基于向量-子空間夾角判據(jù)分析飲料中的咖啡因

忻欣，劉柳，韓瑩，徐傳杰，粟暉，姚志湘

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；3.廣西壯族自治區(qū)計量檢測研究院，廣西南寧530007）

基于向量-子空間夾角判據(jù)分析飲料中的咖啡因

忻欣1，劉柳2，*，韓瑩1，徐傳杰3，粟暉2，姚志湘2

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；3.廣西壯族自治區(qū)計量檢測研究院，廣西南寧530007）

基于"向量-子空間夾角"判據(jù)，建立了飲料中咖啡因的快速分析方法。通過色譜-光譜聯(lián)用采集功能飲料和碳酸飲料的紫外多波長光譜三維數(shù)據(jù)，構(gòu)建不含被測組分咖啡因的功能飲料和可樂三維本底光譜數(shù)據(jù)庫，基于向量-空間夾角法步驟測定了批量飲料樣本中咖啡因含量。結(jié)果表明：該方法計算結(jié)果和高效液相色譜分析結(jié)果接近，相對誤差小于4.0%，市售樣品加標(biāo)回收率在96.7%～106.0%，RSD值小于2.0%。分析模型建立后，只需采集飲料的紫外光譜即可完成分析。建立的方法快速、準(zhǔn)確，可為飲料的現(xiàn)場分析提供可行方案。

向量-子空間夾角；判據(jù)；咖啡因；飲料

咖啡因（C8H10N4O2）是一種黃嘌呤生物堿化合物，具有擴(kuò)張血管，興奮中樞神經(jīng)等功能?？Х纫虮粡V泛添加到功能型飲料和可樂型飲料中，其含量是衡量飲料品質(zhì)的重要指標(biāo)。

咖啡因的分析檢測，通常采用的有紫外分光光度法[1]、高效液相色譜法[2-3]、近紅外光譜法[4]和拉曼光譜法[5]等。高效液相色譜法具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點，但存在分離時間長，大批量樣本的分析效率低、操作強(qiáng)度大、試劑損耗大，分析成本高，紫外光譜法對于多組分同時有紫外響應(yīng)的體系難以準(zhǔn)確定量分析，近紅外光譜分析需要進(jìn)行大量模型建立工作，因此有必要研究一種快速簡便的分析方法。近年來分析化學(xué)已經(jīng)不再是依賴物質(zhì)消耗手段來獲取信息，而是逐步發(fā)展成為化學(xué)信息科學(xué)[6]。目前的化學(xué)計量學(xué)研究對穩(wěn)健性的關(guān)注主要在于樣本數(shù)據(jù)的多態(tài)和異常值（multimodality，outliers）[7]，建模樣本直接關(guān)系到模型的穩(wěn)健性，即使是相同體系，在很多情況下模型對數(shù)據(jù)變化敏感，也就是說，穩(wěn)健性仍然是一個關(guān)鍵問題[8]。

姚志湘等提出基于體系對應(yīng)的子空間判斷比基于樣本的矩陣特征判斷具有更好的穩(wěn)健性。當(dāng)被測組分存在于體系時，該組分向量與體系子空間的夾角為零，反之夾角存在，向量-子空間夾角是一個子空間判斷依據(jù)?；谠撆袚?jù)，提出了一種混合一維譜的定量方法，在化妝品中對羥基苯甲酸酯[9-10]、醬油中山梨酸鉀[11]以及果凍中的色素和防腐劑[12]等測定中應(yīng)用，分析速度快，測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度滿足定量分析要求。方法不需要嚴(yán)格的秩估計，對樣本背景波動不敏感，具有較好的穩(wěn)健性。

本文首先構(gòu)建咖啡因標(biāo)準(zhǔn)紫外光譜數(shù)據(jù)庫和飲料紫外光譜數(shù)據(jù)，然后通過對市售不同功能性飲料進(jìn)行一次高效液相色譜-光譜儀聯(lián)用，采集各樣品經(jīng)色譜分離后的三維紫外光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)處理獲得不含被測組分咖啡因的本底光譜數(shù)據(jù)陣列，結(jié)合空間夾角判據(jù)算法（簡稱VS法）可實現(xiàn)直接分析待測樣本中咖啡因含量。

1 儀器與試劑

2 實驗部分

2.1 建立咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)光譜庫（v）

分別精確稱取0.020 0 g咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容。分別稀配制成系列濃度為 4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/mL 的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液B1-B9，并采集多波長紫外光譜，經(jīng)最小二乘回歸得到標(biāo)準(zhǔn)光譜庫v。

2.2 建立功能飲料、可樂樣本的光譜數(shù)據(jù)（a）

分別取市售可樂樣品1和可樂樣品2超聲20分鐘脫氣后，用二次蒸餾水稀釋10倍，得到待測（可樂）樣本S1和S2，另取功能性飲料用二次蒸餾水稀釋20倍得到S3。用紫外-可見光纖光譜儀采集200 nm～1 100nm多波長光譜數(shù)據(jù)，即獲得樣本光譜數(shù)據(jù)a1-a3。

2.3 建立飲料本底光譜數(shù)據(jù)庫（N）

對待測樣品S1-S3和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品B5，通過液相色譜與光譜儀聯(lián)用，采集各樣本經(jīng)過色譜柱完全分離后的多波長光譜數(shù)據(jù)。從待測樣品光譜數(shù)據(jù)中扣除待測組分咖啡因的光譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)數(shù)據(jù)降維[5]，得到本底光譜數(shù)據(jù)庫N。

液相色譜條件：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；270 nm；

流動相為

0.01min～13.00min，乙腈：0.02mol/LH3PO4-NaH2PO4（pH：2.6）=15 ∶85（體積比）；13.01min～25.00min，乙腈：0.02 mol/L CH3COONH4（pH：6.5）=15∶85（體積比）；25.01min～45.00min，乙腈：0.02 mol/L H3PO4-NaH2PO4（pH：2.6）=35∶65（體積比）；45.01min～60.00min，乙腈：0.02mol/L CH3COONH4（pH：6.5）=40∶60（體積比）。

婦科共有30名護(hù)理人員,護(hù)理人員均為女性,年齡范圍20~35歲,平均(27.5±5.4)歲,工作時間1~14年,平均(7.5±1.9)年,學(xué)歷在本科以上20人(66.6%)、專科5人(16.7%)、中專5人(16.7%),其中副主任護(hù)師3人,護(hù)士主管10人,護(hù)師及護(hù)士共17人。

柱溫：30 ℃；流速 1mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

紫外-可見光纖光譜儀光譜條件：流動比色皿（1 cm）；積分時間：15微秒；積分次數(shù)：20次；紫外檢測波長：200 nm～400 nm。

2.4 待測樣本中咖啡因含量測定

將上述標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫v，本底光譜數(shù)據(jù)庫N以及a導(dǎo)入計算平臺，選取200 nm～400 nm波長段，應(yīng)用向量-子空間夾角判據(jù)算法分別計算各待測樣本中咖啡因的含量。

2.5 加標(biāo)回收率試驗

將功能飲料樣品稀釋20倍，將可樂樣品稀釋10倍后，分別加入一定量的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，測定其多波長紫外光譜數(shù)據(jù)，采用向量-子空間夾角判據(jù)計算樣品加標(biāo)回收率。

2.6 精密度試驗

取稀釋后的功能飲料和可樂樣品，在紫外-可見光纖光譜儀上檢測重復(fù)測定3次，記錄紫外-可見光譜數(shù)據(jù)，用向量-子空間法進(jìn)行計算，檢驗方法的精密度。

3 結(jié)果與討論

3.1 建立咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)光譜庫

選擇220 nm～350 nm波長范圍光譜，對系列濃度為4μg/mL～20μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紫外光譜進(jìn)行多變量最小二乘回歸（Multivariate least-squares regression），得到咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線，記為V。其中在270 nm處的線性方程、相關(guān)系數(shù)為：y=0.051 5x+0.030 3；r=0.999 1。

3.2 本底數(shù)據(jù)庫的建立

圖1、2、3分別為咖啡因?qū)φ掌?、功能飲料樣本和可樂樣?樣本在270 nm處的高效液相色譜圖。經(jīng)分析對比，圖2、3中A為咖啡因，其他的色譜峰為樣本中相對于咖啡因的本底物質(zhì)。依次從各飲料樣本的數(shù)據(jù)中扣除與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物具有相同保留時間的光譜數(shù)據(jù)后，將其余數(shù)據(jù)存入光譜數(shù)據(jù)庫中構(gòu)成數(shù)據(jù)庫M。

圖1 咖啡因?qū)φ掌吩?70 nm處的高效液相色譜圖Fig.1 Caffeine reference substance at 270 nm of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

圖2 功能飲料樣本的高效液相色譜圖Fig.2 Red bull samples of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

圖3 可樂樣本的高效液相色譜圖Fig.3 Coke samples of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

液相-光譜聯(lián)用獲取的初始本底光譜數(shù)據(jù)M數(shù)據(jù)量大，若直接采用，運算時間長，影響了方法的時效性，因此需要對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維以去除數(shù)據(jù)中的噪聲和冗余的維數(shù)，保留效性數(shù)據(jù)、并能夠提高算法的處理速度。以某品牌功能飲料飲料為例，選用主成分分析[13-14]的方法判斷體系主成份為5，如圖4所示。

圖4 二階差分序列變化圖Fig.4 Change of second difference successive value

應(yīng)用[U，S，V]=svd（M）[6]對 M 進(jìn)行奇異值分解降維，取降解后U矩陣的前5列，即為降維后的本地數(shù)據(jù)庫N。

3.3 樣品中咖啡因含量的測定

分別將本底光譜數(shù)據(jù)庫N、標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫v以及待測樣本a1、a2、a3導(dǎo)入計算平臺，應(yīng)用向量-子空間夾角判據(jù)算法計算功能飲料樣本和可樂樣本中咖啡因含量，結(jié)果見表1。

表1 兩種方法測定市售飲料中咖啡因的含量Table 1 Two methods of determination of caffeine content in commercially available in drinks

續(xù)表1 兩種方法測定市售飲料中咖啡因的含量Continue table 1 Two methods of determination of caffeine content in commercially available in drinks

以功能飲料稀釋20倍后的樣品為例說明含量測定的計算過程。

（1）精度設(shè)定扣減步長Δ=1 000；

（2）在算式y(tǒng)i=aix+bi中代入較大的x1值，得到v1，所述的yi表示在i波長下咖啡因的吸光度值，ai、bi是常數(shù)，x表示咖啡因的濃度，v1表示在濃度為x1時咖啡因的多波長吸光度值y1，v1為所有的yi值組成的矩陣；

（3）從功能飲料樣本光譜數(shù)據(jù)a1中扣除v1/Δ，扣除后的變量記為da1；把本底光譜數(shù)據(jù)庫N和變量da1合并后記為對比空間M，計算對比空間M與v1夾角；

（4）從功能飲料樣本光譜數(shù)據(jù)a中逐步扣除v1后，重復(fù)步驟（3）；

（5）當(dāng)功能飲料樣品中的咖啡因完全被扣除后比對空間M和咖啡因的光譜向量v，空間夾角值會出現(xiàn)最大值θmax，記錄空間夾角最大值θmax出現(xiàn)時對應(yīng)的扣減步數(shù)λ（參見圖5出現(xiàn)最大夾角是的扣減步數(shù)為959），這時通過咖啡因的濃度x1和扣減步數(shù)λ，計算飲料樣本中咖啡因的含量y1=19.3×959/1 000，得到Y(jié)1即為待測飲料樣品中咖啡因的含量值18.5μg/mL。

圖5 功能飲料樣本空間夾角值與扣減次數(shù)之間的曲線圖Fig.5 Red bull vitamin drinks sample space angle values and curve between the numbers of deduction

從表1可知，采用向量-子空間夾角判據(jù)測定計算功能飲料、可樂樣品1、可樂樣品2中咖啡因含量，與高效液相色譜測定結(jié)果對比，相對誤差基本小于±4%，說明向量-子空間夾角判據(jù)方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

3.4 精密度試驗結(jié)果

分別對功能飲料、可樂樣品1、可樂樣品2樣本連續(xù)采集5次多波長光譜數(shù)據(jù)，按向量-子空間夾角判據(jù)進(jìn)行計算，5次測定樣品含量的平均值（C5）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表2所示。試驗結(jié)果表明相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2%，方法精密度好。

3.5 咖啡因本底加標(biāo)樣品的測定

在已知濃度的紅牛維生素飲料和可樂飲料中，添加一定量的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，選擇210 nm～370 nm的紫外光譜進(jìn)行空間夾角法進(jìn)行運算，回收率為96.7%～106.0%，如表3所示，證明方法準(zhǔn)確可靠。

表2 樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Relative standard deviation of samples（n=5）

表3 加標(biāo)回收率Table 3 The recoveries of standard caffeine

4 結(jié)論

建立的飲料中咖啡因的快速分析方法滿足定量分析需求，樣品不需要復(fù)雜的前處理，對于同類飲料的測定，一次建庫后無須再采用儀器聯(lián)用進(jìn)行本底光譜累積，即可對樣品混合光譜中的待測組分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確定量。方法具有操作簡便，試劑消耗量小的特點。

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Determination of Caffeine in Drinks Based on Vector-subspace Angle Criterion

XIN Xin1，LIU Liu2，*，HAN Ying1，XU Chuan-jie3，SU Hui2，YAO Zhi-xiang2
（1.CSEPAT（Beijing）Technology Co.，Ltd.，Beijing 100029，China；2.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Metrology&Test，Nanning 530007，Guangxi，China）

According to Vector-subspace （VS）angle criterion，a new method of quick caffeine-analyzing in drinks is created.Using chromatography-mass spectrum analysis to collect UV multi-wavelength spectral databases of common functional drink and Cola，the background databases of functional drink and Cola without tested Caffeine were established，then Caffeine in Red Bulk and Cola was determinate based on Vector-subspace Angle Criterion.The results presented that analysis results were similar to that of High performance liquid chromatography（HPLC），the relative errors were less than 4.0%，the recoveries of standard caffeine which was added in Red bulk drink and Cola samples were in the range of 96.7%-106.0%and the relative stand deviation was less than 2.0%.After the background databases were established，the analysis could be achieved by only collecting the drinks'UV wavelength spectral.The method is rapid and accurate，which could provide the feasible solution to drinks'scene analysis.

vector-subspace；criterion；caffeine；HPLC；drink

忻欣，劉柳，韓瑩，等.基于向量-子空間夾角判據(jù)分析飲料中的咖啡因[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：126-130

XIN Xin，LIU Liu，HAN Ying，et al.Determination of Caffeine in Drinks Based on Vector-subspace Angle Criterion[J].Food Research and Development，2018，39（1）：126-130

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.025

廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科AB16380348）；柳州市計劃項目（2015J030201）

忻欣（1983—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通信作者：劉柳（1979—），女（漢），高級實驗師，碩士，研究方向：過程分析技術(shù)。

2017-06-11