姜黃素預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注損傷大鼠的影響

吳建魏，劉潔，譚利斌，李向宇，葉飛，何強(qiáng)

廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510120

姜黃素預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注損傷大鼠的影響

吳建魏，劉潔，譚利斌，李向宇，葉飛，何強(qiáng)

廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510120

目的：探討姜黃素預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注損傷大鼠的影響。方法：健康成年雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（IR組）、姜黃素低劑量組（C50組） 及姜黃素高劑量組（C200組），每組12只。C50組和C200組分別于麻醉前2 h腹腔一次性注射姜黃素50 mg/kg和200 mg/kg，行夾閉左肺門(mén)60 min再灌注180 min。S組于麻醉前2 h腹腔注射等容量生理鹽水，開(kāi)胸后左肺門(mén)不進(jìn)行夾閉，曠置240 min。IR組于麻醉前2 h腹腔注射等容量生理鹽水，左肺門(mén)夾閉，左肺不張60 min再灌注180 min。于缺血前、再灌注60、120、180 min時(shí)采集右頸動(dòng)脈血行血?dú)夥治觯⒂?jì)算呼吸指數(shù)（RI）。再灌注末處死動(dòng)物，取肺組織，觀察肺組織病理學(xué)變化并行肺損傷評(píng)分，測(cè)定肺濕干重比（W/D），檢測(cè)超氧化物歧化物（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果：與缺血前比較，IR組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著升高（P＜0.05）。與S組比較，IR組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著升高，MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分升高，SOD活性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與IR組比較，C50組和C200組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著降低，MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與C50組比較，C200組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著降低，MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：姜黃素預(yù)處理可減輕肺缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性，其機(jī)制可能與姜黃素減輕肺水腫，減少氧化產(chǎn)物的生成和增強(qiáng)清除氧自由基的能力有關(guān)。

肺缺血再灌注損傷；姜黃素；氧化應(yīng)激；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；大鼠

肺缺血再灌注損傷臨床上常見(jiàn)于肺移植術(shù)、肺栓塞、失血性休克及體外環(huán)循等，其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，目前尚未完全闡明。姜黃素(CUR)是從植物姜黃、莪術(shù)、郁金等中提出的中藥單體，具有廣泛的藥理作用：如抗缺血再灌注、抗炎以及抗氧化等[1]。已證實(shí)姜黃素對(duì)于心、腦、腎、腸等實(shí)質(zhì)臟器的缺血再灌注損傷可通抗氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)參與器官保護(hù)[2～4]。目前姜黃素對(duì)肺保護(hù)方面研究甚少，基于姜黃素以上的藥理作用，也許姜黃素對(duì)肺缺血再灌注損傷也有良好的保護(hù)作用。筆者在肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理對(duì)兔肺缺血再灌注損傷的前期研究中取得良好的效果，也積累了不少的經(jīng)驗(yàn)[5～6]。本研究旨在評(píng)價(jià)中藥單體姜黃素預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注損傷的影響，進(jìn)一步探討姜黃素預(yù)處理肺保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，大鼠飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，合格證號(hào)為：44007200022742。隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、姜黃素低劑量組(C50組)及姜黃素高劑量組(C200組)，每組12只。

1.2 儀器與試劑

動(dòng)物呼吸機(jī)(美國(guó)Surgivet公司)；氣管插管抗感染中心靜脈導(dǎo)管的14號(hào)外套管(Arrow公司)；離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；無(wú)損傷血管夾(上海手術(shù)儀器廠)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Unicam Heliox公司)；姜黃素和戊巴比妥鈉(Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 動(dòng)物模型制備

中的方法并加以改良制備肺缺血再灌注損傷模型[7]。大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，術(shù)前禁食12 h，不禁水。按戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，采用微量注射泵經(jīng)尾靜脈持續(xù)補(bǔ)液2 mL/(kg·h)(按8 mg/mL濃度用林格氏液稀釋戊巴比妥鈉)和維持麻醉。然后備皮，固定大鼠(仰臥位)，氣管內(nèi)插管(14號(hào)靜脈留置針外套管)并固定，接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，潮氣量9～10 mL/kg，吸呼比2∶1，呼吸頻率每分鐘70～80次，吸入空氣。分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈并置管抽血和測(cè)血?dú)狻?dòng)物轉(zhuǎn)為右側(cè)臥位，經(jīng)左側(cè)第5肋間逐層進(jìn)入胸腔，暴露肺部后，鈍性分離左側(cè)肺門(mén)，尾靜脈注射50 U/kg肝素抗凝。姜黃素低劑量組(C50組)和姜黃素高劑量組(C200組)分別于麻醉前2 h腹腔一次性注射姜黃素50 mg/kg和200 mg/kg，行夾閉左肺門(mén)60 min再灌注180 min。假手術(shù)組(S組)于麻醉前2 h腹腔注射等容量(2 mL)生理鹽水，開(kāi)胸后左肺門(mén)不進(jìn)行夾閉，曠置240 min。缺血再灌注組(IR組)于麻醉前2 h腹腔注射等容量(2 mL)生理鹽水，左肺門(mén)夾閉，左肺不張60 min再灌注180 min。缺血期間，切口處覆蓋生理鹽水濕潤(rùn)后的紗布，外用塑料薄膜覆蓋，減少水份蒸發(fā)。應(yīng)用白熾燈泡加熱維持大鼠肛溫于37～38℃。

1.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)測(cè)定

(1)于缺血前、再灌注60、120、180 min時(shí)采集右頸動(dòng)脈血行血?dú)夥治觯⒂?jì)算呼吸指數(shù)(RI)=P(A-a)DO2/PaO2。(2)肺濕干重比(W/D)：于再灌注末放血處死大鼠，移除的左肺被即刻分成3個(gè)部分。左側(cè)肺上1/3用鹽水漂洗，濾紙吸干，稱重為濕重，烘箱內(nèi)70℃烘干24 h至重量不再變化后稱重為干重，計(jì)算W/D。(3)肺組織形態(tài)學(xué)變化：左肺中部(第2部分)2 mm厚組織塊浸在10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，觀察光鏡下肺組織病理學(xué)改變，其病理評(píng)分基于以下變量：肺泡和肺間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及出血，嚴(yán)重程度評(píng)分如下：無(wú)損傷=1分，損傷25%=2分，損傷50%=3分，損傷75%=4分，彌漫性損傷=5分。其它肺組織(第3部分)放入凍存管置液氮罐保存，然后存入-80℃冰箱待用。(4)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)定：取凍存的肺組織，加入生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿，分別采用黃嘌呤氧化酶法與硫代巴比妥酸法測(cè)定SOD的活性和MDA的含量，詳細(xì)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)比較 見(jiàn)圖1。與S組比較，IR組肺泡壁明顯增厚，肺泡、肺間質(zhì)水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞滲出明顯，肺組織損傷明顯；C50組肺組織損傷較IR組減輕，但還有少量細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)和肺泡水腫有所緩解；C200組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，輕度肺間質(zhì)水腫。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)HE染色結(jié)果 (×400)

2.2 各組大鼠血?dú)釶aO2、P（A-a）DO2及RI的變化比較見(jiàn)表1。缺血前各組RI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與缺血前比較，IR組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與S組比較，IR組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與IR組比較，C50組和C200組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C50組比較，C200組再灌注各時(shí)間點(diǎn)RI值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血?dú)釶aO2、P(A-a)DO2及RI的變化比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠血?dú)釶aO2、P(A-a)DO2及RI的變化比較(±s，n=12)

與缺血前比較，①P＜0.05；與S組比較，②P＜0.05；與IR組比較，③P＜0.05；與C50組比較，④P＜0.05

組別 指標(biāo) 缺血前 再灌注(min)S組IR組C50組C200組S組IR組C50組C200組S組IR組C50組C200組PaO2(mmHg)P(A-a)DO2(mmHg)RI 91.83±8.51 89.33±6.77 91.37±8.15 91.67±9.25 15.67±1.05 21.83±4.74 19.33±4.12 19.43±5.31 0.19±0.08 0.25±0.02 0.23±0.08 0.21±0.07 60 89.33±8.12 62.67±12.47①②80.83±15.13③84.83±25.13③④29.33±6.09 49.00±10.48①②39.17±2.54③29.67±3.69③④0.33±0.08 0.85±0.13①②0.58±0.21③0.44±0.11③④120 85.17±7.65 67.33±11.71①②79.27±15.42③83.67±17.91③④25.67±6.31 43.33±10.65①②35.19±5.89③25.17±7.83③④0.31±0.09 0.65±0.12①②0.48±0.08③0.37±0.07③④180 86.33±3.83 69.67±17.80①②81.06±10.36③87.00±20.35③④25.67±4.03 38.00±11.03①②30.04±7.37③26.03±8.33③④0.30±0.05 0.59±0.11①②0.51±0.05③0.41±0.05③④

2．3 各組大鼠肺組織SOD活性、MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分比較 見(jiàn)表2。與S組比較，IR組MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分升高，SOD活性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與IR組比較，C50組和C200組MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C50組比較，C200組MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠肺組織SOD活性、MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分比較(±s，n=12)

表2 各組大鼠肺組織SOD活性、MDA含量、W/D和肺損傷評(píng)分比較(±s，n=12)

組別S組IR組C50組C200組SO D(U/mg)97±6 52±16①81±3②92±9②③M D A(nmol/mg)3.61±0.17 8.84±1.35①5.06±0.36②4.07±0.47②③W/D 2.12±0.36 4.69±1.94①3.05±0.18②2.35±0.32②③肺損傷評(píng)分(分)1.53±0.28 6.71±0.88①3.14±0.22②2.11±0.17②③

與S組比較，①P＜0.05；與IR組比較，②P＜0.05；與C50組比較，③P＜0.05

3 討論

姜黃，始載于《唐本草》，具有破血行氣、通經(jīng)止痛等功效，以姜科植物姜黃的干燥根莖入藥，近年來(lái)研究不僅證明了其傳統(tǒng)的藥效，而且還發(fā)現(xiàn)了一些新的藥理特性，如抗缺血再灌注損傷、抗炎、抗腫瘤、抗HIV、抗纖維化、對(duì)代謝的影響等作用[8]，顯示了其廣闊的應(yīng)用前景。

本研究中，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組再灌注各時(shí)點(diǎn)PaO2明顯降低，P(A-a)DO2升高，RI顯著升高，肺組織損傷評(píng)分和W/D明顯升高，并且出現(xiàn)肺組織水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞滲出明顯；而且在缺血再灌注組中，與缺血前比較，再灌注各時(shí)點(diǎn)PaO2明顯降低，P(A-a)DO2升高，RI顯著升高，表明肺缺血60 min再灌注180 min并發(fā)的肺損傷模型制備成功。本研究結(jié)果顯示，與缺血再灌注組比較，姜黃素高、低劑量組中RI、W/D、肺組織損傷評(píng)分、以及病理形態(tài)改變明顯降低，提示姜黃素預(yù)先給藥可減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性。

氧化應(yīng)激主要以產(chǎn)生活性氧簇(ROS)多少來(lái)反映，正常機(jī)體內(nèi)的ROS的產(chǎn)生與清除趨向平衡[9]。目前已清楚氧化應(yīng)激在缺血再灌注損傷模型中起到關(guān)鍵作用[10]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在大量的抗氧化物質(zhì)，活性氧能得到有效控制，從而保障機(jī)體生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。缺血再灌注損傷中一個(gè)重要的導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的機(jī)制，是次黃嘌呤的產(chǎn)生和低氧狀況下黃嘌呤脫氫酶到黃嘌呤氧化酶的轉(zhuǎn)變，再氧合后，次黃嘌呤降解為超氧化物，在這個(gè)過(guò)程中超氧化物起到了主要作用。SOD活性可以反映清除氧自由基的能力，而MDA是脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物之一，可間接的反映氧自由基的產(chǎn)生情況。本研究中，缺血再灌注組中MDA含量明顯較其他組高，SOD活性反之，提示肺缺血再灌注時(shí)氧自由基產(chǎn)生明顯增加，清除能力顯著降低，而通過(guò)姜黃素預(yù)處理后，機(jī)體的抗氧化能力增強(qiáng)，氧自由基生成也減少。

RI是指肺泡動(dòng)脈氧分壓差與動(dòng)脈氧分壓之比P(A-a)DO2/PaO2，是反映肺的通氣、氧交換功能的一個(gè)簡(jiǎn)單而實(shí)用的指標(biāo)，評(píng)價(jià)機(jī)體氧合好壞優(yōu)于PaO2和PaO2/FiO2。研究認(rèn)為，RI指數(shù)越大，肺的氧合越差，肺氣體交換功能就越差[11]。肺濕干重比(W/D)是反映肺組織的含水量的，可間接的反映肺毛細(xì)血管的通透性。當(dāng)肺缺血再灌注損傷時(shí)，肺毛細(xì)血管膜受損，通透性增加，血管內(nèi)滲出液增多，肺組織水腫，肺的氣體交換功能?chē)?yán)重障礙。結(jié)合肺組織病理學(xué)改變，肺缺血再灌注時(shí)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡、肺間質(zhì)水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞滲出明顯，肺組織損傷明顯。本研究結(jié)果顯示，與缺血再灌注組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組RI、W/D和肺損傷評(píng)分降低。與姜黃素低劑量組比較，姜黃素高劑量組RI、W/D和肺損傷評(píng)分降低，表明姜黃素預(yù)先給藥可減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性，從而實(shí)現(xiàn)肺保護(hù)。

綜上所述，姜黃素預(yù)先給藥可減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性，其機(jī)制可能與姜黃素減輕肺水腫，減少氧化產(chǎn)物的生成和增強(qiáng)清除氧自由基的能力有關(guān)。

［參考文獻(xiàn)］

[1]狄建彬，顧振綸，趙笑東，等．姜黃素的抗氧化和抗炎作用研究進(jìn)展[J]．中草藥，2010，41(5)：854-857．

[2]朱蕾，張麗．姜黃素預(yù)處理對(duì)腸缺血再灌注損傷的作用研究[J]．器管移植，2016，7(1)：39-43．

[3]徐衛(wèi)強(qiáng)，郭園園，關(guān)超，等．姜黃素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠模型保護(hù)作用的研究[J]．蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，41(1)：16-19．

[4]孫彬，李國(guó)明，芮如平，等．姜黃素通過(guò)抑制線粒體凋亡減輕心臟缺血再灌注損傷[J]．臨床心血管病雜志，2016，32(6)：619-623．

[5]吳建魏，耿智隆，劉東，等．肢體缺血預(yù)處理對(duì)兔肺缺血再灌注的影響[J]．中華麻醉學(xué)雜志，2009，29(6)：561-564．

[6]耿智隆，吳建魏，吳芳，等．肢體缺血預(yù)處理對(duì)兔肺組織缺血再灌注后氧自由基及細(xì)胞因子分泌的影響[J]．中華外科雜志，2010，48(13)：1009-1012.

[7]李彧，楊麗霞，李亞?wèn)|，等．姜黃素抗纖維化作用研究進(jìn)展[J]．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(6)：408-411.

[8]Eppinger MJ，Ward PA，Jones ML，et al．Disparate effects of nitric oxide on lung ischemia-reperfusion injury[J]．Ann Thorac Surg，1995，60(5)：1169-1175.

[9]Zeng CC， Lai SH， Yao JH， et al．The induction of apoptosisin HepG-2 cellsby ruthenium(II)complexes through an intrinsic ROS-mediated mitochondrial dysfunction pathway[J]．Eur J Med Chem，2016，122：118-126.

[10]Minutoli L，Puzzolo D，Rinaldi M，et al．ROS-Mediated NLRP3 inflammasome activation in brain， heart， kidney，and testis ischemia/reperfusion injury[J]．Oxid Med Cell Longev，2016：2183026．

[11]Deacutis CF，Murray D，Prell W，et al．Hypoxia in the upper half of narragansett bay，RI，during August 2001 and 2002[J]．Northeast Nat，2016，13(4)：173-198.

Curcumin Pretreatment Has Effect on Rats with Lung Ischemia Reperfusion Injury

WU Jianwei，LIU Jie，TAN Libin，LI Xiangyu，YE Fei，HE Qiang

Objective：To discuss the effect of curcumin pretreatment on rats with lung ischemia reperfusion injury.Methods：Divided 48 healthy adult male SD rats into sham operation group(group S)，ischemia reperfusion group(group IR)，low-concentration curcumin group(group C50)and high-concentration group(group C200)randomly，12 rats in each group.Group C50 and group C200

disposablel abdominal injection of curcumin(50 mg/kg and 200mg/kg respectively)2 h before anesthesia，occluding left pulmonary hilus for 60 min and reperfusing for 180 min.Group S received abdominal injection of equivalent saline 2 h before anesthesia，no occlusion of the left pulmonary hilus after opening chest，and was put aside for 240 min.Group IR received abdominal injection of equivalent saline 2 h before anesthesia，occluding leftpulmonary hilus for 60 min and reperfusing for 180 min.Before ischemia and in the 60th，120th and 180th min of reperfusion，collected the blood of right carotid artery to conduct a blood gas analysis，and calculated the respiratory index(RI).In the end of reperfusion，the rats were sacrificed for collecting the pulmonary tissue.Observed the pathological changes of the pulmonary tissue，measured wet-dry weight ratio(W/D)，detected the content of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA).Results：Comparing with that before ischemia，RI of the group IR in each time point of reperfusion was significantly increased(P＜ 0.05).Comparing with that of group S，RI of the group IR in each time point of reperfusion was significantly increased，the content of MDA，W/D and scores of pulmonary injury were higher，while the activation of SOD was lower，differences being significant(P＜ 0.05).Comparing with that of group IR，RI of the group C50 and group C200 in each time point of reperfusion wassignificantly decreased，the content of MDA，W/D and scores of pulmonary injury were lower，while the activation of SOD washigher，differences being significant(P＜ 0.05).Comparing with that of group C50，RI of the group C200 in each time point of reperfusion was significantly decreased，the concentration of MDA，W/D and scores of pulmonary injury were lower，while the activation of SOD was higher，differences being significant(P＜ 0.05).Conclusion：Curcumin pretreatment can release lung ischemia reperfusion injury in a dose-dependent manner，and the mechanism may be relevant with its curcumin of releasing pulmonary edema，reducing the formation of oxidation products and enhancing the function of clearing oxygen free radicals.

Lung ischemia reperfusion injury；Curcumin；Oxidative stress；Animal experiment；Rats

R56

A

0256-7415（2018）01-0007-04

10.13457/j.cnki.jncm.2018.01.002

2017-06-12

廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目（20152146）

吳建魏（1977-），男，主治醫(yī)師，主要從事臟器保護(hù)方面的研究。

馮天保，鄭鋒玲）