熒光法測定蒲公英中總黃酮的含量

高生平，吳曉紅，張雅欣，張玉婷

（1.南京工業(yè)大學(xué)浦江學(xué)院，江蘇南京211134；2.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京211168）

熒光法測定蒲公英中總黃酮的含量

高生平1，吳曉紅2，張雅欣1，張玉婷1

（1.南京工業(yè)大學(xué)浦江學(xué)院，江蘇南京211134；2.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京211168）

根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，建立一種測定蒲公英中總黃酮的新方法。用60%乙醇加熱回流提取蒲公英有效成分，以蘆丁為標(biāo)樣，選擇激發(fā)波長419 nm，發(fā)射波長506 nm，采用熒光法測定蒲公英中總黃酮含量，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法檢出限低，回收率在90%～104%之間，線性回歸方程為y=179.69x+145.13，相關(guān)系數(shù) R2為 0.995 1。

熒光法；蒲公英；總黃酮

蒲公英是一種常見的藥食同源植物[1]。蒲公英中 除含有蛋白質(zhì)、微量元素、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)外，還含有多糖、多酚、綠原酸、咖啡酸和黃酮類物質(zhì)等活性成分[2-6]。蒲公英全草具有清熱解毒、利尿、緩瀉等傳統(tǒng)功效[5]，是常用重要中藥之一。最近研究表明，蒲公英還具有抗氧化[7]、抗炎抑菌[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10]等作用，也有研究表明蒲公英的藥用價(jià)值與其所含黃酮類物質(zhì)有著極大的關(guān)系[11]，這引起了人們的關(guān)注。我國資源十分豐富，但其黃酮含量因產(chǎn)地不同而差別較大[12]，因此準(zhǔn)確測定蒲公英中總黃酮含量對蒲公英的開發(fā)利用具有重要意義。

目前植物中總黃酮的測定方法主要是分光光度法[13-14]、薄層色譜法[15]和高效液相色譜法[16]，薄層色譜法常用于定性，高效液相色譜法需要所有黃酮單體的標(biāo)樣才能定量測定總黃酮含量，成本高且難度大。分光光度法因其不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，且所需試劑便宜易得，故常被用于測定植物中的總黃酮含量。但現(xiàn)有研究[17-18]顯示，用硝酸鋁分光光度法測定總黃酮時(shí)，植物中綠原酸的存在可能對結(jié)果有干擾，因鄰二酚類結(jié)構(gòu)與Al3+形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，并使測定的總黃酮含量偏高。本文根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物的特性，采用熒光分析法測定了蒲公英中的總黃酮含量，并考察了綠原酸對測定結(jié)果的影響，旨在準(zhǔn)確測定蒲公英中總黃酮含量，為鑒定其質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

F-280型熒光分光光度計(jì)：天津港東科技發(fā)展股份有限公司；TGL-16型高速臺式離心機(jī)：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；KQ-50B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA2004電子天平：上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品（≥98%）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對照品（≥98%）、硝酸鋁、乙酸鈉、無水乙酸、無水乙醇：分析純試劑；蒲公英：自采低溫烘干后粉碎備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg于100mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解定容，濃度為200μg/mL，準(zhǔn)確吸取此溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 分別置于 10mL 容量瓶中，加入5%的Al（NO3）3溶液1.0mL，pH=6.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液3.0mL。用60%乙醇定容，搖勻，即配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

蒲公英洗凈，自然風(fēng)干后在烘箱中60℃烘12 h，粉碎機(jī)將其粉碎至粉狀，置于密封袋中備用。分別按以下3種方式處理。

1）靜置浸提：準(zhǔn)確稱取1 g蒲公英于錐形瓶中，加入100mL 60%乙醇，保鮮膜密封24 h，離心8min取上清液。

2）超聲浸提：準(zhǔn)確稱取1 g蒲公英于錐形瓶中，加入100mL 60%乙醇，60℃保鮮膜密封超聲2 h，離心取上清液。

3）索式提?。簻?zhǔn)確稱取1 g蒲公英于濾紙中，用細(xì)線包扎好塞進(jìn)抽提筒中，加入100mL 60%乙醇，使樣品完全浸沒在乙醇中，連接好抽提各部分，接通冷凝水，溫度達(dá)到60℃時(shí)開始計(jì)時(shí)提取4 h，離心取上清液。

1.3.3 總黃酮含量測定

考慮到試驗(yàn)條件對測定結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)行了緩沖溶液pH值、乙醇濃度、5%Al（NO3）3溶液加入量、靜置時(shí)間幾個(gè)單因素試驗(yàn)，選擇最佳試驗(yàn)條件測定總黃酮含量。

準(zhǔn)確移取一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL的容量瓶中，加入5%Al（NO3）3溶液1.0mL、pH 6.3 HAc-NaAc緩沖溶液3.0mL，以60%的乙醇定容搖勻，靜置10min后，選擇419 nm作為激發(fā)波長，測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的熒光光譜，以506 nm處熒光強(qiáng)度對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的研究

2.1.1 測定波長的確定

按試驗(yàn)方法配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，用熒光分光光度計(jì)測定其熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為20 nm，掃描速度為240 nm/min，所得激發(fā)光譜如圖1，發(fā)射光譜如圖2，可見最大激發(fā)波長與最大發(fā)射波長分別為419 nm和506 nm，故以此作為測定波長。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的激發(fā)光譜Fig.1 Excitation spectra of rutin standard solution

2.1.2 溶液pH值的影響

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)射光譜Fig.2 Emission spectra of rutin standard solution

不同酸度溶液對黃酮類化合物與鋁離子生成配合物的穩(wěn)定性以及熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響。在6個(gè)10mL容量瓶中，按照試驗(yàn)方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用pH值分別為 3.6、3.9、4.7、4.9、5.5、6.3、6.6 的 HAc-NaAc 緩沖液，并進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。如圖3所示，pH值對熒光強(qiáng)度的影響很大且隨著pH值的增加，熒光強(qiáng)度也一直在增大，pH=6.3時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到頂點(diǎn)，pH=6.6時(shí)測定溶液中有沉淀出現(xiàn)，熒光強(qiáng)度降低，原因可能是黃酮類化合物在偏中性環(huán)境中與鈉鹽生成了螯合物，故試驗(yàn)中選擇pH 6.3作為測定溶液的酸度。

圖3 溶液pH值對熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect on fluorescence intensity of pH

2.1.3 溶劑濃度的影響

選擇了提取黃酮常用的乙醇作為溶劑，主要考察乙醇和水的混合比例對體系熒光強(qiáng)度的影響。在7個(gè)10mL容量瓶中，按照試驗(yàn)方法，分別用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液定容，測定其熒光強(qiáng)度值，測定結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)對蘆丁熒光強(qiáng)度影響非常大，熒光強(qiáng)度隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而變大?？紤]到乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，揮發(fā)越嚴(yán)重，試驗(yàn)操作中對測定產(chǎn)生影響也會變大，本試驗(yàn)選擇了60%的乙醇溶液作為溶劑，與文獻(xiàn)[19]一致。

2.1.4 Al（NO3）3加入量的影響

黃酮類化合物與鋁離子可生成穩(wěn)定的熒光配合物，Al（NO3）3的用量可對熒光強(qiáng)度有一定的影響。在7個(gè)10mL容量瓶中，按照試驗(yàn)方法，分別加入5%Al（NO3）3溶液為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，配制溶液后，測定各溶液的熒光強(qiáng)度值，結(jié)果如圖5。

圖5Al（NO3）3加入量對熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect on the fluorescence intensity of adding amount of Al（NO3）3

從圖5可以看出，蘆丁熒光值先隨硝酸鋁增加而增加，超過1.0mL后開始下降，當(dāng)5%Al（NO3）3溶液用量為1.0mL時(shí)熒光強(qiáng)度較大。本試驗(yàn)選擇采用加入5%Al（NO3）3為1.0mL。

2.1.5 靜置時(shí)間的影響

將蘆丁測定溶液靜置于室內(nèi)，并避免陽光直射，在不同時(shí)間測定溶液的熒光強(qiáng)度。由圖6可以看出，在靜置70min內(nèi)熒光強(qiáng)度先變大后變小，但熒光強(qiáng)度變化不大，這說明本試驗(yàn)的溶液比較穩(wěn)定?？紤]到試驗(yàn)一致性，統(tǒng)一選擇熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的時(shí)候即溶液配好10min后進(jìn)行測定。

2.1.6 綠原酸的影響

圖6 靜置時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect on fluorescence intensity of static time

蒲公英提取物中含有綠原酸，綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基，也可與Al3+形成配合物而發(fā)出熒光，從而使黃酮含量測定結(jié)果偏高。為了考察綠原酸對黃酮測定的影響，比較了419 nm作為激發(fā)光時(shí)蘆丁標(biāo)液和樣品溶液的熒光光譜，根據(jù)圖7可以看出樣品與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)射波長只相差2 nm，說明樣品中提取物發(fā)光物質(zhì)與蘆丁標(biāo)液基本一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證綠原酸的干擾情況，在同等條件配制綠原酸溶液，用激發(fā)波長419 nm進(jìn)行熒光掃描，如圖8，可以看出此激發(fā)波長下綠原酸在500 nm之后幾乎沒有熒光，20倍濃度條件下可以忽略綠原酸的干擾。

圖7 蘆丁和樣品的發(fā)射光譜Fig.7 Emission spectras of rutin and sample

圖8 綠原酸標(biāo)液的發(fā)射光譜Fig.8 Emission spectra of chlorogenic acid standard solution

2.2 線性方程與檢出限

試驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)液的熒光強(qiáng)度與濃度在1.3×10-7mol/L～3.3×10-7mol/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=179.69x+145.13，相關(guān)系數(shù)R2為0.9951，式中：y為熒光強(qiáng)度；x為蘆丁的濃度，μg/mL。對空白對照液進(jìn)行11次平行測定，根據(jù)公式C=3S/K（式中：C 為檢出限，mol/L；S為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，mol/L；K為校正曲線斜率）計(jì)算，方法的檢出限為2.4×10-7mol/L。

2.3 樣品測定與回收率

吸取0.5mL提取液在10mL容量瓶中，按照試驗(yàn)方法測定出樣品中總黃酮含量，平行測定5次，測定結(jié)果見表1，說明該測定方法精密度較好，索氏提取法較靜置浸提與超聲提取法提取效果好。

表1 樣品測定結(jié)果（n=5）Table 1 Results of sample detection（n=5）

根據(jù)試驗(yàn)方法處理樣品，加標(biāo)做回收率試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，可見樣品加標(biāo)回收率在90%～104%之間，說明此方法的準(zhǔn)確度較高。

表2 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of sample recovery test

3 結(jié)論與討論

建立了熒光法測定蒲公英中總黃酮含量的方法，分別從測定波長、溶液pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、Al（NO3）3加入量、放置時(shí)間、提取方法等方面考察了測定條件對測定結(jié)果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明采用索式提取法提取黃酮效果較好；溶液酸度pH 6.3，5%Al（NO3）3加入量1.0mL，該測定方法靈敏度較高；20倍濃度綠原酸對測定結(jié)果無影響；蘆丁標(biāo)液的熒光強(qiáng)度與蘆丁濃度（在 1.3×10-7mol/L～3.3×10-7mol/L范圍內(nèi)）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限低。本法靈敏度高，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高，可以作為測定蒲公英中總黃酮含量的參考方法。

黃酮類化合物的溶解度因它的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)的不同而不同[20]，大多數(shù)黃酮易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑，由于乙醇無毒、溶解性好，目前，針對黃酮類化合物的提取一般采用乙醇浸提的方法[21-23]，本試驗(yàn)用60%乙醇作為溶劑，采用靜置浸提、超聲輔助浸提和索氏提取法3種提取方式對照，發(fā)現(xiàn)索氏提取法提取黃酮效果優(yōu)于另外兩種，操作時(shí)注意溫度不能過高，防止黃酮類化合物被破壞。

[1]匡海學(xué).中藥化學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:148-152

[2]劉金娜,賈東升,馬春英,等.蒲公英黃酮及蛋白含量的動態(tài)變化規(guī)律研究[J].食品研究與開發(fā),2014,35(3):1-3

[3]Schütz K,Carle R,Schieber A.Taraxacum—A review on its phytochemical and pharmacological profile[J].Journal of Ethnopharmacology,2006,107(3):313-323

[4]Wolbis M,Krolikowska M．Polyphenolic compounds of dandelion[J].Acta Pol Pharm,1985,42:215-217

[5]趙守訓(xùn),杭秉倩.蒲公英的化學(xué)成分和藥理作用[J]．中國野生植物資源,2001,20(3):1-3

[6]陳娜,王冬雪,王雪娟,等.蒲公英中綠原酸提取及抑菌活性研究[J].海峽藥學(xué),2016(12):16-19

[7]王劍,劉德麗,李峰.近5年蒲公英抑菌抗氧化活性研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)雜志,2015(3):233-235

[8]紀(jì)曉宇,彭苑霞,劉敏,等.蒲公英不同提取物對大腸桿菌體外抑菌活性的作用[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015(1):116-120

[9]王曉丹,夏曉玲,趙玉嬌,等.蒲公英有機(jī)萃取物的抗甲型H1N1流感病毒作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2015(12):1423-1427

[10]熊富良,吳珊珊,李心愿,等.蒲公英抗腫瘤活性的研究進(jìn)展[J].中國藥師,2016(7):1363-1366

[11]孟志云,徐綏緒.蒲公英的化學(xué)與藥理[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1997,14(2):137-143

[12]張?jiān)伱?張淑慧,王朝卿,等.不同產(chǎn)地蒲公英中總黃酮的測定[J].中草藥,2009,40(增刊):169-170

[13]刁海鵬,呂俊杰．蒲公英花中總黃酮含量測定[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,35(2):178-179

[14]趙二勞,史可,郭建紅,等.雙波長分光光度法測定蒲公英中總黃酮[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2015(5):728-730

[15]趙惠茹,蔣禮杰.微乳薄層色譜定性鑒別蒲公英中黃酮類成分的研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2014(3):20-22

[16]趙惠茹,郭婷.反相高效液相色譜法同時(shí)測定蒲公英中槲皮素和木犀草素的含量[J].中國藥師,2014(7):1106-1108

[17]陳從瑾,黃克瀛,李姣娟,等.植物中黃酮含量的光學(xué)測定方法研究進(jìn)展[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2007,24(4):524-530

[18]尉芹,王冬梅,馬希漢,等.杜仲葉總黃酮含量測定方法研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,29(5):121-125

[19]馬登磊,邵建群,何深知,等.熒光分析法測定元寶楓葉中總黃酮含量的研究[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(1):113-117

[20]黃鑫,梁劍平,郝寶成.黃酮類化合物的分子修飾與構(gòu)效關(guān)系的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(11):57-61

[21]陶亮亮,李鵬.超聲輔助提取蒲公英中總黃酮的工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技,2011,47(4):49-51

[22]柴建新,萬茵,付桂明,等.杜仲葉總黃酮含量測定方法優(yōu)化[J].中國食品學(xué)報(bào),2013(4):225-230

[23]李利華.芹菜不同部位總黃酮含量測定及其抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā),2013,34(7):12-15

Determination of Total Flavonoids in Dandelion by Fluorescence Spectrometry

GAO Sheng-ping1，WU Xiao-hong2，ZHANG Ya-xin1，ZHANG Yu-ting1
（1.Nanjing Tech University Pujiang Institute，Nanjing 211134，Jiangsu，China；2.Jiangsu Vocational Institute of Commerce，Nanjing 211168，Jiangsu，China）

On the basis of flavonoids with aluminum ions to form stable fluorescent complexes，a new method for determination of total flavonoids in dandelion was established.Dandelion was heated with 60%ethanol to extract active ingredients.Rutin was selected as standard sample.The excitation wavelength was 419 nm，and the emission wavelength was 506 nm.The total flavonoids in dandelion was determined by fluorescent spectrometry and the recovery experiments were taken.The results showed that the detection limit of this method was low，the recovery was between 90%and 104%.The linear regression equation was y=179.69x+145.13.The correlation coefficient R2was 0.995 1．

fluorescence spectrometry；dandelion；total flavonoids

高生平，吳曉紅，張雅欣，等.熒光法測定蒲公英中總黃酮的含量[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：117-121

GAO Shengping，WU Xiaohong，ZHANG Yaxin，et al.Determination of Total Flavonoids in Dandelion by Fluorescence Spectrometry[J].Food Research and Development，2018，39（1）：117-121

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.023

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目資助（16KJB430019）

高生平（1979—），男（漢），講師，博士，主要從事納米材料合成與食品分析。

2017-05-19