Clusterin、Caspase-3在胃癌中的表達(dá)及其相關(guān)性研究①

李 衛(wèi)，侯 杰，焦成斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

Clusterin、Caspase-3在胃癌中的表達(dá)及其相關(guān)性研究①

李 衛(wèi)，侯 杰，焦成斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過檢測胃癌組織、正常胃黏膜組織中Clusterin及Caspase-3的表達(dá)情況，探討二者與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及二者的相關(guān)性。方法：運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化SP法檢測這兩個蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：免疫組化SP法結(jié)果顯示，在胃癌組織及正常胃黏膜組織中，Clusterin的表達(dá)陽性率分別為78.0%、26.0%，Clusterin在胃癌中高表達(dá)，并顯著高正常胃黏膜的表達(dá)(P<0.05)；Caspase-3的表達(dá)陽性率分別為24.0%、78.0%，Caspase-3在胃癌組織中低表達(dá)，顯著低于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Caspase-3和Clusterin的蛋白表達(dá)與胃癌的組織學(xué)分型、TNM分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胃癌浸潤深度有緊密的聯(lián)系(P<0.05)。Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中Clusterin和Caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：Clusterin和Caspase-3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，可能是胃癌診斷及治療研究的新方向。

Clusterin；Caspase-3；胃癌；免疫組化；蛋白質(zhì)印跡法

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年約有70萬人死于胃癌[1]。有多種因素、基因參與到胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程中，共同調(diào)控胃癌的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制因子在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色。Clusterin是不久前發(fā)現(xiàn)的一種重要的調(diào)控細(xì)胞凋亡的凋亡抑制因子，有報道高表達(dá)的Clusterin能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白以及有絲分裂誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的異常增殖[2]。有大量研究報道Caspase-3可調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的增長，Caspase-3的活化會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[3]。本文通過檢測胃癌組織與正常胃黏膜組織中Clusterin和Caspase-3的蛋白表達(dá)，探究Clusterin蛋白對胃癌的發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控作用以及Clusterin表達(dá)與凋亡相關(guān)因子Caspase-3之間的相關(guān)關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集2014-12～2015-12在我院就診的胃癌患者的胃癌組織50例作為觀察組，取同一患者距腫瘤邊緣10cm以上正常胃黏膜組織50例作為對照組。其中男36例，女14例，年齡21～83歲，平均(56.3±6.1)歲。受試者以及研究是獲得醫(yī)院倫理委員會同意并符合規(guī)定；所有試驗(yàn)均得到受試者知曉并簽署知情同意書。試驗(yàn)用的人體標(biāo)本在采集后1h內(nèi)迅速放入液氮罐中速凍，于-80℃冰箱中保存，另取受試者的腫瘤組織及癌旁組織用于制備石蠟標(biāo)本，待檢。所有病例均按照世界衛(wèi)生組織和研究會制定的胃癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類：其中共有35例乳頭狀腺癌和高中分化腺癌等分化型，15例低分化、未分化腺癌、印戒細(xì)胞癌和黏液癌等未分化型。依據(jù)1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期；TNM分期，其中5例為Ⅰ期，8例Ⅱ期，21例為Ⅲ期，16例為Ⅳ期。所有受試者在手術(shù)前都沒有經(jīng)過放化療，均住院進(jìn)行胃癌根治術(shù)，術(shù)后所有患者以及腫瘤組織都經(jīng)過病理證實(shí)。

1.2 儀器

萊卡倒置熒光顯微鏡(型號DM1L)購自德國萊卡公司；微量離心機(jī)(型號KA-1000)購自上海市安亭科學(xué)儀器廠；冷凍離心機(jī)(型號CS-15R)購自Beckman公司，電子天平(型號BT323S)購自德國賽多利斯有限公司；電泳槽(型號525BR027843)購自美國Bio-Rad公司；半自動生化儀購自東北沃特爾科技有限公司。

1.3 主要試劑

Clusterin 和Caspase-3抗體購自NEO MAEKERS公司。免疫組化試劑盒購于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化染色采用SP法。用1：100稀釋并配置Clusterin和Caspase-3抗體待用，運(yùn)用DAB 試劑來顯色，用蘇木素按照說明書步驟對組織進(jìn)行復(fù)染，設(shè)立陰性對照組，采用PBS作為一抗對照，若細(xì)胞質(zhì)或者胞核中為棕黃色則是陽性細(xì)胞。

Western blot檢測 配置1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)、0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)30%丙烯酰胺溶液、10%過硫酸胺的配制等溶液。從-80℃冰箱中取出待檢的組織，稱重80～100mg的組織，用PBS沖洗，按照Western blot的實(shí)驗(yàn)步驟：將組織研勻，靜置冰上30min后，在4℃、12000 RPM下離心15min，吸取上清，即為蛋白溶液。另取少量蛋白溶液以BCA法進(jìn)行蛋白含量測定，配置電泳膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉液進(jìn)行封閉，一抗孵育，結(jié)合二抗，化學(xué)發(fā)光、顯影和定影，檢測組織中Clusterin和Caspase-3的表達(dá)情況。

1.5 評價標(biāo)準(zhǔn)

采用萊卡倒置熒光顯微鏡觀察切片，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，按染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計分。Clusterin以細(xì)胞膜染棕黃色為陽性，Caspase-3以細(xì)胞核染棕黃色為陽性。具體如下，顯色細(xì)胞數(shù)(染色陽性百分比)：﹤5%為0分；6%～20%為1分；21%～50%為2分；>50%為3分，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用總積分>1，即統(tǒng)計分析的標(biāo)準(zhǔn)為陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖，計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),兩變量之間采用 Spearman行等級相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α= 0. 05。以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 正常胃黏膜組織及胃癌組織中 Clusterin和Caspase-3的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示在胃癌組織區(qū)的Clusterin蛋白呈高表達(dá)，Caspase-3呈低表達(dá)，而正常胃黏膜組織的Clusterin蛋白表達(dá)降低，Caspase-3 呈現(xiàn)一個高表達(dá)狀態(tài)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，在胃癌組織的Clusterin的表達(dá)陽性率是78.0%，正常胃黏膜組織中Clusterin的表達(dá)陽性率為26.0%，Clusterin在胃癌組織中的表達(dá)要顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)；Caspase-3在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為24.0%要顯著低于正常組織中的78.0%的表達(dá)，具有顯著地統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖1～2，表1。

圖1 Western blot檢測組織中Clusterin和Caspase-3的表達(dá)

注：1，2號組織為隨機(jī)抽檢的正常胃黏膜組織，3，4號組織為隨機(jī)抽檢的胃癌組織

圖2 胃組織Clusterin和Caspase-3的免疫組化檢測(免疫熒光染色，400×)

組別Clusterin陽性(%)陰性(%)Caspase-3陽性(%)陰性(%)觀察組39(78．0)11(22．0)12(24．0)38(76．0)對照組13(26．0)37(74．0)39(78．0)11(22)χ2值15．32516．790P<0．05<0．05

2.2 Clusterin和Caspase-3的蛋白表達(dá)與受試者臨床指標(biāo)、一般情況的聯(lián)系

見表2。

本研究發(fā)現(xiàn)，Clusterin蛋白的表達(dá)與受試者腫瘤的浸潤程度、胃癌組織學(xué)分型、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤的大小無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Caspase-3的表達(dá)與受試者胃癌腫瘤浸潤程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期具有一定的相關(guān)性(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤的大小差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 Clusterin和Caspase-3的蛋白表達(dá)與受試者基本情況、疾病因素的聯(lián)系

2.3 Clusterin和Caspase-3在胃癌組織中的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析表明，在胃癌組織中Clusterin和Caspase-3蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 Clusterin和Caspase-3在胃癌組織中的相關(guān)性

3 討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤中的一種，居全世界惡性腫瘤發(fā)病率和癌癥死亡率的第二位[4]。胃癌確診時，很多病人因?yàn)閰^(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或是癌腫直接侵及周圍臟器而不能單純通過手術(shù)切除獲得治愈，而此類病人的預(yù)后很差，亟待進(jìn)一步研究針對不能行外科手術(shù)的病人的治療方案，其中分子靶向藥物成為胃癌治療新的熱點(diǎn)和頗具前景的研究方向。目前的研究表明，胃癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程可能是由幾個關(guān)鍵基因調(diào)控，鑒別這類基因?qū)⒂欣谖覀兞私馕赴┌l(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有利于集中及靶向治療腫瘤[5]。Clusterin是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，有研究發(fā)現(xiàn)其在許多的組織中都有表達(dá)，參與調(diào)控DNA修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最新研究發(fā)現(xiàn)，Clusterin可能具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。本研究結(jié)果顯示，Clusterin蛋白在胃癌組織區(qū)呈高表達(dá)狀態(tài)，其陽性表達(dá)率為78.0%，這提示我們Clusterin蛋白表達(dá)增高會抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)其增殖。進(jìn)一步研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Clusterin的表達(dá)與胃癌腫瘤浸潤深度、組織學(xué)分型程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤TNM分期有關(guān)。這說明 Clusterin在腫瘤發(fā)展過程中扮演著重要的角色，其蛋白表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，我們可以通過檢測Clusterin的蛋白表達(dá)來探究胃癌的發(fā)展及預(yù)后。已有大量研究表明Caspase-3作為細(xì)胞凋亡進(jìn)程中重要的調(diào)控因子參與到腫瘤的發(fā)展過程中。研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3的低表達(dá)會解除對腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，從而加速腫瘤細(xì)胞生長。本文發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Caspase-3的蛋白表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織，這與之前的研究結(jié)果一致[7]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：Caspase-3在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、低分化、浸潤胃黏膜深的胃癌中的陽性表達(dá)率更低，這些研究結(jié)果提示Caspase-3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，或可成為胃癌治療研究的新方向。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌中Clusterin和Caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但在胃癌組織中Clusterin的表達(dá)升高與Caspase-3表達(dá)降低之間是否有聯(lián)系，目前尚未有報道，具體的作用機(jī)制還需通過實(shí)驗(yàn)證明。綜上所述，Clusterin和Caspase-3的表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切，可以通過檢測這兩者在腫瘤組織中的表達(dá)來觀察腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，為藥物的研發(fā)和臨床治療手段提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號：YM2016_013。

李衛(wèi)(1991～) 男，安徽亳州人，在讀碩士研究生。

焦成斌(1965～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:JiaoChengBin@sina.com。

R735.2

A

1008-0104(2017)06-0056-02

2017-02-28)