黃皮葉中總黃酮的含量測定

沈靜琳

（江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，江西 上饒 334000）

黃皮葉中總黃酮的含量測定

沈靜琳

（江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西 上饒 334000）

目的 確定黃皮葉中總黃酮含量的測定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法 本試驗以蘆丁為標(biāo)樣，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH系統(tǒng)比色法測定黃皮葉中總黃酮的含量，在510 nm波長處測定其吸收度，從而得到待測物質(zhì)的總黃酮含量。結(jié)果 使用該檢測方法，蘆丁在0.008～0.056 mg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.999 1），平均回收率為95.7%，RSD=1.13%（n=6），精密度試驗RSD=0.98%，重復(fù)性試驗RSD=4.98%（n=6），測得3批黃皮葉中的總黃酮含量分別為7.56%，7.65%，7.38%。結(jié)論 該含量測定方法精密度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于黃皮葉的質(zhì)量控制。

黃皮葉；總黃酮；含量測定

黃皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]屬蕓香科，黃皮葉為其干燥葉，味苦性辛涼?！侗静萸笤分杏涊d黃皮葉有“解穢除垢，退黃腫”以及解表散熱、順氣化痰的功效，常用于治療流感、瘧疾、支氣管炎等。近年來有報道稱黃皮葉醇提取物具有保肝、抑菌、抗過敏、抗氧化、抗哮喘及潛在的鎮(zhèn)咳祛痰等作用。有實驗表明黃皮葉水提液中有酚類和黃酮類物質(zhì)，從乙醇提取物中也進(jìn)一步分離鑒定出蘆丁[1]?，F(xiàn)采用優(yōu)化的超聲波法提取工藝對黃皮葉進(jìn)行提取，考察以NaN02-A1（N03）3-NaOH為顯色劑，在堿性條件下于510 nm波長處測量其總黃酮含量的測定方法，以期為進(jìn)一步研究黃皮葉中黃酮的藥理作用及綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UFY-400型400 g搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），JA2003型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HWS24型熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），GZX-9246 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），島津AY12O萬分之一托盤電子分析天平（SHIMADZU），UV1102紫外可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

蘆丁對照品（UV）：成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-12040302。黃皮葉粗粉：采自中山市金鐘水庫，洗凈陰干，粉碎過篩，密封置避光干燥器中保存。

1.3 試劑

無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），亞硝酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠），硝酸鋁（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（粒）（天津市福晨化學(xué)試劑廠），無水三氯化鋁（天津市福晨化學(xué)試劑廠），以上試劑均為分析純。試驗中所用水均為實驗室自制純水和蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃皮葉中總黃酮的含量測定方法學(xué)考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，置50 ml容量瓶中，加入60%的乙醇適量，采用超聲處理使溶解，放冷，加60%的乙醇至刻度，搖勻，即得（每1 ml中含無水蘆丁0.2 mg）。

2.1.2 測定波長的確定 精密量取2 ml蘆丁對照品溶液于25 ml容量瓶中，加水6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加入氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁對照品溶液同上法平行操作的相應(yīng)溶液為空白對照，進(jìn)行240～600 nm全波段掃描。結(jié)果顯示，在510 nm處有最大吸收波長，說明可在510 nm處進(jìn)行含量測定。

2.1.3 線性的測定 精密量取對照品溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml，分別置 25 ml量瓶中，各加水 6 ml，加 5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對照品溶液同上法平行操作的相應(yīng)溶液為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，以吸光值對濃度進(jìn)行線性回歸分析,求得回歸方程，A=10.113C，R2=0.999 1，表明蘆丁對照品溶液濃度在0.008～0.056 mg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗 精密量取蘆丁對照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度，連續(xù)測6次，按吸光度計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為0.002 42，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.98%。

2.1.5 供試品溶液的制備 精密稱取黃皮葉粗粉1.000 g用液液萃取法脫脂后，殘渣加60%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液2.5 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度，分別測定顯色后放置 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min供試品溶液的吸光度，按吸光度算得其在1 h內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為0.009 61，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 2.95%。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取1.000 g同一袋樣品6份，按照“2.1.5”項下方法平行操作制備6份供試品溶液，分別精密吸取6份供試品溶液各3 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度，按吸光度計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為0.016 80，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.98%。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取已知濃度的供試品溶液2.5 ml共6份，分別置25 ml量瓶中，再分別加入3 ml的0.2 mg/ml蘆丁對照品溶液，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率，再計算平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。計算公式：

式中：A為供試品所含被測成分量（mg），B為加入對照品量（mg），C為實測值（mg）。算得平均回收率為 95.7%，RSD為1.13%。表明該含量測定方法的誤差以及操作過程的損失較小，可靠性較高。結(jié)果見表1。

表1 黃皮葉總黃酮加樣回收率試驗測定結(jié)果

以上數(shù)據(jù)表明，采用NaN02-A1（N03）3-NaOH系統(tǒng)比色法測定黃皮葉中總黃酮的含量，精密度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.2 黃皮葉中總黃酮的含量測定

精密稱取1.000 g黃皮葉粗粉3份，液液萃取法脫脂后，殘渣加60%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。精密量取3 ml，置25 ml容量瓶中，加水6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加入氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁對照品溶液同上法平行操作的相應(yīng)溶液為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度，計算供試品中總黃酮的含量（mg/g），再按含量計算均值。計算公式：

式中：C為供試品溶液的總黃酮濃度（mg/ml），V為供試品溶液定容的體積（ml），n為稀釋倍數(shù)，W為稱樣量（g）。算得這批自制黃皮葉粗粉中總黃酮的平均含量為7.53 mg/g。結(jié)果見表2。

表2 黃皮葉中總黃酮含量測定結(jié)果

3 討論

試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)水層揮干后用甲醇難以全部溶解，后改用60%的乙醇轉(zhuǎn)移藥渣至容量瓶，并結(jié)合文獻(xiàn)與藥典重新制作坐標(biāo)曲線，再依法進(jìn)行含量測定方法的方法學(xué)考察。由黃皮葉提取液的理化檢識結(jié)果來看，具有采用此比色法的條件。

方法學(xué)考察結(jié)果也表明該方法測定結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，可初步測定黃皮葉中總黃酮含量。但在回收率試驗中測得回收率偏低，可能是由于供試品溶液中某些化學(xué)成分對檢測產(chǎn)生了干擾，可采用雙波長分光光度法或差示分光光度法對該檢測方法進(jìn)行改進(jìn)[2]。用NaN02-A1（N03）3-NaOH系統(tǒng)比色法測定黃皮葉總黃酮含量，操作簡便，結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠。本試驗對3批自制黃皮葉粗粉中的總黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明其總黃酮含量較高。借鑒已往對黃皮葉黃酮濃度與其抗氧化性間關(guān)系的研究思路，以該批自制黃皮葉粗粉為原料，進(jìn)一步研究黃皮葉中黃酮類化合物的藥理作用[3]，為研究黃皮葉中黃酮的藥理作用、開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。同時，試驗表明黃皮葉中黃酮類化合物極性較大，在提取過程中，應(yīng)盡量避免使用成本較高、毒性較大的有機(jī)溶劑，以減少環(huán)境污染。黃皮在廣東、廣西、云南、四川、海南等地廣泛種植，資源豐富，在食品藥品行業(yè)中有較好的應(yīng)用前景，是一種實用價值很高的植物，值得開發(fā)利用與研究。

[1]趙青，李創(chuàng)軍，楊敬芝．黃皮葉的化學(xué)成分研究[J]．中國中藥雜志，2010，35（8）：997-999．

[2]嚴(yán)贊開．紫外分光光度法測定植物黃酮含量的方法[J]．食品研究與開發(fā)，2007，28（9）：164-167．

[3]張福平，湯艷姬，劉曉珍，等．黃皮葉黃酮類化合物的抗氧化性研究[J]．南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，44（8）：1343-1346．

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1671-1246（2018）01-0098-03