物/聚合物或聚合物/鹽時，若這些成分濃度達到一定的臨界值，兩種成分之間因互不相容而分離，形成兩相，即雙水相系統(tǒng)。雙水相系統(tǒng)利用生物大分子在兩相之間的溶解度不同而將目標分子分離，具有生物相容性，因此當外界條件不變時，納豆激酶能穩(wěn)定存在其中，不會破壞酶的活性。并且雙水相系統(tǒng)能耗低，不會對環(huán)境造成太大污染，也方便放大。

YANG等研究了PFG400/(NH4)2SO4和PEG6000/ MgSO4兩種雙水相系統(tǒng)提取納豆激酶，研究最適提取條件。結(jié)果表明，和PEG6000/MgSO4雙水相系統(tǒng)相比，PFG400/(NH4)SO4雙水相系統(tǒng)更適合提取納豆激酶，當PFG400占體系的24%，(NH4)SO4占27%，納豆激酶粗酶液占15%時，提取效果最好，納豆激酶純化因子達2.11。這種方法雖然可以將水溶性聚合物和鹽回收再利用，但是仍然成本較高，選擇性較低，只適合用于粗分離。

由于納豆激酶的氨基酸序列中存在-His-Gly-Thr-His-結(jié)構(gòu)，還可以利用二價或三價金屬離子對該結(jié)構(gòu)的螯合親和作用,將金屬粒子引入雙水相系統(tǒng)中分離納豆激酶。陸瑾等[28]利用金屬螯合親和水相分配技術對納豆激酶的分離純化進行了研究，結(jié)果表明，雙聚合物系統(tǒng)比聚合物/無機鹽系統(tǒng)更有利于納豆激酶親和分配，pH值和親和配基加入量是影響分配的關鍵因素。優(yōu)化條件為:聚乙二醇質(zhì)量分數(shù)為2.6%，羥丙基淀粉質(zhì)量分數(shù)為20.2%，親和配基PEG-IDA-Cu(II)質(zhì)量分數(shù)為5%，相比1.2，pH 8.2，發(fā)酵液加入量質(zhì)量分數(shù)15%。分配系統(tǒng)放大到100 g，仍保持酶活收率為90%和純化因子為2.0。金屬螯合親和萃取的選擇性取決于能與目標蛋白氨基酸結(jié)合的基團或金屬離子，并且這種結(jié)合作用不受高鹽濃度的影響，但是對于那些容易被金屬離子引起變性的酶的實用性不高。

反膠團萃取是在非極性溶液中加入表面活性劑，使表面活性劑分子在溶液中形成外部疏水，內(nèi)部親水的微球，這些微球?qū)⒛繕说鞍酌赴谖⑶騼?nèi)部，使蛋白酶避免與有機溶劑接觸而保障了蛋白酶的活性，將這些微球轉(zhuǎn)入水相后即完成了生物分子的分離。LIU等[29]利用同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性的特點，從模擬系統(tǒng)入手，研究從發(fā)酵液中提取目標蛋白的方法。由于納豆激酶和Subtilisin Carlsberg為同源蛋白，以Subtilisin Carlsberg為模擬蛋白，以AOT/isooctane反膠團體系為有機相，研究了各種萃取條件和反萃取條件對Subtilisin Carlsberg萃取過程的影響，并利用AOT/isooctane反膠團體系從發(fā)酵液中分離純化納豆激酶。結(jié)果表明，納豆激酶的萃取行為和Subtilisin Carlsberg非常類似，證明以目標蛋白的同源蛋白作為模擬蛋白研究萃取規(guī)律是可行的，經(jīng)過一次萃取循環(huán)，納豆激酶的回收率為33.25%，酶活回收率達到80.2%，純化因子為2.5左右。這種模擬系統(tǒng)萃取目標蛋白的方法大大減小了直接萃取目標蛋白的難度，并且與傳統(tǒng)的萃取方法相比選擇性高、成本不高、操作也較為簡單。

三相分配技術是一項相對較新的技術，不同于雙水相系統(tǒng)，該技術可以從發(fā)酵液中直接提取目標蛋白，并將混合液分為3層，上層為有機相，下層為水相，非極性有機相與極性水相之間則為目標蛋白的富集區(qū)。三相分配技術具有簡單、快速、高效的特點，并且易于放大用于工業(yè)生產(chǎn)。ROMY等[30]利用三相分配技術從納豆激酶發(fā)酵液中分離納豆激酶，采用硫酸鈉和叔丁醇組合沉淀粗蛋白，使目標蛋白存在于下層水層和上層有機層之間的界面。他們研究了溫度、pH、硫酸銨和叔丁醇的濃度等關鍵參數(shù)，發(fā)現(xiàn)pH 8，溫度37 ℃，硫酸銨質(zhì)量濃度為30%，并且和叔丁醇的比例為1∶1.5最為合適。一次三相分離，純化倍數(shù)為5.6，酶活回收率為129.5%。納豆激酶用不同的輔料凍干，同時采用叔丁醇(助溶劑)冷凍干燥，其二級結(jié)構(gòu)沒有影響。三相分離技術使用的叔丁醇與沉淀的蛋白結(jié)合，增加了蛋白的浮力，使沉淀蛋白浮于濃鹽溶液之上，因此相較于其他分離純化方法具有條件溫和以及成本低等優(yōu)點，既保證了酶的活性不受影響，回收率也較高。

2.4 親和顆粒

親和顆粒提取生物大分子取決于與特定靶分子之間相互作用的親和配體。近年來，制備親和顆粒吸附劑，利用其對納豆激酶的親和性，在納豆激酶的粗酶液中親和吸附納豆激酶，是提取純化納豆激酶的又一新興方法。

早在2006年，YANG等[31]制備了大小均一，用氨基修飾的PMMA磁性微球，并將對氨基甲苯脒作為親和配體固定于微球表面，最后得到的磁性微球可以在發(fā)酵液中直接純化納豆激酶，并且純化倍數(shù)和酶活回收率分別為8.7和85%，純化過程僅需40 min。由于這種方法和傳統(tǒng)方法相比不僅節(jié)省純化時間，較大程度上簡化了選擇過程，還提供了較好的結(jié)果，于是越來越多研究者傾向于制備親和顆粒來純化納豆激酶。2011年，蘇俊彩等[32]利用大豆蛋白對納豆激酶有吸附作用，通過反相懸浮聚合法制得了殼聚糖微球，并在它表面上交聯(lián)上大豆蛋白，制得的殼聚糖微球成為親和吸附劑，對納豆激酶具有特異性吸附性能，測得的吸附平衡時間為60 min，回收率為5.23%，純化因子為18.1。2012年，馬躍華等[33]采用靜態(tài)吸附方法驗證了大豆顆粒對納豆激酶的親和吸附特性，測定了其靜態(tài)吸附動力學特性和吸附等溫線以及吸附條件。結(jié)果表明吸附的最佳緩沖液選擇pH 6.0，0.01 mol/L的PBS，吸附時間4 h，濃度為1 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，在靜態(tài)時，選用大豆顆粒的最大吸附量為6 351.58 IU/g，洗脫后收率達到81.3%，純化倍數(shù)約30.23倍，并且電泳檢測可達到一條帶。因此他們初步推斷大豆蛋白之所以可以吸附納豆激酶，是因為大豆蛋白中可能含有與納豆激酶特異性吸附的配體結(jié)構(gòu)。

隨著制備親和吸附劑方法的發(fā)展，也有研究者用化學合成的方法制備了易于與混合液分離的親和吸附顆粒。KONG等[34]采用改進懸浮聚合法制備了磁性聚醋酸乙烯酯微球，經(jīng)水解、氨基化修飾，以戊二醛作間隔臂偶聯(lián)配基對氨基苯甲脒，制得磁性PVA親和微球，用于納豆激酶粗酶液的分離純化，結(jié)果表明，磁性微球具有較高的比飽和磁化強度，40 min即可達到納豆激酶的吸附平衡，15 min內(nèi)完成酶的解吸，酶活回收率接近75%，電泳分析為一條帶。2017年，LIU等[35]用二咪唑為交聯(lián)劑，DMSO作溶劑，將精氨酸或賴氨酸修飾在磁性納米顆粒表面，用來吸附納豆激酶，并用茚三酮法檢測吸附結(jié)果。研究結(jié)果表明，精氨酸修飾的磁性納米顆粒對納豆激酶的吸附量為所及表面修飾的4倍。精氨酸表面修飾的磁性納米粒子對納豆激酶的吸附量在9.6～30 mol/mg，可以有效分離納豆溶液中的納豆激酶。制備親和顆?？梢栽诎l(fā)酵液中直接吸附目標蛋白而達到分離純化的目的，操作簡單，效率高，不會對蛋白活性有任何不良的影響，更易于分離，是一種理想的分離純化方法。

2.5 集成化分離純化法

分離技術的集成化是利用已有的和新開發(fā)的生物技術，將下游過程的有關單元進行有效組合，或者將兩種以上的分離技術合成為一種更有效的分離技術，達到提高產(chǎn)品收率、降低過程能耗和增加生產(chǎn)效益的目標。

膨脹床分離是一種集成化分離技術，可直接從未經(jīng)固液分離的發(fā)酵液中吸附目標蛋白，將固液分離、目標產(chǎn)物的濃縮和初步純化集成于一個單元操作中，避免了復雜的純化步驟使納豆激酶失活的缺點，提高了產(chǎn)品回收率，可用于快速分離純化。胡洪波等[36]對膨脹床分離納豆激酶過程的各個階段進行了考察。填充床上的探索性實驗表明，吸附時最佳的pH為6，電導率應低于6.2 ms/cm。與傳統(tǒng)法相比，用膨脹床對納豆激酶進行分離和純化，操作步驟從離心去除菌體、鹽析沉淀、離心收集沉淀、溶解沉淀、離心收集上清液和離子交換層析6步減少到離心、膨脹床分離2步，操作時間縮短了8～10 h，回收率提高了約50%。充分體現(xiàn)了分離過程集成的優(yōu)勢。

3 展望

在納豆激酶分離純化過程中，大部分研究都采用了兩種或兩種以上的操作步驟，例如過濾、鹽析沉淀、透析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和作用、疏水作用等。超濾是常用的濃縮方法，但有比較廣泛的透過率和濾膜易被污染的缺點。色譜分離法，需要進行前處理，消耗較多的時間，一般用于治療性蛋白，不能應用于大規(guī)模生產(chǎn)；而通常的萃取法得到的納豆激酶純度也不高。因此即使含有納豆激酶的產(chǎn)品廉價易得產(chǎn)量高[37]，但納豆激酶的純品卻不多見。隨著分離純化技術的不斷發(fā)展，新型的分離純化技術在生物制品上的應用上也越來越廣泛。文中所討論的親和顆粒的方法不僅對納豆激酶具有特異性，還可以直接在混合液體中直接吸附納豆激酶，而且易于與原混合液分離。近年來不斷發(fā)展起來的分子印跡技術[38]與該方法有同工之妙，只需根據(jù)不同模板分子的大小、理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)特點，制備對模板分子具有特異性吸附作用的印跡聚合物，用該聚合物吸附特定的模板分子，對小分子或絕大多數(shù)的生物大分子都適用，且不會破壞其生物活性，具有操作簡便，精度高，耗時短的優(yōu)點。技術的發(fā)展日新月異，待更多的分離純化技術成熟，有望投入大規(guī)模分離生產(chǎn)，獲得更多高質(zhì)量、高純度的納豆激酶產(chǎn)品指日可待。

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AdvanceonisolationandpurificationofNattokinase

HUANG Yan1,ZHANG Xun-li2,ZHANG Ying-qing1*

1(Food and Bioengineering College,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China) 2 (Beijing NABIO Food Limited Company,Beijing 102200,China)

Nattokinase with strong thrombolytic effect is a kind of serine protease produced byBacillussubtilis.Compared with other thrombolytic agents,nattokinase is easy to be absorbed and has a rapid effect and good safety.Therefore,it is a new thrombolytic agent to be developed.The mechanism and physicochemical properties of Nattokinase were summarized herein.Several methods for isolation and purification of nattokinase were introduced,including column chromatography,ultrafiltration,extraction and affinity particle adsorption,as well as integrated separation and purification technology.The new method for isolation and purification of nattokinase was prospected to improve the development and application of Nattokinase.

Nattokinase; isolation and purification; affinity; adsorption

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015373

碩士研究生(張迎慶教授為通訊作者，E-mail：ying qingzhang@163.com)。

2017-08-04，改回日期：2017-08-25