“上火”人群中Activin A、E-selectin的差異表達研究

汪琴靜 徐 莉 包 潔 季巾君 謝冠群 范永升

(1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，杭州，311200； 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州，310053)

“上火”人群中Activin A、E-selectin的差異表達研究

汪琴靜1徐 莉2包 潔2季巾君2謝冠群2范永升2

(1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，杭州，311200； 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州，310053)

目的：通過對“上火”人群中細胞因子激活素A(ActivinA)及E選擇素(E-selectin)血清含量的測定以及外周血單個核細胞基因表達水平檢測，探討激活素A及E選擇素在“上火”人群發(fā)病機制的影響和作用。方法：采集臨床患者血液樣本并提取血清及外周血單個核細胞。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中激活素A及E選擇素的含量，應(yīng)用RT-PCR法檢測激活素A及E選擇素的基因表達水平。結(jié)果：“上火”患者血清中activinA、E-selectin的水平以及外周血單個核細胞activinA、E-selectin基因表達水平高于正常平和質(zhì)人群；觀察組外周血中activinA、E-selectin的基因表達水平高于陰虛“上火”人群。結(jié)論：“上火”是一種局部的炎性反應(yīng)，機體內(nèi)環(huán)境在多種因素的作用下激活素A水平升高，影響炎性反應(yīng)介質(zhì)的作用或者本身作為一種炎性反應(yīng)介質(zhì)活化血管內(nèi)皮細胞刺激E選擇素的分泌與合成，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，這是“上火”機制之一。

上火；激活素A；E選擇素；炎性反應(yīng)

“上火”是指人體陰陽失衡，表現(xiàn)為目赤、口瘡、口腔潰瘍、牙齦腫痛、咽痛、口干、尿赤、便干等一系列熱象的疾病[1]。課題組前期大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起“上火”的因素主要有情志、飲食、藥物等[2]?！吧匣稹背Ｒ妼崯帷吧匣稹迸c陰虛“上火”2種證型[3]。課題組前期利用細胞因子芯片檢測6例陰虛“上火”患者“上火”前后血清細胞因子的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)的細胞因子有10種，上調(diào)的細胞因子有23種，其中發(fā)現(xiàn)細胞因子Activin A和E-selectin明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示細胞因子在“上火”的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。本研究擬在上述基礎(chǔ)上，進一步從細胞分子生物學(xué)角度探討Activin A和E-selectin對2種不同類型上火患者的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院招募的臨床志愿者48例，隨機分為實熱組、陰虛組、對照組，每組16例，其中男21例，女27例，平均年齡為38.83歲。分別采集促凝管及抗凝管血液，促凝管提取血清，抗凝管提取單核細胞，3組間年齡及性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

1.2 診斷標準 實熱“上火”和陰虛“上火”診斷標準需符合“上火”診斷標準外還應(yīng)符合自身證候標準，具體如下：實熱“上火”診斷標準：1個主癥+舌象或脈象(主癥：眼眵或痰、發(fā)熱或惡熱、目赤、面紅、牙齦腫痛、大便秘結(jié)；舌脈：舌紅苔黃燥、脈數(shù)有力)；陰虛“上火”診斷標準：1個主癥+舌象或脈象(主癥：手足心熱、兩顴潮紅、午后潮熱；舌脈：舌紅苔少或無或剝、脈細數(shù))；2)平和質(zhì)健康人群(作為正常對照組)，符合《中醫(yī)體質(zhì)分類及判定》中平和質(zhì)的判定標準；3)患者年齡在18～60歲之間；并且無心腦肝腎等重要臟器疾病者；4)自愿參加本試驗并同意簽署知情同意者。

表1 臨床樣本情況本

注：與對照組比較，*P<0.05

1.3 納入標準 1)符合入選標準的實熱、陰虛“上火”人群，具體標準如下：采用專家咨詢法，經(jīng)過多輪專家咨詢，確定“上火”的診斷標準：1個主癥(頭面部癥狀)或2個次癥(至少1個頭面部癥狀)。其中主癥為：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡、口苦、目赤干澀；次癥為：口角糜爛、目眵增多、口渴、舌痛、鼻衄、鼻腔干燥、大便干結(jié)、心煩、小便黃、多食易饑、五心煩熱、痔瘡發(fā)作、潮熱。

1.4 排除標準 1)不符合納入標準者；2)合并各系統(tǒng)靶器官嚴重病變、腫瘤、精神障礙等疾病的患者；3)懷孕及哺乳期婦女；4)研究過程中認為有不適宜入選情況者。

1.5 試劑與儀器 Activin A、E-Selectin試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific公司。Oligo(dT)、Rnase抑制劑、mRNA、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于日本TAKARA公司，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。Bio-rad T100梯度PCR儀(Bio-Rad Laboratories，Inc)、微量核酸測量儀(3300Pro Amersham ultrospec)。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 酶聯(lián)免疫吸附法檢測activinA、E-selectin的含量 促凝管取血后立即混勻，室溫靜置45 min后離心取血清。按說明書將不同濃度標準品及稀釋好的樣品加入酶標板后封板，加入生物素抗體、TMB顯色液、終止液等試劑，用酶標儀在450 nm測定OD值。繪制標準曲線。

1.6.2 RT-PCR實驗檢測activinA、E-selectin的基因表達量 引物設(shè)計：根據(jù)Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計，由上海生物工程有限公司合成，各引物序列見表2。

表2 引物序列

提取外周血單個核細胞后，再提取RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴增的目的基因為activinA、E-selectin，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min預(yù)變性，然后按95 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，反應(yīng)45個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min延伸。

2 結(jié)果

2.1 血清activinA、E-selectin含量在上火人群中的表達 上火組activinA血清含量與對照組比較，陰虛組血清含量有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實熱組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陰虛組比較，實熱組血清含量也顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上火組E-selectin血清含量與對照組比較，陰虛組有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實熱組血清含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陰虛組比較，實熱組血清含量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清activinA、E-selectin含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，△P<0.05

2.2 外周血activinA、E-selectin基因水平在上火人群中的表達 上火組activinA的表達水平與對照組比較，實熱組表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陰虛組表達有一定程度降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與陰虛組比較，實熱組表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。上火組E-selectin的表達水平與對照組比較，實熱組表達水平顯著升高(P=0.013)；陰虛組表達水平升高不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)與陰虛組比較，實熱組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

圖1 各組血清activinA含量

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，**P<0.05

圖2 各組E-selectin血清含量

注：與對照組比較，*P<0.05

表4 各組activinA基因表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，△P<0.05

表5 各組E-selectin基因表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，△P<0.05

3 討論

3.1 中醫(yī)對“上火”的認識 中醫(yī)對“上火”的認識歷史悠久，明·陳嘉謨所撰《本草蒙荃》：“若研末雞清調(diào)稠，可敷上火瘡取效”其中“上火瘡”的敘述是課題組目前發(fā)現(xiàn)最早的有關(guān)“上火”的文獻記載?！吧匣稹币话惴譃椤皩嵒稹焙汀疤摶稹?大類[4-5]。實熱“上火”多由于外邪內(nèi)侵、過食辛辣等刺激，造成臟腑功能失調(diào)引起。陰虛“上火”多因內(nèi)傷勞損所致，如久病精氣耗損、勞傷過度，陰血虛損而生內(nèi)熱，內(nèi)熱進而化虛火?！毒霸廊珪ぞ硎咫s證謨·論火證》指出“凡察火證，必須察其虛實”，認為分清火證虛實之因是診斷的首要任務(wù)?！毒霸廊珪ぞ砣齻髦忆洝っT余義》：“實熱之火其來暴，而必有感觸之故；虛熱之火其來徐，而必有積損之因，此虛火實火之大有不同也”。因此，分清虛實對“上火”的辨證與治療都具有重要意義。

圖3 各組activinA、E-selectin基因表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰虛組比較，△P<0.05

3.2 “上火”與炎性反應(yīng)之間的關(guān)系 一般情況下“上火”是一種局部的炎性反應(yīng)，人體受到環(huán)境、飲食、心理、感染等諸多因素刺激作用下，機體分泌炎性反應(yīng)介質(zhì)，使局部組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)而表現(xiàn)出“上火”的各種臨床表現(xiàn)。如“上火”患者常有反復(fù)發(fā)作的口腔潰瘍，潰瘍的發(fā)生與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)與正常人比較復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者外周血中促炎介質(zhì)明顯升高[6]，抑炎介質(zhì)水平則明顯下降，調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少，機體自身免疫耐受能力降低。此外牙齦炎在“上火”人群中常有發(fā)生，作為牙周病的一種重要類型，也與炎性反應(yīng)關(guān)系緊密。牙周病防治的關(guān)鍵在于控制菌斑，而在炎性反應(yīng)急性期抗菌藥物的應(yīng)用不容忽視。可見“上火”患者的一些臨床表現(xiàn)是由于抗炎與抑炎的平衡被破壞，過度免疫反應(yīng)導(dǎo)致組織的破壞而引起的。

3.3 激活素A、E選擇素與“上火”的關(guān)系 細胞因子參與介導(dǎo)和調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)細胞生長分化、參與炎性反應(yīng)發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等，其表達異?？墒箼C體免疫調(diào)節(jié)紊亂產(chǎn)生疾病，許多難治性疾病都與機體細胞因子功能紊亂有關(guān)[7-8]。前期“上火”的免疫調(diào)節(jié)通路變化研究中，利用基因芯片技術(shù)對造模后的大鼠血清細胞因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)27個細胞因子2倍上調(diào)，1個細胞因子顯著下調(diào)。而對6例“上火”患者血清進行芯片分析，下調(diào)的細胞因子有10種，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的細胞因子有23種，其中激活素A和E選擇素升高明顯?？梢姟吧匣稹钡陌l(fā)生與細胞因子功能紊亂密切相關(guān)。激活素A(Activin A)又稱免疫抑制因子P，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員[9]。在骨髓、脾臟、肝臟、血管內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種組織中均有發(fā)現(xiàn)，具有多種生物學(xué)作用。如參與初期胚胎形成，誘導(dǎo)造血干細胞增殖和分化、抑制活化巨噬細胞活性等[10]。此外激活素A還對組織修復(fù)，炎性反應(yīng)恢復(fù)和組織再生、分化有著重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)激活素A在體內(nèi)外均能刺激小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β及IL-6分泌，還能增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬和吞飲功能。多項實驗均顯示炎性反應(yīng)、機體急性期反應(yīng)與激活素A有關(guān)[14-15]。可見在機體急性反應(yīng)期或炎性反應(yīng)早期，激活素A參與早期天然免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)過程，通過影響炎性反應(yīng)介質(zhì)的作用而調(diào)節(jié)機體的免疫功能，進而影響機體的生理平衡。

E選擇素(E-selectin)屬于選擇素家族，是一類異親型結(jié)合、Ca2+依賴的I型單鏈跨膜糖蛋白細胞黏附分子[16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)選擇素的主要作用是在炎性反應(yīng)發(fā)生時介導(dǎo)白細胞與血管內(nèi)皮細胞的識別及起始黏附，參與白細胞越過血管進入炎區(qū)組織。還有研究[18]證實在感染及炎性反應(yīng)發(fā)生的過程中，E選擇素通過與其相應(yīng)的配體相結(jié)合后介導(dǎo)白細胞與血管壁接觸，使白細胞在血管壁上緩慢滾動，即而啟動一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致白細胞在炎性反應(yīng)區(qū)內(nèi)集中。

激活素A和E-選擇素作為2種重要的細胞因子，在維持機體正常免疫功能和生理平衡舉足輕重的作用。有研究[19]發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠影響細胞黏附分子的表達是顯著延長心臟移植存活時間的作用機制之一。并且炎性反應(yīng)組織釋放的白細胞介素、腫瘤壞死因子及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等細胞因子可活化血管內(nèi)皮細胞上的E選擇素，促進其合成分泌而發(fā)揮作用。從TGF-β與細胞黏附分子在炎性反應(yīng)中的相互作用，可見作為TGF-β超家族中的重要成員激活素可在一定條件下影響炎性反應(yīng)介質(zhì)的作用或者本身作為一種炎性反應(yīng)介質(zhì)活化血管內(nèi)皮細胞刺激E選擇素的分泌與合成，進而共同影響機體生理平衡，產(chǎn)生“上火”這類局部炎性反應(yīng)。故本研究在前期基因芯片技術(shù)研究的基礎(chǔ)上篩選出激活素A和E選擇素作為研究對象，進一步探討2者在“上火”疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，以及2者的相互作用關(guān)系。本次研究的結(jié)果也說明激活素A和E選擇素在誘導(dǎo)“上火”局部炎性反應(yīng)中起到了一定作用。

綜上所述，“上火”患者血清中激活素A和E選擇素的水平均較正常人群有所升高，同時外周血單核細胞中激活素A和E選擇素的基因表達水平也較正常人群有所升高。說明機體內(nèi)環(huán)境在多種因素的作用下激活素A水平升高，影響炎性反應(yīng)介質(zhì)的作用或者本身作為一種炎性反應(yīng)介質(zhì)活化血管內(nèi)皮細胞刺激E選擇素的分泌與合成，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)影響機體生理平衡，從而引發(fā)“上火”。

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ResearchontheDifferentialExpressionofActivinAandE-selectininthePopulationofExcessiveInternalHeat

Wang Qinjing1, Xu Li2, Bao Jie2, Ji Jinjun2, Xie Guanqun2, Fan Yongsheng2

(1AffiliatedJiangnanHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou311200,China; 2CollegeofBasicMedicine,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Objective:To study of activin A and E selectin in the pathogenesis of “shanghuo” people and influence effect through the determination of serum content and the level of gene expression in peripheral blood mononuclear cells of activin A or E-selectin who suffered from excessive internal heat.MethodsClinical lit crowd and gentleness in blood samples was collected and serum and peripheral blood mononuclear cells from blood samples was extracted. By enzyme-linked immune sorbent adsorption assay, the content of serum activin A and E-selectin were determined, and RT-PCR detection was sued to detect gene expression level of activin A and E-selectin.ResultsThe level of activin A and E-selectin in serum of patients with excessive internal heat was higher than that of normal and healthy people. The level of activin A and E-selectin gene expression in peripheral blood mononuclear cells of patients with internal heat was higher than that of normal and healthy people. The gene expression level of activin A and E-selectin in peripheral blood was higher than that of yin deficiency and heat syndrome.ConclusionShanghuo is a local inflammation. Under stress, activin A levels are elevated, effecting inflammatory mediators or itself as a mediator of inflammation activated vascular endothelial cells stimulate E-selectin secretion and synthesis, induced inflammatory reaction and to cause the disorder of lipid metabolism in the body′s physiological balance, causing Shanghuo.

Shanghuo; Activin A; E selectin; Inflammatory reaction

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.005

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2014CB543001，2014CB543002)；國家自然科學(xué)

基金項目(81673857)

汪琴靜(1988.07—)，女，碩士，中醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治風(fēng)濕自身免疫病，E-mail:775161528@qq.com

范永升(1955.11—)，男，博士，教授，國家重點學(xué)科帶頭人，研究方向：中醫(yī)藥防治風(fēng)濕自身免疫病，E-mail:fyszjtcm@163.com

(2017-11-03收稿 責(zé)任編輯：張文婷)