高效液相色譜法測定高粱紅色素中兩種化合物含量

申科敏， 胡曉琴， 韓 春,*

(1.長治醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 山西 長治 046000；2.長治市食品藥品檢驗(yàn)所， 山西 長治 046000；3.長治學(xué)院 化學(xué)系， 山西 長治 046011)

高效液相色譜法測定高粱紅色素中兩種化合物含量

申科敏1,2， 胡曉琴3， 韓 春3,*

(1.長治醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 山西 長治 046000；2.長治市食品藥品檢驗(yàn)所， 山西 長治 046000；3.長治學(xué)院 化學(xué)系， 山西 長治 046011)

建立了HPLC-雙波長法測定高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素含量的方法。樣品經(jīng)前處理提取溶解后通過高效液相色譜分析，以色譜峰保留時(shí)間和紫外可見光譜進(jìn)行定性。采用C18反相色譜柱，以甲醇為流動(dòng)相A，1%乙酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，選擇486 nm(槲皮素-7-葡萄糖苷)和333 nm(芹菜素)兩處波長同時(shí)檢測，峰面積外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，兩種化合物質(zhì)量濃度在10.2～408.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為2 μg/mL，平均加標(biāo)回收率為97.3 %～102.8 %，RSD為1.6%～3.9%(n=6)。該方法操作簡單，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，能滿足高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素同時(shí)測定的要求。

槲皮素-7-葡萄糖苷； 芹菜素； 高粱紅色素； 高效液相色譜法

高粱紅色素(sorghum pigment)又稱高粱紅、高粱色素等[1]，是從高粱粒和高粱殼中提取的一種天然色素[2-3]，主要成分為芹菜素(apigenin；5,7,4′-三羥基黃酮)和槲皮素-7-葡萄糖苷(quercetin-7-glucoside；3,5,3′,4′-四羥基黃酮-7-葡萄糖苷)[4]。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760—2014)規(guī)定，高粱紅色素可在熟肉制品、果凍、飲料、糕點(diǎn)等各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用[5]。

高粱紅色素作為一種廣泛應(yīng)用在食品生產(chǎn)行業(yè)中的添加劑，目前對高粱紅色素的品質(zhì)性能評(píng)價(jià)主要依據(jù)GB 1886.32—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 高粱紅中的具體質(zhì)量指標(biāo)》[4]。該質(zhì)量指標(biāo)中“色價(jià)”在評(píng)價(jià)高粱紅色素方面更主要是反映產(chǎn)品著色能力的強(qiáng)弱，不能反映該色素本身的主成分含量水平及原料本身的真?zhèn)?，所以，?yīng)引入主成分含量水平的評(píng)價(jià)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)主要集中在高粱紅色素的提取工藝、理化性質(zhì)等方面的研究[6-14]，未見對高粱紅色素組成成分含量測定的報(bào)道。本研究建立了一種HPLC-雙波長法測定高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素兩種成分含量的方法，希望為高粱紅色素主成分的檢測提供科學(xué)參考依據(jù)，改進(jìn)高粱紅色素的評(píng)價(jià)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(含量98%，20 mg/支)、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(含量98%，25 mg/支)，南京景竹生物科技有限公司；高粱紅色素(批號(hào)：20150718、20151021、20151023、20151024)，長治學(xué)院化學(xué)系自制[15]；甲醇(色譜純)，德國Meker公司；無水乙醇(分析純)、冰乙酸(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，洛陽市化學(xué)試劑廠；超純水，自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜儀(配有Waters 2998二極管陣列檢測器(PDA)和Empower色譜工作站)，美國Waters公司。

1.3 色譜條件

色譜柱Shim-pack VP-ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 um)柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；流速1 mL/min；檢測波長：芹菜素(333 nm)、槲皮素-7-葡萄糖苷(486 nm)。流動(dòng)相A為甲醇，B為1%乙酸溶液。梯度洗脫程序0～7 min，60%A；7～9 min，60%～80%A；9～15 min，80%A；15～16 min，80%～60%A；16～26 min，60%A。

1.4 槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)樣溶液和高粱紅色素供試溶液的制備

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品各10.20 mg至10 mL容量瓶中，加乙醇- 鹽酸溶液(pH值3.0)溶解、定容搖勻備用；槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素的質(zhì)量濃度均為1.02 mg/mL。分別量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mL至10.0 mL容量瓶中，用乙醇- 鹽酸溶液(pH值3.0)稀釋至刻度，搖勻，得芹菜素和槲皮素-7-葡萄糖苷混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為：10.2，20.4，51.0，102.0，204.0，408.0 μg/mL，按1.3方法進(jìn)行檢測。

1.4.2高粱紅色素樣品的制備

稱取0.5 g高粱紅色素于三角瓶中，用100 mL乙醇-鹽酸溶液(pH值3.0)于30 ℃超聲10 min后真空抽濾，濾液轉(zhuǎn)移到250 mL的容量瓶中定容，取1 mL過0.45 μm的濾膜于試劑瓶中待HPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1檢測波長的選擇

基于1.3中的色譜條件，采用Waters 2998二極管陣列檢測器(PDA)對槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行200～800 nm全波長掃描，提取兩種物質(zhì)的紫外吸收光譜(見圖1)。圖1顯示，芹菜素在267 nm和333 nm處有吸收峰存在，考慮到333 nm處峰形較寬且規(guī)則，有利于芹菜素液相條件下的檢測，所以擬選擇333 nm作為芹菜素的檢測波長[15]；槲皮素-7-葡萄糖苷在486 nm處有最大吸收峰，擬選擇486 nm作為槲皮素-7-葡萄糖苷的檢測波長。

圖1 芹菜素和槲皮素-7-葡萄糖苷的紫外吸收光譜Fig.1 Spectrogram of UV absorption of apigenin and quercetin-7-glucoside

2.1.2流動(dòng)相的選擇

為選擇較佳檢測條件，本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇與水、甲醇與0.1%乙酸水溶液、甲醇與1%乙酸水溶液、乙腈與1%乙酸水溶液等流動(dòng)相體系對槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素在C18柱上保留行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇與1%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)峰形好，響應(yīng)高；通過1.3梯度洗脫條件，使樣品中指標(biāo)成分獲得了良好的分離度，干擾少，保留時(shí)間相對適中。槲皮素-7-葡萄糖苷的保留時(shí)間為7.3 min，芹菜素的保留時(shí)間為13.1 min，液相色譜見圖2、圖3。

圖2 槲皮素-7-葡萄糖苷HPLCFig.2 HPLC chromatograms of quercetin-7-glucoside

2.2 線性范圍、檢出限及定量限的確定

將1.4.1中系列質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液按1.3中色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/mL)，

圖3 芹菜素HPLCFig.3 HPLC chromatograms of Apigenin

峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸分析；將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋至其響應(yīng)值為噪音的3倍(S/N=3∶1)，所對應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度為檢出限；同時(shí)將加標(biāo)樣品經(jīng)1.4.2中方法前處理，測得響應(yīng)值為噪音的10倍(即S/N=10∶1)，所對應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度為方法定量限?；貧w方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限結(jié)果見表1。由表1可知，該方法線性良好，線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限符合國家標(biāo)準(zhǔn)食品理化檢測要求[16]。

2.3 回收率和精密度分析

表1 槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素回歸方程、檢測限和定量限

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在高粱紅色素樣品(批號(hào)：20150718)中分別加入芹菜素和槲皮素-7-葡萄糖苷各5.00，10.00，100.00 mg/g，按1.4.2進(jìn)行樣品處理，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按1.3進(jìn)行HPLC檢測，測定其回收率，結(jié)果如表2。表2中在3個(gè)不同的水平，槲皮素-7-葡萄糖苷的平均回收率為97.3%～101.5%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為2.1%～3.1%；芹菜素的平均回收率為101.1%～102.8%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為1.6%～3.9%，回收率良好，完全滿足國家標(biāo)準(zhǔn)食品理化檢測要求[16]。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取高粱紅色素同一樣品(批號(hào)：20151021)6份，按1.4.2制備高粱紅色素供試樣品溶液，按1.3色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算芹菜素和槲皮素-7-葡萄糖苷RSD，結(jié)果見表3。表3中，芹菜素和槲皮素-7-葡萄糖苷RSD(n=6)分別為0.87%和0.94%，表明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱量高粱紅色素適量粉末(批號(hào)：20151023)一份，按1.4.2的樣品處理方法制得供試樣品溶液，放置0，2，4，6，8，10 h，按1.3色譜條件分別進(jìn)行測定，記錄峰面積，結(jié)果見表4。由表4可知，芹菜素和槲皮素-7-葡萄糖苷RSD(n=6)分別為0.62%和0.94%，表明該方法處理的樣品溶液在室溫條件下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 實(shí)際樣品測定結(jié)果

采用本方法對長治市周邊所采集的3份高粱自制的高粱紅色素進(jìn)行處理和測定，結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，3個(gè)批次的高粱紅色素樣品中槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素的含量趨于穩(wěn)定，可推測長治地區(qū)生長的高粱制得的高粱紅色素所含兩成分分別在16.4 mg/g和12.7 mg/g左右。

3 結(jié) 論

建立了一種用HPLC測定高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素兩種主成分含量的方法。采用Shim-pack VP-ODS C18色譜柱，以甲醇-1%乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫為30 ℃，槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素檢測波長分別為486 nm和333 nm。結(jié)果表明，槲皮素-7-葡萄糖苷和芹菜素在14 min內(nèi)出峰，與其他雜質(zhì)組分能實(shí)現(xiàn)很好的分離，在質(zhì)量濃度為10.2～408.0 μg/mL時(shí)，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，平均回收率為97.3%～102.8%，RSD為1.6%～3.9%(n=6)，方法檢測限為2.0 μg/mL。

表2 加樣回收率和精密度測定結(jié)果

n=6

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

n=6

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

n=6

表5 3個(gè)批次的高粱紅色素兩成分含量

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SimultaneousDeterminationofTwoComponentsinSorghumPigmentbyHPLC

SHEN Kemin1,2， HU Xiaoqin3， HAN Chun3,*

(1.DepartmentofPublicHealthandPreventiveMedicine,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China; 2.ChangzhiInstituteforFoodandDrugControl,Changzhi046000,China; 3.DepartmentofChemistry,ChangzhiUniversity,Changzhi046011,China)

To determine flavonoid compounds of quercetin-7-glucoside and apigenin in sorghum pigment, the method of HPLC-double wavelength was established. Two components were extracted and disolved after pretreatment and determined by the retention time and UV absorption spectra. Then they were analyzed by HPLC on a C18column and detected at the wavelength of 486 nm and 333 nm for quercetin-7-glucoside and apigenin respectively, with a mobile phase of methanol and 1% acetic acid for gradient elution. The velocity of flow was 1.0 mL/min and the injection volume was 20 μL. The components were quantitatively determined by calculating the peak areas. The results showed that the calibration curve was liner in the range of 10.2-408.0 μg/mL with the correlation coefficients of more than 0.999. The detection limit was 2 μg/mg. The average recoveries ranged from 97.3% to 102.8%, and the relative standard deviations (RSD) were 1.6%-3.9% (n=6). The method showed good repeatability, accuracy, and stability and could be applied in the accurate quantification of two flavonoid components in sorghum pigment.

quercetin-7-glucoside； apigenin； sorghum pigment； HPLC

葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.06.007

2095-6002(2017)06-0042-06

申科敏，胡曉琴，韓春. 高效液相色譜法測定高粱紅色素中兩種化合物含量[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(6):42-47.

SHEN Kemin， HU Xiaoqin， HAN Chun. Simultaneous determination of two components in sorghum pigment by HPLC[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(6):42-47.

TS202.3; TS207.3

A

2017-02-15

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(21402012)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目子項(xiàng)目(GJZXM201605)。

申科敏，男，工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量安全檢測方面的研究；*韓 春，女，副教授，博士，主要從事藥物合成與分析方面的研究，通信作者。