達(dá)氏鰉、施氏鱘及其雜交子代胚胎發(fā)育期的抗氧化酶活性

張穎 ，徐偉 ，孫大江 ，王斌 ，許式見(jiàn) ，張鏡群 ，胡朝

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司，浙江 杭州 310000；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000；4.四川省都江堰管理局，四川 都江堰 611830）

達(dá)氏鰉、施氏鱘及其雜交子代胚胎發(fā)育期的抗氧化酶活性

張穎1,3，徐偉1，孫大江1，王斌2，許式見(jiàn)2，張鏡群3，胡朝4

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司，浙江 杭州 310000；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000；4.四川省都江堰管理局，四川 都江堰 611830）

利用形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的方法測(cè)定達(dá)氏鰉Huso dauricus、施氏鱘Acipenser schrenckii及其正反雜交子代的受精率、孵化率、出苗率與胚胎發(fā)育期間超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，分析胚胎發(fā)育與抗氧化酶含量的關(guān)系。結(jié)果表明，達(dá)氏鰉與施氏鱘為雜交親和，可獲得正常發(fā)育的正反交后代，不影響受精率、孵化率及出苗率。不同胚胎發(fā)育期鱘的4種主導(dǎo)抗氧化酶類型及變化規(guī)律各不相同。在特定發(fā)育時(shí)期，達(dá)氏鰉（♀）與施氏鱘（♂）正交子代（大雜交鱘）的CAT等抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量均接近或高于兩親本中較高的一方；而達(dá)氏鰉（♂）與施氏鱘（♀）反交子代（小雜交鱘）介于兩親本之間，特別是SOD、還原型谷胱甘肽（GSH）活性和MDA含量顯著低于其父母本。施氏鱘胚胎心臟搏動(dòng)期SOD的活性最高，達(dá)氏鰉胚胎在卵黃栓期SOD的活性最高，而雜交子代的SOD活性均在囊胚期達(dá)最大值。綜上所述，4種鱘胚胎發(fā)育時(shí)期內(nèi)源性抗氧化酶活性的表達(dá)差異在一定程度上可解釋物種間表型性狀的差異。

施氏鱘；達(dá)氏鰉；雜交子代；胚胎發(fā)育；抗氧化酶

達(dá)氏鰉Huso dauricus和施氏鱘Acipenser schrenckii是黑龍江流域特有的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[1]。達(dá)氏鰉是世界上26種鱘科魚(yú)類中，生長(zhǎng)速度最快和懷卵量最大的2種鰉屬魚(yú)類之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。它性成熟晚，養(yǎng)殖個(gè)體大，養(yǎng)殖數(shù)量受限[2]。施氏鱘為我國(guó)第一個(gè)自主開(kāi)發(fā)的養(yǎng)殖鱘，易馴養(yǎng)、性成熟早，但個(gè)體生長(zhǎng)速度和懷卵量均小于達(dá)氏鰉。因此，研究達(dá)氏鰉和施氏鱘種屬間雜交子代的生物學(xué)特性有望獲得具有養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)的鱘新品種。

魚(yú)類早期發(fā)育過(guò)程中，胚胎細(xì)胞的氧化代謝可產(chǎn)生·OH、O-2·等活性氧分子（Reactive oxygen species,ROS）[3,4]。自然狀態(tài)下，組織內(nèi)的自由基清除酶類和抗氧化劑等防御系統(tǒng)可清除活性氧分子，維持體內(nèi)氧化代謝平衡[4,5]。而在一些損傷環(huán)境作用下，胚胎細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝物增加，或細(xì)胞中抗氧化保護(hù)機(jī)制不足時(shí)活性氧堆積，對(duì)胚胎細(xì)胞產(chǎn)生毒性，阻滯或延遲胚胎發(fā)育[5,6]。研究證實(shí)，卵母細(xì)胞及胚胎細(xì)胞內(nèi)均含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）等物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，這些物質(zhì)對(duì)維持胚胎發(fā)育過(guò)程中活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，保證胚胎正常發(fā)育，提高苗種成活率等具有重要的作用[6,7]。對(duì)哲羅鮭Hucho taimen胚胎發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源性抗氧化酶活性的研究表明，SOD等抗氧化酶的活性在胚胎的發(fā)生與發(fā)育過(guò)程中具有特異性變化，表明魚(yú)類胚胎的發(fā)生發(fā)育與其體內(nèi)超氧化物自由基的清除有關(guān)[7]。本研究采用生物化學(xué)方法，研究SOD、GSH和丙二醛（MDA）在達(dá)氏鰉、施氏鱘及其正反交子代胚胎中的表達(dá)特點(diǎn)，旨在了解以SOD、GSH為代表的抗氧化酶系統(tǒng)在胚胎發(fā)育過(guò)程中的建立及其對(duì)胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

達(dá)氏鰉、施氏鱘及其雜交子代各發(fā)育時(shí)期的胚胎取自杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司孵化車(chē)間，均為全人工繁殖受精卵，孵化水溫為16～17℃，溶氧≥6.0 mg/L。采用解剖鏡觀察胚胎發(fā)育時(shí)期，每2h觀察一次，在卵裂期、卵黃栓期、神經(jīng)胚期、視泡期、心搏期、孵出前期、孵出期等7個(gè)發(fā)育時(shí)期取樣（取3對(duì)親本的受精卵，每對(duì)親本10g左右）。用濾紙吸干胚胎水分后，放人5mL的采樣管中，于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 受精率、孵化率及苗種成活率的計(jì)算方法

胚胎發(fā)育至高囊胚期時(shí)，從孵化瓶中隨機(jī)取卵100～200粒，放入培養(yǎng)皿中，借助放大鏡觀察，鑒別受精與否。重復(fù)取受精卵三次，取平均值，計(jì)算受精率：即正常受精卵數(shù)占總采卵數(shù)的百分比。

仔魚(yú)孵出期時(shí)，發(fā)育正常的孵出魚(yú)苗數(shù)占總受精卵數(shù)的百分比為孵化率。仔魚(yú)發(fā)育至平游期時(shí)，平游魚(yú)苗數(shù)占總受精卵數(shù)的百分比為出苗率。采樣和計(jì)算方法同上。

1.2.2 樣品制備

取4種魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期的胚胎樣品，加入3倍體積的PBS緩沖液，冰浴勻漿5min，3 000r/min冷凍離心10min，取其上清液用于測(cè)定抗氧化酶的活性。

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定

超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒的操作步驟測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種鱘胚胎的受精率、孵化率與苗種成活率

由表1可知，4種鱘的平均受精率、孵化率與出苗率均高于70%，雜交未影響受精率、孵化率與出苗率，雖然雜交鱘與施氏鱘的平均受精率、孵化率與出苗率均高于達(dá)氏鰉。

表1 4種鱘受精率、孵化率與出苗率Tab.1 Fertilization rate,and hatching rate of fertilized eggs and mortality of postlarvae in four sturgeons

2.2 4種鱘不同時(shí)期胚胎的SOD和CAT活性

4種鱘胚胎SOD活性隨胚胎發(fā)育進(jìn)程的變化規(guī)律見(jiàn)圖1。如圖1所示，施氏鱘胚胎SOD活性隨發(fā)育的變動(dòng)范圍為55.84～256.03 U/g prot，最大值出現(xiàn)在心臟搏動(dòng)期。而達(dá)氏鰉胚胎的SOD活性值隨發(fā)育時(shí)間的變動(dòng)范圍則為61.31～171.84 U/g prot，最大值出現(xiàn)在卵黃栓期。與施氏鱘和達(dá)氏鰉胚胎SOD活性的變動(dòng)范圍不同，大雜交鱘SOD活性在囊胚期、神經(jīng)胚期、初孵仔魚(yú)期較高，分別為136.25 U/g prot、113.59 U/gprot和 106.44 U/gprot，其他時(shí)期均較低。小雜交鱘SOD活性的變動(dòng)范圍為60.36～142.34 U/gprot，囊胚期活性最高。

如圖2所示，4種鱘胚胎發(fā)育期CAT活性的變化規(guī)律大致相同。施氏鱘與達(dá)氏鰉卵黃栓期的CAT活性最高，分別為30.22 U/g prot和33.36 U/g prot。而大雜交鱘胚胎的CAT活性在囊胚期達(dá)最高，顯著高于施氏鱘、達(dá)氏鰉和小雜交鱘的同期胚胎（P＜0.05）。與大雜交鱘的胚胎不同，小雜交鱘胚胎的CAT活性在卵黃栓期達(dá)最高，為21.52 U/gprot。

圖1 4種鱘不同胚胎發(fā)育時(shí)期SOD活性的變化Fig.1 Changes in SOD activity of four sturgeons

圖2 4種鱘不同胚胎發(fā)育時(shí)期CAT活性的變化Fig.2 Changes in CAT acitivity of four sturgeons

2.3 4種鱘不同胚胎期GSH含量的變化規(guī)律

由圖3可知，4種鱘胚胎的GSH含量隨著胚胎發(fā)育時(shí)間的增加而表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。施氏鱘胚胎的GSH含量在囊胚期最高，為778.78 U/gprot，而卵黃栓期和心臟搏動(dòng)期的活性則分別為324.55 U/gprot和451.21 U/gprot。與施氏鱘胚胎相同，達(dá)氏鰉胚胎的GSH含量最高值也出現(xiàn)在囊胚期，最低值則出現(xiàn)在孵化晚期，為16.43 U/g prot。大雜交鱘胚胎的GSH含量較低，孵化晚期最高，為226.97 U/g prot。小雜交鱘胚胎的GSH含量則顯著低于其他3種鱘胚胎。

圖3 4種鱘不同胚胎發(fā)育時(shí)期GSH活性的變化Fig.3 Changes in GSH content of four sturgeons

2.4 4種鱘不同時(shí)期胚胎MDA含量的變化

圖4 4種鱘不同胚胎發(fā)育時(shí)期MDA含量的變化Fig.4 Changes in MDA content of four sturgeons

如圖4所示，4種鱘不同時(shí)期胚胎MDA含量的變化規(guī)律相同，均呈先升高后降低的變化規(guī)律。整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中，施氏鱘胚胎MDA含量呈升高后降低的趨勢(shì)，卵黃栓期含量最高，為48.26 U/mg prot，孵化晚期最低，為5.45 U/mg prot。達(dá)氏鰉胚胎的MDA含量也呈升高后降低的變化趨勢(shì)，卵黃栓期的MDA含量最高，為23.37 U/mgprot。大雜交鱘胚胎MDA含量在神經(jīng)胚期最高，為24.39 U/mg prot，而小雜交鱘胚胎的MDA含量較低，孵化晚期的含量最低，為4.59 U/mgprot。

3 討論

3.1 鱘雜交親和性的研究

鱘染色體組型復(fù)雜，微型染色體數(shù)眾多[11]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直試圖通過(guò)種間或?qū)匍g雜交改良鱘的品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)鱘種質(zhì)有益基因的滲透。1953年Nikoljukin和Timofeeva通過(guò)雜交組合，獲得多個(gè)雜交鱘新品種，篩選出生長(zhǎng)迅速、可育、性成熟早的小鰉鱘（歐鰉H.huso♀×小體鱘Acipenser ruthenus♂），其能在淡水和咸淡水中生活，是目前較為成功的雜交鱘，表明鱘科魚(yú)類屬間雜交親和[12]。

近些年，隨著世界鱘養(yǎng)殖熱潮的興起，鱘雜交組合研究也方興未艾[13-15]。Hassanzadeh Saber（2015）等[14]進(jìn)行了裸腹鱘（A.nudiventris Lovetsky,1828）和西伯利亞鱘（A.baerii,Brandt,1869）種間雜交；Schrey等2011年進(jìn)行密蘇里鏟鱘Scaphirhynchus albus和鏟鱘Scaphirhynchus platorynchus雜交的組合，分析其雜交種的形態(tài)和遺傳特征[13,14]。Vasil’eva和Grunina（2011）[15]研究了西伯利亞鱘和達(dá)氏鰉屬間雜交的形態(tài)學(xué)。我國(guó)對(duì)雜交鱘的研究起步較晚，先后進(jìn)行了施氏鱘×達(dá)氏鰉、施氏鱘×西伯利亞鱘、施氏鱘×俄羅斯鱘、小體鱘×施氏鱘、俄羅斯鱘×西伯利亞鱘等多個(gè)雜交組合。其中，小體鱘♂×施氏鱘♀種間雜種的胚胎發(fā)育過(guò)程中，受精率低于10%，胚胎發(fā)育至孵化早期出現(xiàn)異常，大量死亡。大量的研究結(jié)果表明，鱘的種間和種屬間雜交表現(xiàn)出一定的親和性，但有些種間雜交則表現(xiàn)出雜交不親和或弱親和[16-18]。

3.2 鱘胚胎發(fā)育過(guò)程中抗氧化酶活性的變化規(guī)律

研究證實(shí)，魚(yú)類的受精卵中儲(chǔ)存相關(guān)的抗氧化酶或mRNA，對(duì)胚胎發(fā)育的啟動(dòng)具有重要作用，為胚胎早期發(fā)育中細(xì)胞的快速增長(zhǎng)及遷移提供保障[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，普安銀鯽胚胎中含有母源性酶類，對(duì)胚胎發(fā)育的啟動(dòng)以及早期卵黃物質(zhì)的利用，一直發(fā)揮著重要的抗氧化作用[19]。對(duì)施氏鱘胚胎發(fā)育過(guò)程中抗氧化酶的研究也表明，鱘科魚(yú)類也存在著母源性抗氧化酶類，對(duì)胚胎發(fā)育具有重要的作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，4種鱘受精卵和卵裂期開(kāi)始時(shí)，SOD等酶均具有活性，表明了受精卵在發(fā)育早期具有一定的SOD等抗氧化酶活性，但均為受精卵中的母源性酶類，并非合子基因表達(dá)的產(chǎn)物。

活性氧是氧代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧產(chǎn)物，生成量約占組織總耗氧量的l%～2%，可誘導(dǎo)生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)而改變其結(jié)構(gòu)及構(gòu)象，發(fā)揮如信號(hào)傳遞等重要的調(diào)控功能[19-21]。不同發(fā)育階段的胚胎代謝特點(diǎn)及所需營(yíng)養(yǎng)不同，活性氧分子（ROS）的產(chǎn)生類型和生成量不同，起主導(dǎo)作用的抗氧化酶的類型也不同[22,23]。本研究中，SOD和CAT在不同胚胎期活性不同，大雜交鱘SOD酶活性在囊胚期起關(guān)鍵性作用，促進(jìn)囊胚腔的形成，這一時(shí)期可能是卵裂過(guò)程中產(chǎn)生的自由基使母源性SOD活性增加[24]。施氏鱘SOD活性在心搏期最高，CAT活性也較大。該期為心臟形成的關(guān)鍵期，表明SOD和CAT在施氏鱘心臟搏動(dòng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的抗氧化作用，這可能與合子基因的表達(dá)有關(guān)[24]。與施氏鱘不同，達(dá)氏鰉的SOD和CAT活性最高值出現(xiàn)在卵黃栓期，表明其卵黃栓發(fā)育過(guò)程中受到氧化損傷。達(dá)氏鰉胚胎通過(guò)增加SOD和CAT活性有效地降低損傷，這一結(jié)果與Rudneva的研究結(jié)論一致[25]。

GSH含量是衡量魚(yú)體抗氧化能力的重要因子之一[15]。本研究中，大雜交鱘胚胎出膜期的GSH含量最高，表明其在出膜期發(fā)揮了重要的抗氧化作用，促進(jìn)了出膜，與哲羅魚(yú)胚胎發(fā)育的研究結(jié)果一致[15]。整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中，小雜交鱘GSH含量較低，表明SOD和CAT在小雜交鱘胚胎發(fā)育過(guò)程中起主要抗氧化作用。研究證實(shí)，MDA可間接地反映魚(yú)類組織細(xì)胞受自由基攻擊的程度[22]。本研究中，施氏鱘胚胎的MDA含量在囊胚期和卵黃栓期出現(xiàn)兩個(gè)峰值，與其胚胎死亡率較高的現(xiàn)象相一致，表明施氏鱘胚胎在囊胚期和卵黃栓期易受到氧化損傷[5]。達(dá)氏鰉胚胎的在卵黃栓期MDA含量最高，大雜交鱘則出現(xiàn)在神經(jīng)胚期，而整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期小雜交鱘胚胎的MDA含量變化不顯著，表明4種鱘胚胎發(fā)育期的抗氧化機(jī)制不同。

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Antioxidant Enzyme Activities During Embryonic Development of Huso dauricus,Acipenser schrenckii and their Hybrids

ZHANG Ying1,2,XU Wei1,SUN Da-jiang1,WANG Bin2，XU Shi-jian2,ZHANG Jing-qun3,HU Cao4
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Tibet Autonomous Region Academy of Agriculture and Animal Husbandry,Lhasa 850000,China;4.Dujiangyan Authority of Sichuan Province,Dujiangyan 611830,China）

Fertilization rate and hatching rate of fertilized eggs and mortality of post-larvae were monitored and activities of antioxidant enzymes including acid phosphatase （ACP）,alkaline phosphatase （AKP）,superoxide dismutase （SOD）and catalase（CAT）were determined during embryonic development in Acipenser schrenckii,Huso dauricus and their hybrids by biochemical methods to evaluate the mechanism of heterosis.It was found that hybridization between Acipenser schrenckii and Huso dauricus showed high cross-compatibility with natural crossing progenies,indicating that the fertilization rate,hatchability and mortality of post-larvae were not affected by hybridization.Antioxidant enzyme activities were shown to be different patterns during embryonic development in Acipenser schrenckii and Huso dauricus and their hybrids.There were similar or higher antioxidant enzyme activities in the hybrid between Huso dauricus（♀）×Acipenser schrenkii（♂）than those in their parents with higher antioxidant enzyme activity in some particular embryonic development stage.The hybrid between Acipenser schrenkii（♀）×Huso dauricus（♂）had significant lower SOD activity and glutathione（GSH）and malondialdehyde（MDA）contents than their parents did（P ＜ 0.05）.The maximal SOD ac-tivity was observed at heart beating phase in Acipenser schrenkii and at yolk plug phase in Huso dauricus.The maximal SOD activity,however,was found at blastula phase in the hybrids.The findings indicate that the heterosis between Huso dauricus and Acipenser schrenkii can partially be explained by the differences in antioxidant enzyme activities among the sturgeons.

Acipenser schrenkii;Huso dauricus;hybrid;embryonic development;antioxidant enzyme

S965.215

A

1005-3832（2017）06-0019-05

2017-03-21

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203086）；杭州市錢(qián)江特聘專家（2016）；黑龍江省冷水性魚(yú)類種質(zhì)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目.

張穎（1977-），女，博士，副研究員，從事魚(yú)類繁殖生理研究．E-mail:juletzhang@hotmail.com

孫大江，男，研究員．E-mail:13845059350@163.oom