暗紋東方鲀生長性狀相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記篩選

馬愛軍, 鄒 杰, 孫建華, 王 婷, 王廣寧, 崔文曉, 王新安, 劉大勇, 郭正龍

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暗紋東方鲀生長性狀相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記篩選

馬愛軍1, 2, 鄒 杰1, 3, 孫建華1, 3, 王 婷1, 王廣寧1, 崔文曉1, 3, 王新安1, 2, 劉大勇4, 郭正龍4

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海201306; 4. 江蘇中洋集團(tuán)股份有限公司, 江蘇南通226600)

為了篩選與暗紋東方鲀()生長相關(guān)的分子標(biāo)記, 作者采用SSR結(jié)合BSA技術(shù)對(duì)同齡孵化群體的同池養(yǎng)殖暗紋東方鲀生長差異性狀標(biāo)記進(jìn)行篩選。利用85對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)暗紋東方鲀生長快、慢各30尾個(gè)體構(gòu)建的兩個(gè)基因池進(jìn)行分析, 共篩選到14個(gè)差異位點(diǎn)。然后分析這14個(gè)差異微衛(wèi)星位點(diǎn)在這60個(gè)暗紋東方鲀個(gè)體中的基因型差異, 結(jié)果表明: 位點(diǎn)TOP03、TOG01、fms15、fms75與生長性狀呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(<0.01), fms89與生長性狀呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系(<0.01)。用另外30個(gè)個(gè)體(生長快慢各15個(gè))進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后, 結(jié)果只有位點(diǎn)fms15、fms75與生長性狀顯著相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別為–0.411和–0.384。這兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)于暗紋東方鲀生長性狀有顯著效應(yīng), 為開展暗紋東方鲀的分子標(biāo)記輔助育種提供了有價(jià)值的參考標(biāo)記。

暗紋東方鲀(); 生長性狀; 微衛(wèi)星; 相關(guān)性分析

暗紋東方鲀()屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(), 其分布集中于北太平洋西部地區(qū)的東海及黃海海域, 且可進(jìn)入長江到江陰一帶, 并可定居太湖[1]。暗紋東方鲀不僅能夠養(yǎng)血補(bǔ)氣, 而且向來以肉味鮮美聞名, 為傳統(tǒng)美食中的典范, 是具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[2-3]。在實(shí)際養(yǎng)殖中, 暗紋東方鲀養(yǎng)殖技術(shù)日益成熟, 養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大, 養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增高, 到2014年預(yù)期產(chǎn)量已達(dá)到40 000t以上[2], 但都普遍存在同一暗紋東方鲀?nèi)后w出現(xiàn)生長性狀差異明顯的情況, 往往一個(gè)養(yǎng)殖周期需要淘汰掉許多小的個(gè)體, 加之暗紋東方鲀具有相互殘食的特性[3], 小個(gè)體易受傷且死亡率極高, 而且還會(huì)受傷得病感染其他魚體[4]。因此, 進(jìn)行暗紋東方鲀大小差異的微衛(wèi)星標(biāo)記研究既為暗紋東方鲀的良種選育提供依據(jù), 也對(duì)提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益具有深遠(yuǎn)的意義。

微衛(wèi)星(Microsatellite)目前不僅廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析重要性狀標(biāo)記的篩選[5]、遺傳圖譜的構(gòu)建[6]和發(fā)育研究[7]等, 而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷、品種鑒定、農(nóng)作物及動(dòng)物育種等領(lǐng)域[8]。微衛(wèi)星在水產(chǎn)動(dòng)物生長性狀分子標(biāo)記方面的運(yùn)用上也取到了一定的成果, Cnaani等[9]在利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)橙色莫桑比克羅非魚()和奧利亞羅非魚()的雜交F2代進(jìn)行與生長性狀的相關(guān)性分析, 篩選得到位點(diǎn)UNH130和體長相關(guān)。佟廣香等[10]研究哲羅魚 ()生長速度相關(guān)性狀的微衛(wèi)星篩選得到標(biāo)記106INRA、166TUF與測(cè)量的7個(gè)生長性狀顯著相關(guān); 111TUF和210TUF與6個(gè)生長性狀顯著相關(guān)。劉偉等[11]研究3種鯉魚()群體的生長性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn): 黃河鯉()的生長性狀和位點(diǎn)Mfw5相關(guān); 建鯉()的生長性狀與位點(diǎn)Cca09、Hlj013、Mfw2、MfW7和 Mfw29相關(guān); 黑龍江野鯉()的生長性狀與位點(diǎn)Mfw4、Mfw6和Mfwl1相關(guān)。王桂興等[12]研究利用30對(duì)牙鲆()微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)雌核發(fā)育個(gè)體進(jìn)行分析, 得到有8個(gè)座位分別與體質(zhì)量、體長、體高性狀的相關(guān)性顯著。目前有關(guān)利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)暗紋東方鲀生長差異性狀分析研究較少, 為提高暗紋東方鲀的育種效率本研究擬運(yùn)用85對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記, 采用SSR結(jié)合BSA技術(shù)比較分析暗紋東方鲀?nèi)后w的生長差異性狀, 篩選出可能與暗紋東方鲀生長性狀相連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記, 為進(jìn)行暗紋東方鲀的苗種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用暗紋東方鲀樣本由江蘇中洋河豚莊園公司提供, 取自2010年的同池同時(shí)孵化的混合群體, 約180日齡的個(gè)體。分別選取生長性狀處于兩極端的差異個(gè)體各30尾, 其中, 生長快的F(fast)組個(gè)體全長都大于13 cm(14.8 cm±1.8 cm); 生長慢的S(slow)組個(gè)體全長都小于6 cm(4.9 cm±1.1 cm)。每個(gè)樣本形態(tài)學(xué)測(cè)量完后, 剪取部分尾鰭鰭條分裝于離心管中并置于–80℃冰箱中保存以備后用。

1.2 實(shí)驗(yàn)引物

使用引物序列參照Ma等[13]和自己設(shè)計(jì)暗紋東方鲀引物共16對(duì), 古川聰史[14]、郝君[15]和Kai等[16]紅鰭東方鲀()微衛(wèi)星引物69對(duì), 由上海生工生物科技有限公司合成, 實(shí)驗(yàn)所用部分微衛(wèi)星引物信息見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取及檢測(cè)

取保存兩組樣本F組和S組的尾鰭各30 mg, 按照基因組DNA提取試劑盒提取DNA。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定, 核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度, 無菌水稀釋到濃度為50 ng/μL, –20℃冷凍保存。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用部分微衛(wèi)星引物的核心序列、引物序列、退火溫度和片段長度

續(xù)表

基因座引物序列(5′-3′)片段長度(bp)退火溫度(℃) f1637CCTGAAGCACACACTGCAAG200~20860 CCTGATGACACCTGCTCTGA f1690TCCTCCAACTTCACGCTCTT220~23559 AGGTACTTCTGGACCGCATC f1691GTTTTGCAGCACGAGTGTGT175~19559 GCATCCAGGCAAGGATTAAA f1781TTTTCTTTCACACCCCGAAC181~20257 CCCCACTTCCCCTCTTTTAG TOG01AACACCTCCACCTGCTTGCT280~29054 ATTGCCCAGTTGACTTTCC TOG02CACAAGGTGAGGACAAAGAC155~16554 TTGGCAACAGTTAGGTAGGT TOG03TCGGTGATGATCGGTGAC280~29057 TAAGCTCTGAGCCAAAAGG TOP01AAAAGAATGCTTATCCTG200~22552 TTACTTGTGACCTGCGT TOP02TCTTCTTGCTATTTTGCT260~30054 ATGAGTCTGGTCCTGCT TOP03TCCGCTATCACATCTATCT155~17553 CATGATGCTCCTGGAAAAT fms15CTGGCATAACTGATTAGGCTGT165~17560 ATAGCTGACAGCACGGGAAC fms43GTGCCCACAAAGATGGAAAT12060 TCCTTGGCAGAGTCAGTCCT TOb10ACCCACTCCGTCCTTCCT310~38061 TCAACCGCCCTTCCAACT f169CTCCCACGCAAGCAGTCA280~30060 CTCAGTATCAGGGGTCAAAGAAAT f362TTACACTGGCCAAACAACTCTG398~40560 GGCCTATAGGACCTCTGGACT f1372GAGGACATCCGATCACATCC212~24060 CCCTGCAGGAGGAATACCAG f1497CACCTGCCCGAAAGTTTAAG170~18258 TGAAAGCCCAAGAGAGGAAA

1.3.2 BSA基因池的建立及其PCR擴(kuò)增

F和S兩組暗紋東方鲀各30個(gè)樣本, 從F組每個(gè)樣本抽取10 μL DNA溶液混合成F組基因池, 同樣方法獲得S組基因池。用85對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)F和S兩組基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 體系為: buffer 1.4 μL、dNTP 1.2 μL (mmoL/μL)、上下游引物各0.6 μL(10 μmol)、模板1 μL (50 ng/μL)、taq酶 0.2 μL(5 U/μL)、補(bǔ)充去離子水10 μL。PCR程序是: 預(yù)變性(95℃5 min), 循環(huán)30次(變性94℃30 s、退火30 s、復(fù)性72℃30 s), 延伸(72℃10 min), 結(jié)束(4℃)。將85對(duì)微衛(wèi)星引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性, 在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離, 使用硝酸銀法染色[17], 記錄帶型并用掃描保存電泳結(jié)果。

1.3.3 篩選差異條帶及個(gè)體PCR擴(kuò)增

比較分析兩個(gè)基因池聚丙烯酰胺電泳條帶, 初步找出F和S兩組具有差異性條帶的微衛(wèi)星位點(diǎn)作為候選的生長差異的微衛(wèi)星分子標(biāo)記, 將篩選出的具有差異的引物按照上述的PCR條件, 對(duì)構(gòu)建基因池的60個(gè)暗紋東方鲀個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀法染色, 再次記錄差異條帶。

1.3.4 生長性狀差異條帶分析

使用SPSS軟件對(duì)篩選出的差異等位基因片段與暗紋東方鲀生長性狀這兩個(gè)變量的進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn), 判斷差異等位基因片段和暗紋東方鲀生長性狀的相關(guān)性情況, 篩選出與暗紋東方鲀生長差異性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)。

1.3.5 驗(yàn)證生長性狀差異位點(diǎn)

從江蘇中洋河豚莊園公司再次采樣, 來自不同家系混養(yǎng)的同日齡的暗紋東方鲀, 生長顯著快、慢各15尾, 將篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn), 對(duì)上述新樣本個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀法染色, 統(tǒng)計(jì)特異性條帶并進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè), 以驗(yàn)證篩選到標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

1.3.6 差異等位基因片段切膠測(cè)序

將驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的差異條帶進(jìn)行切膠回收、純化, 送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行克隆、測(cè)序, 以驗(yàn)證差異片段的是否為相應(yīng)序列。

2 結(jié)果

2.1 BSA基因池的差異條帶篩選

使用試劑盒提取基因組DNA, 紫外線分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定及瓊脂糖檢測(cè)后, 選取質(zhì)量好的DNA用于下一步實(shí)驗(yàn)。用提取的高質(zhì)量DNA構(gòu)建了F和S兩組基因池。85對(duì)引物對(duì)構(gòu)建的F和S兩組基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后進(jìn)行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染, 結(jié)果顯示有78對(duì)引物具有清晰目的條帶, 篩選出TOP01、TOP03、TOG01、TOG02、Tob10、Tob13、fms15、fms75、fms89、f169、f362、f383、f1372和f1497共14對(duì)引物的電泳條帶在F組和S組間具有差異等位基因, 如圖1為F和S基因池的差異等位基因的聚丙烯酰胺電泳圖。

2.2 統(tǒng)計(jì)個(gè)體中帶型的差異等位基因片段

將F和S兩組基因池篩選的14對(duì)具有差異等位基因片段的微衛(wèi)星引物, 對(duì)構(gòu)建基因池的60個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果。結(jié)果顯示微衛(wèi)星位點(diǎn)f383擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE條帶模糊無法辨認(rèn), 位點(diǎn)Tob13的產(chǎn)物則無多態(tài)性、無差異, 所以兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)被舍棄。其余位點(diǎn)差異帶型統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。圖2為引物fms15、fms75在兩組個(gè)體中的PCR擴(kuò)增帶譜, 可以看出兩微衛(wèi)星位點(diǎn)在F組和S組的目的等位基因片段有著較明顯的差異, fms15位點(diǎn)180 bp和fms75位點(diǎn)130 bp的差異等位基因片段在F組的擴(kuò)增帶譜中出現(xiàn)的頻率較低, 在S組的擴(kuò)增帶譜出現(xiàn)的頻率較高(箭頭指示的為差異等位基因片段)。

F. 生長快組; S. 生長慢組

F. fast; S. slow

2.3 差異等位基因片段的SPSS相關(guān)性分析

根據(jù)表2結(jié)果, 通過SPSS13.0軟件對(duì)篩選的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的差異等位基因片段與暗紋東方鲀的生長差異性狀進(jìn)行相關(guān)性分析, 已知在0.00~0.33呈現(xiàn)弱相關(guān)性, 0.33~0.67呈現(xiàn)中相關(guān)性, 0.67~1.00呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)性。由表3可得, 位點(diǎn)TOP01、TOG02、Tob10、f169、f362、f1372的生長差異相關(guān)性不顯著(>0.05); 位點(diǎn)TOP03、TOG01、fms15、fms75、fms89生長差異相關(guān)性極顯著(<0.01), 且為中度相關(guān)(0.33<<0.67), 其中有1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)fms89 310 bp的等位基因片段與暗紋東方鲀的F組性狀存在一定的正相關(guān)性, 其余4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)則為負(fù)相關(guān)性。

表2 F和S兩組12個(gè)位點(diǎn)的差異等位基因片段統(tǒng)計(jì)表

M. DL500bp分子標(biāo)記; F. 生長快組; S. 生長慢組

M. DL500bp DNA marker ; F. fast; S. slow

2.4 驗(yàn)證生長顯著差異的微衛(wèi)星位點(diǎn)

經(jīng)相關(guān)性分析得到TOP03、TOG01、fms15、fms75和fms89 5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與生長差異性狀存在極顯著相關(guān)關(guān)系, 且為中等相關(guān); 位點(diǎn)f1497與生長性狀存在顯著相關(guān), 但相關(guān)強(qiáng)度較弱。然后, 將重新選取的不同群體的暗紋東方鲀生長差異顯著的快和慢各15個(gè)個(gè)體進(jìn)行5個(gè)微衛(wèi)星引物的PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色, 統(tǒng)計(jì)差異片段, 并進(jìn)行相關(guān)性分析(表4)。由表4可得, 位點(diǎn)fms15擴(kuò)增的差異等位基因片段在生長差異的F和S組重新出現(xiàn)的頻率分別為0和33.33%; 位點(diǎn)fms75擴(kuò)增的差異等位基因片段在生長差異的F和S組重新出現(xiàn)的頻率分別為6.67%和40.00%, 且分析相關(guān)性關(guān)系均呈現(xiàn)顯著性, 而其余3個(gè)則相關(guān)性不顯著。得到的微衛(wèi)星位點(diǎn)fms15和fms75的結(jié)果基本與實(shí)驗(yàn)預(yù)期一致, 相關(guān)系數(shù)分別為–0.411和–0.384, 進(jìn)一步驗(yàn)證了作者所篩選的與暗紋東方鲀生長性狀存在顯著相關(guān)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。圖3為fms15、fms75兩個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增帶譜(箭頭指示的為差異等位基因片段)。

表3 微衛(wèi)星位點(diǎn)與暗紋東方鲀生長差異性狀的相關(guān)性分析

注: *. 顯著相關(guān)(<0.05); **. 極顯著相關(guān)(<0.01)

2.5 差異等位基因片段切膠測(cè)序及BLAST比對(duì)

對(duì)具有差異條帶的微衛(wèi)星引物進(jìn)行驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn), 得到fms15和fms75存在顯著性的差異。然后將其差異條帶進(jìn)行切膠回收, 送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行序列克隆、測(cè)定, 獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)fms15差異條帶的DNA序列。位點(diǎn)fms15的測(cè)序結(jié)果為: TCTGGCATAACTGATTAGGCTGTAGCATGAATGTAGCATGTAGCAAGAATGCCAGCATCCTCTTACGGTGTGGAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGAGGGCTATCCATTAGCGAAAGCAATCTGCAGTTCCCGTGCTG TCAGCTATA, 通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì), 證實(shí)該片段序列和紅鰭東方鲀發(fā)布的基因組一段高度吻合, 同源性達(dá)到98%, 差別在于序列中有3個(gè)堿基發(fā)生置換(G-C、C-G、G-A); 同時(shí)發(fā)現(xiàn)該序列預(yù)測(cè)功能可能與RNA結(jié)合蛋白和CXADR膜蛋白有關(guān)。而位點(diǎn)fms75因?yàn)榛蚱屋^小、非特異性擴(kuò)增條帶較多、回收DNA濃度較低, 導(dǎo)致未能獲得理想擴(kuò)增結(jié)果。

M. DL500bp分子標(biāo)記; F. 生長快組; S. 生長慢組

M. DL500bp DNA marker; F. fast; S. slow

表4 差異等位基因片段在個(gè)體擴(kuò)增帶型中的出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 微衛(wèi)星分析方法

分群分離分析法(BSA)的基本原理是從某一分離群體中篩選出一定數(shù)量具有目標(biāo)基因表型差異的個(gè)體, 分別構(gòu)成2個(gè)亞群或集團(tuán); 該方法可用來快速鑒別與特定基因或染色體區(qū)域連鎖的標(biāo)記[18]。現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物抗性基因、生長相關(guān)性狀的篩選鑒定工作當(dāng)中[19-20]。王美玉等[21]采用69個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)半滑舌鰨()極大群體和極小群體的基因型分布進(jìn)行篩選, 得到12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)存在差異, 在其后的驗(yàn)證群體與生長性狀相關(guān)的檢驗(yàn)中也呈現(xiàn)出顯著差異, 說明采用極端群體進(jìn)行初篩有效。張?zhí)鞎r(shí)等[22]采用分離群體標(biāo)記法也篩選出與中國對(duì)蝦() 生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)則也采用BSA法將收集的暗紋東方鲀分為F和S組, 進(jìn)行差異微衛(wèi)星位點(diǎn)的初篩選。然后將這些標(biāo)記對(duì)群體內(nèi)個(gè)體進(jìn)行相關(guān)分析, 并驗(yàn)證篩選極端群體標(biāo)記的有效性。

微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記為共顯性標(biāo)記, 且檢測(cè)方便, 數(shù)量性狀基因位點(diǎn)定位常采用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記分析, 是目前水產(chǎn)動(dòng)物數(shù)量性狀基因位點(diǎn)定位的常用方法之一。近幾年, 國內(nèi)研究者利用微衛(wèi)星標(biāo)記也得到了鯽()[23]、青蝦()[24]、刺參()[25]和中華絨螯蟹()[26]等生長性狀相關(guān)聯(lián)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。因魚類大多數(shù)的經(jīng)濟(jì)性狀屬于數(shù)量性狀, 遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜且受多基因調(diào)控, 易受環(huán)境影響, 表現(xiàn)為連續(xù)變異, 從而不能明確表現(xiàn)型與基因型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系[27]。但在基因組時(shí)代分析大批DNA分子標(biāo)記與性狀連鎖關(guān)系、分子標(biāo)記與數(shù)量性狀的相關(guān)關(guān)系, 得到與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的遺傳相關(guān)的數(shù)量性狀, 通過改變相應(yīng)基因型頻率, 達(dá)到改變表型的目的[28]。本研究采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法對(duì)暗紋東方鲀生長差異性狀進(jìn)行研究, 從分子層面揭示數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ), 后續(xù)的工作將對(duì)篩選獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行其他群體驗(yàn)證和多代驗(yàn)證, 進(jìn)一步證實(shí)其適應(yīng)范圍、準(zhǔn)確性和有效性, 以達(dá)到能合理地應(yīng)用該標(biāo)記指導(dǎo)育種, 提高育種速度, 改良重要生長性狀。

3.2 與生長性狀顯著相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記

Reed等[29]通過對(duì)小鼠進(jìn)行基因敲除試驗(yàn)后, 發(fā)現(xiàn)小鼠()的體質(zhì)量性狀是受多個(gè)基因控制的性狀。劉偉等[11]對(duì)3種不同地理群體的鯉研究發(fā)現(xiàn)鯉的生長性狀也與多個(gè)基因相關(guān), 本研究也得到了類似的結(jié)果: 利用85對(duì)東方鲀微衛(wèi)星引物對(duì)60個(gè)生長性狀差異顯著的個(gè)體進(jìn)行SSR結(jié)合BSA技術(shù)的分析, 得到了14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)能在暗紋東方鲀F和S兩組基因池中擴(kuò)增出差異條帶, 并通過單個(gè)樣本的SSR分析驗(yàn)證得到了其中5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增的差異條帶顯著, SPSS分析得到該5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與生長差異性狀相關(guān)極顯著, 說明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)可能與暗紋東方鲀的生長差異性狀有一定的關(guān)聯(lián), 如果條帶所對(duì)應(yīng)基因位點(diǎn)與生長差異性狀無關(guān), 則在大小群體之間出現(xiàn)的頻率應(yīng)該基本一致。再用新的生長性狀差異明顯的群體進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 結(jié)果只有fms15和fms75兩個(gè)位點(diǎn)與生長差異形狀存在顯著相關(guān), 進(jìn)一步說明這兩個(gè)位點(diǎn)與暗紋東方鲀的生長性狀存在著一定的關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步確認(rèn)本試驗(yàn)中微衛(wèi)星位點(diǎn)是否與暗紋東方鲀的生長性狀有關(guān), 我們將fms15位點(diǎn)測(cè)序所得全序列與NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì), 去尋找與生長相關(guān)的基因及蛋白, 作為輔助數(shù)據(jù)驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對(duì)比完后發(fā)現(xiàn), 該序列可能與RNA結(jié)合蛋白和CXADR膜蛋白有關(guān), 但目前并沒有具體的研究結(jié)果。

本研究所用BSA法只能對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分子標(biāo)記, 而目標(biāo)基因與分子標(biāo)記間連鎖的緊密程度不能確定, 也無法得知在遺傳連鎖圖上的位置, 更不能完成后續(xù)的QTL定位, 因此目前還不能完全確定fms15或fms75兩個(gè)位點(diǎn)是否存在多位點(diǎn)關(guān)聯(lián)效應(yīng), 該遺傳標(biāo)記是否可以作為暗紋東方鲀優(yōu)勢(shì)生長性狀分子輔助育種標(biāo)記還需要進(jìn)一步深入驗(yàn)證和研究。

[1] 成慶泰, 王存信, 田明誠, 等. 中國東方鲀屬魚類分類研究[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 1975, 21(4): 353-378.Cheng Qingtai, Wang Cunxin, Tian Mingcheng, et al. Studies on the Chinese tetraodondid fishes of the genus[J]. Acta Zoologica Sinica, 1975, 21(4): 353-378.

[2] 馬愛軍, 房金岑, 陳藍(lán)蓀, 等. 河豚魚產(chǎn)業(yè)調(diào)研報(bào)告(上)[J]. 海洋與漁業(yè), 2014(7): 87-92. Ma Aijun, Fang Jincen, Chen Lansun. Research report on puffer fish industry[J]. Ocean and Fishery, 2014(7): 87-92.

[3] 竇海鴿, 劉彥. 暗紋東方鲀苗種互相殘食原因及控制措施[J]. 北京水產(chǎn), 2004, 3: 13-14.Dou Haige, Liu Yan. Reason and control measure of cannibalism inyoung fish[J].Journal of Beijing Fisheries, 2004, 3: 13-14.

[4] 郭正龍. 暗紋東方鲀常見疾病及防治方法[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2009, 2: 57-58.Guo Zhenglong.Prevention and treatment methods for common disease of bubble fish[J]. Scientific Fish Farming, 2009, 2: 57-58.

[5] Miyao A, Zhong H S, Monna L, et al . Characterization and genetic mapping of simple sequence repeats in the rice genome[J]. DNA Research, 1996, 3(4): 233-238.

[6] Norri A T, Bradley D G, Cunningham E P. Microsatellite genetic variation between and within farmed and wild Atlantic salmon () populations[J]. Aquaculture, 1999, 180(3): 247-264.

[7] Bierne N, Launey S, Naciri Graven Y, et al. Early effect of inbreeding as revealed by microsatellite analyses onlarvae[J]. Genetics, 1998, 148(4): 1893- 1906.

[8] Beheregaray L B, Ciofi C, Geist D, et al . Genes record a prehistoric volcano eruption in the Galapagos[J]. Science , 2003 , 302 (5642) : 75.

[9] Cnaani A, Hallerman E M, Ron M, et al. Detection of a chromosomal region with two quantitative trait loci, affecting cold tolerance and fish size, in an F2 tilapia hybrid[J]. Aquaculture, 2003, 223(1-4): 117-128.

[10] 佟廣香, 匡友誼, 張超, 等. 哲羅魚生長速度相關(guān)性狀的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2012, 27(z1): 33-39.Tong Guangxiang, Kuang Youyi, Zhang Chao, et al. Identification of microsatellite markers associated with growth rate trails in[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2012, 27(z1): 33-39.

[11] 劉偉, 蘇勝彥, 董在杰, 等. 3個(gè)鯉群體的微衛(wèi)星標(biāo)記與生長性狀相關(guān)性分析[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2012, 8(3): 17-24.Liu Wei, Su Shengyan, Dong Zaijie, et al. Correlation analysis of microsatellite DNA markers with growth trait among 3 breeding populations of common carp[J].South China Fisheries Science, 2012, 8(3): 17-24.

[12] 王桂興, 劉永新, 孫效文, 等. 牙鲆微衛(wèi)星分子標(biāo)記與生長性狀的相關(guān)性分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 40(7): 77-84.Wang Guixing, Liu Yongxin, Sun Xiaowen, et al. Correlation analysis of microsatellite DNA marks with growth trait of Japanese flounder ()[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2009, 40(7): 77-84.

[13] Ma Hongyu, Chen Songlin, LiaoXiaolin, et al. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from a dinucleotide-enriched genomic library of obscure puffer () and cross-species amplification[J]. Conserv Genet, 2009, 10(4): 955-957.

[14] 古川聰史. 紅鰭東方鲀與高生長性狀有關(guān)的遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的研究[D]. 日本: 東京大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)院生命科學(xué)研究科, 2009.Guchuan Congshi. Study on the genetics and molecular biology of growth-related traits in[D].Japan: Tokyo University of Agriculture and Life Sciences, 2009.

[15] 郝君, 孫效文, 孟雪松. 紅鰭東方鲀微衛(wèi)星DNA多態(tài)性初步分析[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 15(1): 21-24.Hao Jun, Sun Xiaowen, Meng Xuesong. Analyzing the polymorphisms ofwith microsatellite[J].Journal of Shanghai Fisheries University, 2006, 15(1): 21-24.

[16] Kai W, Kikuchi K, Tohari S, et al. Integration of the genetic map and genome assembly of fugu facilitates insights into distinct features of genome evolution in teleosts and mammals[J]. Genome Biol Evol, 2011, 3: 424-442.

[17] 梁宏偉, 王長忠, 李忠, 等. 聚丙烯酰胺凝膠快速、高效銀染方法的建立[J]. 遺傳, 2008, 30(10): 1379- 1382.Liang Hongwei, Wang Changzhong, Li Zhong, et al. Improvement of the silver-stained technique of polyacrylamide gel electrophoresis[J].Hereditas, 2008, 30(10): 1379-1382.

[18] Michelmore R W, Paran I, Kesseli R V. Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proc Nati Acad Sci USA, 1991, 88(21): 9828- 9832.

[19] 陳超, 石拓, 孫曙光, 等. 應(yīng)用RAPD標(biāo)記對(duì)東方鲀屬進(jìn)行種類鑒別及其聚類分析[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2001, 22(3): 32-36.Chen Chao, Shi Tuo, Sun Shuguang, et al.Identification and phylogenetic relationships among four species of puffer fish inas determined by RAPD markers[J]. Marine Fisheries Research, 2001, 22(3): 32-36.

[20] 崔建洲, 申雪艷, 楊官品, 等. 紅鰭東方鲀基因組微衛(wèi)星特征分析[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 36(2): 249-254.Cui Jianzhou, Shen Xueyan, Yang Guanpin, et al. The analysis of simple sequence repeats ingenome[J]. Periodical of Ocean University of China, 2006, 36(2): 249-254.

[21] 王美玉, 劉海金. 半滑舌鰨生長性狀的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[J]. 海洋漁業(yè), 2012, 34(2): 121-129.Wang Meiyu, Liu Haijin. Correlation analysis between growth-related traits and microsatellite markers in half smooth tongue sole ()[J]. Marine Fisheries, 2012, 34(2): 121-129.

[22] 張?zhí)鞎r(shí), 劉萍, 李健, 等. 中國對(duì)蝦與生長性狀相關(guān)微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記的初步研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2006, 27(5): 201-209. Zhang Tianshi, Liu Ping, Li Jian, et al. Preliminary study on specific microsatellites markers related to growth trait in[J]. Marine Fisheries Research, 2006, 27(5): 201-209.

[23] 賈志武, 鄭先虎, 匡友誼, 等. 鯽微衛(wèi)星標(biāo)記與幾個(gè)生長性狀的相關(guān)性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2012, 25(6): 1-6.Jia Zhiwu, Zheng Xianhu, Kuang Youyi, et al.Correlation analysis on four growth traits in crucian carpby SSR and EST-SSR markers[J]. Chinese Journal of Fisheries, 2012, 25(6): 1-6.

[24] 傅洪拓, 萬山青, 付春鵬, 等. 青蝦生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2010, 34(5): 1043-1048.Fu Hongtuo, Wan Shanqing, Fu Chunpeng, et al.Screening of microsatellite markers associated with growth trats in[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2010, 34(5): 1043-1048.

[25] 孫國華, 楊建敏, 孫孝德, 等. 刺參微衛(wèi)星標(biāo)記與生長性狀體重、體長的相關(guān)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(4): 501-508.Sun Guohua, Yang Jianmin, Sun Xiaode, et al. Correlation analysis of microsatellite DNA markers with growth traits of body weight and length in[J]. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(4): 501-508.

[26] 吳滟, 付春鵬, 蔣速飛, 等. 中華絨螯蟹微衛(wèi)星標(biāo)記與生長性狀相關(guān)性的初步分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(2): 197-202.Wu Yan, Fu Chunpeng, Jiang Sufei, et al. Preliminary studies on the correlation between microsatellite markers and growth traits in chinese mitten crab ()[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(2): 197-202.

[27] 許可, 馬愛軍, 王新安, 等. 大菱鲆()生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[J]. 海洋與湖沼, 2009, 40(3): 577-583.Xu Ke, Ma Aijun, Wang Xinan, et al. Microsatellites molecular markers and the correlation to growth trait of[J].Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2009, 40(3): 577-583.

[28] Wang Z, Zhou J, Ye Y, et al. Genetic structure and low genetic diversity suggesting the necessity for conversation of the Chinese longsnout catfish,(Pisces: Bagriidae)[J]. Environ Biol Fish, 2006, 75(4): 455-463.

[29] Reed D R, Lawler M P, Tordoff M G, et al. Reduced body weight is a common effect of gene knockout in mice[J]. BMC Genet , 2008, 9(4): 1-6.

Screening growth-related microsatellite markers in

MA Ai-jun1, 2, ZOU Jie1, 3, SUN Jian-hua1, 3, WANG Ting1, WANG Guang-ning1, CUI Wen-xiao1, 3, WANG Xin-an1, 2, LIU Da-yong4, GUO Zheng-long4

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 4.Jiangsu Zhongyang Group Limited by Share Ltd, Nantong 226600, China)

A population ofwith significant growth differences was investigated for screening molecular markers linked to growth traits, using SSR combined with bulked segregation analysis (BSA). Two gene pools were respectively constructed using 30 DNA templates isolated fromsamples with significantly different growth rates and then amplified by 85 pairs of microsatellite primers. The unique alleles were found in 14 loci. These 60individuals were genotyped by SSRs. The results showed that loci TOP03, TOG01, fms15, and fms75 had a highly significant negative correlation with growth trait (< 0.01), while fms89 showed extremely significant positive correlation with growth trait (< 0.01). The verification test using another population of 30 randomly selectedwith significantly different growth rates indicated that only loci fms15 and fms75 were significantly correlated with growth trait, with correlation coefficients of –0.384 and –0.411, respectively. Therefore, these two microsatellite loci with a significant linkage with growth traits could be used as reference markers for marker-assisted breeding of.

; growth trait; microsatellite; correlation analysis

(本文編輯: 譚雪靜)

Sept. 17, 2015

[Jiangsu Science and Technology Support Program, No. BE2013345; Jiangsu Aquatic Three New Projects , No. Y2013-12]

S917.4

A

1000-3096(2016)10-0016-09

10.11759//hykx 20150917002

2015-09-17;

2015-12-03

江蘇省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2013345); 江蘇省水產(chǎn)三新工程資助項(xiàng)目(Y2013-12)

馬愛軍(1971-), 女, 山東榮成人, 博士, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 主要從事魚類繁育養(yǎng)殖生物學(xué)與遺傳育種研究, E-mail: maaj@ ysfri.ac.cn