越冬白蠟蟲微生物多樣性分析

孫 濤，王雪慶，趙遵嶺，于淑慧，楊 璞

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650224)

越冬白蠟蟲微生物多樣性分析

孫 濤，王雪慶，趙遵嶺，于淑慧，楊 璞*

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650224)

目的了解白蠟蟲越冬時體內(nèi)微生物的多樣性，比較昆明與長春越冬蟲體內(nèi)微生物種類和數(shù)量的差異，為了解白蠟蟲低溫適應(yīng)機(jī)制提供有用信息。方法采用Miseq高通量測序方法對昆明越冬雌成蟲(KM)和長春越冬雌成蟲(CC)體內(nèi)細(xì)菌16s rRNA及真菌ITS基因進(jìn)行測序，利用Usearch 軟件進(jìn)行細(xì)菌和真菌OTU(Operational Taxonomic Unit)劃分，并利用Mothur軟件對OTU進(jìn)行分類學(xué)分析和多樣性指數(shù)分析。結(jié)果細(xì)菌KM和CC樣品中共得到344個OTU，真菌KM和CC樣品中共得到230個OTU。細(xì)菌共鑒定到15門、137屬，在KM中乳球菌屬占主要比例(29.78%)，而在CC中立克次氏體占主要比例(55.77%)，真菌中共鑒定到6門、83屬，在KM中僅鑒定到41個屬，而CC中鑒定到75個屬，其中線蟲草科無法歸類的屬在2個樣品中均為優(yōu)勢菌群，但CC中含量遠(yuǎn)低于KM。結(jié)論昆明與長春越冬蟲體內(nèi)細(xì)菌及真菌種類和數(shù)量均不相同，與昆明越冬蟲不同，需要應(yīng)對極端低溫的長春越冬蟲體內(nèi)立克次氏體為優(yōu)勢菌群。

白蠟蟲；群落組成；越冬蟲；Miseq測序；立克次氏體

白蠟蟲(EriceruspelaChavannes)是我國傳統(tǒng)的資源昆蟲，其2齡雄幼蟲分泌的白蠟具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、航天等領(lǐng)域[1-2]。白蠟蟲分布廣泛，在我國其自然種群主要分布在18°N到42°N地區(qū)[3]。李健等在最冷月日均最低氣溫-18.0℃的吉林省四平市發(fā)現(xiàn)白蠟蟲依然能夠生長發(fā)育繁衍后代[4]，說明白蠟蟲對極端低溫環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。白蠟蟲以雌成蟲蟲態(tài)越冬，對白蠟蟲越冬過程中生理狀態(tài)等方面的研究將有助于了解其低溫適應(yīng)機(jī)制，并對擴(kuò)大白蠟產(chǎn)區(qū)具有參考意義。

共生微生物在昆蟲生長發(fā)育、繁衍進(jìn)化以及環(huán)境適應(yīng)等方面具有重要作用。例如，在對美洲大蠊(PeriplanetaAmericanaL.)內(nèi)共生菌的研究中發(fā)現(xiàn)其共生菌中含有可抑制病原細(xì)菌生長的共生菌，并且存在著能夠降解多糖的真菌[5]。研究發(fā)現(xiàn)豌豆蚜(AcyrthosiphonpisumHarris)的共生菌布赫納氏菌屬(Buchnera)能夠幫助其抵御極端溫度[6]。研究表明共生真菌也具有抵御極端溫度侵害的作用，如在對德州切葉蟻(AttatexanaBuckley)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，其所攜帶的Attamyces共生菌株能夠幫助切葉蟻抵御低溫侵害提高適應(yīng)性[7]。在對白蠟蟲低溫適應(yīng)機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)長春和昆明越冬蟲在代謝等方面存在很多差異[8-9]，我們推測白蠟蟲內(nèi)共生微生物也可能在越冬以及抵御極端低溫過程中具有重要作用。

本研究將對白蠟蟲越冬蟲態(tài)體內(nèi)共生微生物進(jìn)行16s rRNA和ITS基因高通量測序，研究白蠟蟲越冬過程體內(nèi)微生物多樣性，并將昆明與長春越冬雌成蟲體內(nèi)微生物進(jìn)行比較分析，以了解在極端低溫條件下越冬雌成蟲體內(nèi)微生物種類及數(shù)量的變化，分析微生物和白蠟蟲越冬及抗凍可能的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

所用白蠟蟲分別為昆明和長春越冬雌成蟲。昆明越冬雌成蟲(KM)采自云南昆明(102.73°E；25.04°N)；長春越冬雌成蟲(CC)采自于吉林省長春市(125.32°E；43.90°N)。采集時將白蠟蟲從女貞樹上迅速剝離放入液氮中儲存。

1.2 越冬雌成蟲內(nèi)微生物總DNA提取

按照DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒(QIAGEN, Germany)方法提取越冬雌成蟲內(nèi)微生物總DNA，將提取出的微生物總DNA進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用超微量紫外分光光度計(Thermo, 美國)測定DNA濃度。將抽提后的總DNA置于-20℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增白蠟蟲越冬雌成蟲微生物的16S和ITS基因

以提取的越冬雌成蟲內(nèi)微生物總DNA為模板，使用通用引物338F和806R擴(kuò)增細(xì)菌16s rRNA基因片段[10]，使用通用引物1737 F和2043 R擴(kuò)增真菌ITS基因片段[11]。PCR擴(kuò)增體系如下：總DNA 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、FastPfu Polymerase(TaKaRa, 日本) 0.4 μL以及雙蒸無菌水10.3 μL。擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Axygen DNA膠回收試劑盒(Axygen, 美國)進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物使用QuantiFluorTM-ST定量系統(tǒng)(Promega, 美國)定量，按照上機(jī)測序要求跟據(jù)測序量計算樣本上機(jī)量。

1.4 Miseq測序

首先將“Y”字形接頭連接到片段上，通過磁珠篩選將接頭自連片段剔除，然后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增已加入“Y”字形接頭的目的片段，經(jīng)氫氧化鈉變性后得到單鏈DNA片段上機(jī)測序文庫。使用Illumina MiSeq(Illumina, 美國)測序儀對獲得的上機(jī)測序文庫進(jìn)行測序分析。

1.5 Miseq測序結(jié)果數(shù)據(jù)分析

根據(jù)reads的重疊關(guān)系，使用FLASH軟件(Version 3+；http://gnu.org/licenses/gpl.html)將Miseq雙端測序得到的序列拼接得到一條序列，同時對reads質(zhì)量以及拼接效果進(jìn)行質(zhì)控和有效數(shù)據(jù)的過濾，將接頭和無重復(fù)單序列剔除獲得有效序列。利用Usearch 軟件 (Vsesion 7.1；http://drive5.com/uparse/)在97%相似度水平下對有效序列進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Unit)劃分，并將聚類過程中產(chǎn)生的嵌合體剔除。

根據(jù)OTU劃分結(jié)果，利用RDP Classifier軟件(Version2.2；http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)進(jìn)行分類學(xué)分析，在域、界、門、綱、目、科、屬、種等不同分類階元統(tǒng)計其群落組成。利用Mothur軟件(Version v.1.30.1；http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)進(jìn)行Chao(Chao指數(shù))、Ace(Ace指數(shù))、Shannon(香農(nóng)指數(shù))以及Simpson(辛普森指數(shù))等多樣性指數(shù)分析，其中，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)代表了群落的豐富程度，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表明了群落多樣性，同時辛普森指數(shù)也可以呈現(xiàn)優(yōu)勢種的集中程度。

利用Mothur軟件 (Version v.1.30.1；http://www.mothur.org/wiki) 和R 軟件進(jìn)行稀釋曲線(rarefaction curve)和Shannon-Wiener曲線(Shannon-Wienercurve)分析，其中，稀釋曲線用于比較測序數(shù)量不同的樣本中物種的豐富程度，而Shannon-Wiener曲線則用于反映各樣本在不同測序量時的微生物多樣性。除此之外兩種曲線均被用于說明樣本測序數(shù)量的合理性。

2 結(jié)果

2.1 OTU數(shù)目統(tǒng)計

細(xì)菌16S rRNA：KM內(nèi)共檢測到12 538條reads，CC內(nèi)共檢測到27 575條reads；真菌ITS：KM內(nèi)共檢測到14 483條reads， CC內(nèi)共檢測到21 650條reads。KM和CC兩個樣品細(xì)菌一共檢測到344個OTU：包含KM 177個和CC 167個；真菌共有230個OTU：包含KM 168個和CC 62個。

KM和CC的細(xì)菌、真菌稀釋曲線均趨于平坦(圖1：A，B)，繼續(xù)增加測序量將不會產(chǎn)生更多的OTU，說明數(shù)據(jù)量合理可以用于其他分析。同時，Shannon-Wiener曲線也均趨于平坦(圖1：C，D)，進(jìn)一步說明數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大部分微生物信息。

圖1 KM和CC稀釋曲線及Shannon-Wiener曲線Fig. 1 Rarefaction curve and Shannon-Wiener curve of KM and CCA：細(xì)菌稀釋曲線Rarefaction curve of bacteria；B：真菌稀釋曲線Rarefaction curve of bacteria fungi；C：細(xì)菌Shannon-Wiener曲線Shannon-Wiener curve of bacteria；D：真菌Shannon-Wiener曲線Shannon-Wiener curve of fungi

2.2 昆明長春越冬雌成蟲內(nèi)細(xì)菌種類及變化

基于Miseq測序結(jié)果，在細(xì)菌中共鑒定到15門28綱54目84科137屬。

鑒定到的門水平中主要有：變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，這4個門的總和在KM和CC中分別占98.29%和98.86%，是越冬雌成蟲內(nèi)細(xì)菌的主要成分，其中變形菌門在越冬雌成蟲內(nèi)細(xì)菌中占主要比例。將KM和CC中這4個門所占比例進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，除了變形菌門從41.57%(KM)升高至72.25%(CC)，其它3個門在CC中所占比例均下降(圖2:A)。

在KM中共鑒定到115個屬細(xì)菌，其中乳球菌屬(Lactococcus)占主要比例(29.78%)，其次為假單胞菌屬(Pseudomonas)占15.05%、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)占5.38%、薄層菌屬(Hymenobacter)占5.31%。而在CC中共鑒定到125個屬細(xì)菌，其中立克次氏體(Rickettsia)占主要比例(55.77%)，其次為乳球菌屬(Lactococcus)占17.96%、假單胞菌屬(Pseudomonas)占8.09%。對比KM與CC發(fā)現(xiàn)，占主要比例的菌屬發(fā)生了改變，KM中的大多數(shù)較高豐度的菌屬在CC中所占比例較低(圖2:B)，立克次氏體在KM中僅占0.03%。

2.3 昆明長春越冬雌成蟲內(nèi)真菌種類及變化

基于Miseq測序結(jié)果，在真菌中共鑒定到6門20綱35目46科83屬。

鑒定到的門水平中主要有：子囊菌門、擔(dān)子菌門，這2個門的總和在KM和CC中分別占90.42%和99.37%，其中子囊菌門在越冬雌成蟲內(nèi)真菌中占比最高，為78.45% (圖2:C)。

在KM中僅鑒定到41個屬真菌，其中線蟲草科無法歸類的屬(unclassified Ophiocordycipitaceae)占主要比例(31.06%)，其次為微座孢屬(Microstroma)占13.96%、紅酵母屬(Rhodotorula)占13.14%、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)占10.38%、橫斷孢屬(Strelitziana)占8.45%、枝孢霉屬(Cladosporium)占5.26%。而在CC中共鑒定到75個屬真菌，其中線蟲草科無法歸類的屬(unclassified Ophiocordycipitaceae)占主要比例(14.75%)，其次為枝氯霉屬(Ramichloridium)占15.76%、枝孢霉屬(Cladosporium)占9.11%、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)占9.03%。對比KM與CC發(fā)現(xiàn)，線蟲草科無法歸類的屬、微座孢屬、紅酵母屬等菌屬在CC所占比例低于KM，但CC中枝孢霉屬所占比例高于KM，而且新鑒定到了諸如枝氯霉屬等34個菌屬(圖2：D)。

圖2 KM和CC微生物群落組成 此圖為文章證據(jù)材料，根據(jù)占比多少不同已在文中有說明Fig. 2 Composition of microorganism communities in the KM and CCA：KM和CC細(xì)菌門水平群落組成Composition of bacterial communities at the phylum；B：KM和CC細(xì)菌屬水平群落組成Composition of bacterial communities at the genus；C：KM和CC真菌門水平群落組成Composition of fungal communities at the phylum；D：KM和CC真菌屬水平群落組成Composition of fungal communities at the genus

2.4 昆明長春越冬雌成蟲內(nèi)細(xì)菌和真菌多樣性分析

在兩細(xì)菌樣本中，CC的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均稍高于KM，表明在CC細(xì)菌群落中其群落豐富度相對高于KM；CC的香農(nóng)指數(shù)低于KM，而辛普森指數(shù)高于KM，表明其群落多樣性相對低于KM，辛普森指數(shù)高于KM同時也反映了CC優(yōu)勢種的集中程度要高于KM(表1)。

在兩真菌樣品中，CC的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均高于KM，表明在CC真菌群落中其群落豐富度以及多樣性相對高于KM，而辛普森指數(shù)低于KM，說明CC優(yōu)勢種的集中程度要低于KM(表1)。

表1 KM和CC內(nèi)細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)分析

3 討論

昆蟲在生理上主要是通過調(diào)節(jié)含水量、控制冰核物質(zhì)、改變代謝途徑以及積累抗凍蛋白等耐寒物質(zhì)來提高自身適應(yīng)能力降低低溫傷害[12]。許多研究發(fā)現(xiàn)，微生物在昆蟲適應(yīng)低溫等不良環(huán)境脅迫時起到了重要作用[6-7,12-13]。前期在對白蠟蟲耐寒性的研究中，已經(jīng)鑒定到了抗凍蛋白候選基因并對其中部分基因進(jìn)行了功能驗證[8]。本研究基于Miseq高通量測序技術(shù)對白蠟蟲越冬雌成蟲體內(nèi)微生物進(jìn)行研究。

對比昆明長春白蠟蟲越冬雌成蟲體內(nèi)微生物種類和數(shù)量發(fā)現(xiàn)，無論是細(xì)菌還是真菌都發(fā)生了很大的變化，群落豐富度相對提高，尤其是真菌樣品，研究發(fā)現(xiàn)有34個屬在CC中被鑒定到而KM中沒有。

在昆明長春白蠟蟲越冬雌成蟲體內(nèi)均鑒定到了立克次氏體，并且其在長春樣品CC中所占比例高達(dá)55.77%。立克次氏體能夠廣泛侵染植物、脊椎動物以及無脊椎動物等。立克次氏體在昆蟲營養(yǎng)、對環(huán)境適應(yīng)性等方面起到了一定的積極作用[14]。在Chen等2000年的研究中發(fā)現(xiàn)立克次氏體能夠在不適宜溫度條件下提高豌豆蚜繁殖能力[15]，在對煙粉虱(BemisiatabaciGennadius)中立克次氏體的研究中發(fā)現(xiàn)立克次氏體能夠提高寄主對于極端溫度的耐受能力[16]。在對白蠟蟲立克次氏體的研究中發(fā)現(xiàn) ，自然環(huán)境下并不是所有白蠟蟲都被立克次氏體寄生[17]，但是本研究的樣品KM和CC中均檢測到立克次氏體的存在，而且長春樣品CC中所占比例很高，因此推測可能是和立克次氏體能夠提高寄主對環(huán)境適應(yīng)性的特點(diǎn)有關(guān)。

假單胞菌屬是目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)的具有生物冰核活性的細(xì)菌屬，其可以通過誘導(dǎo)結(jié)冰降低寄主體溫[18]。研究發(fā)現(xiàn)，一些昆蟲能夠在其受到低溫脅迫時將具有生物冰核活性的物質(zhì)排出體外，降低自身過冷卻點(diǎn)，抵御極端低溫的侵害[19]。從昆明長春白蠟蟲越冬雌成蟲體內(nèi)微生物高通量測序結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)相比昆明越冬雌成蟲樣品KM，假單胞菌屬在CC中所占比例降低，可能是白蠟蟲為了適應(yīng)更低的溫度環(huán)境，很可能將這些具有生物冰核活性的假單胞菌從自身排出，以降低過冷卻點(diǎn)。

除了寄主體內(nèi)細(xì)菌具有提高寄主對于不良環(huán)境的耐受能力，有的真菌也具有這種特征[7]。在對松樹蜂(SirexnoctilioFabricius)與其共生真菌關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，其共生真菌能夠協(xié)助松樹蜂卵抵御不良環(huán)境保障其成功孵化[20]?；诒狙芯扛咄繙y序結(jié)果，有34個真菌屬只在CC中出現(xiàn)，可能是受KM和CC所處地理位置以及環(huán)境條件不同影響越冬雌成蟲生理和代謝狀態(tài)改變所致。對于KM和CC內(nèi)真菌的差異是否與極端低溫環(huán)境有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

基于Miseq高通量測序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)長春和昆明越冬雌成蟲體內(nèi)微生物存在顯著差異，在對長春越冬雌成蟲微生物檢測中發(fā)現(xiàn)，有很多能夠協(xié)助昆蟲適應(yīng)不利環(huán)境因素的微生物種群相比昆明樣品變化很大，諸如立克次氏體、假單胞菌屬等。

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MicroorganismDiversityAnalysisofOverwinteringChineseWhiteWaxScaleInsect

SUNTao,WANGXue-qing,ZHAOZun-ling,YUShu-hui,YANGPu

(Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Cultivating and Utilization of Resources Insects of State Forestry Administration, Kunming 650224, Yunnan, China)

ObjectiveThe study aimed to investigate the microorganism diversity and compare the difference of microorganism between overwintering individuals in Kunming and Changchun.MethodThe bacteria 16S rRNA and the fungi internal transcribed space (ITS) of overwintering individuals in Kunming (KM) and Changchun (CC) were sequencing by MiSeq high-throughput sequenced method. The bacterial and fungal Operational Taxonomic Units (OTUs) were obtained by the Usearch software, and the Mothur software was used to calculate and analyze the taxonomy and alpha diversity.ResultAccording to 344 OTUs obtained from KM and CC bacteria samples, 15 phyla and 137 genera were identified. Meanwhile, 6 phyla and 83 genera were identified from 230 OTUs obtained from KM and CC fungi samples. In KM the dominant bacteria,Lactococcusaccounted for 29.78%. And in CCRickettsiawas dominant (55.77%). UnclassifiedOphiocordycipitaceaewas dominant both in KM and CC, but its proportion in CC was much lower than in KM.ConclusionIn this study, lots of differences were found between Kunming and Changchun overwintering individuals on the bacteria and fungi category and quantity. In comparison of KM bacteria sample,Rickettsiabecame the dominant genus in CC.

Ericeruspela; community composition; overwintering individuals; Miseq sequencing;rickettsia

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.018

2016-10-07

國家863計劃2014AA021801，云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項目2013FA052，林業(yè)公益性行業(yè)科研專項201504302、201304808，國家自然科學(xué)基金31572337.

孫 濤(1991—)，男，碩士研究生，主要從事昆蟲分子生物學(xué)研究.

* 通訊作者：楊 璞.

S899.1

A

1001-1498(2017)06-1009-06

張 玲)