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    不同鹽度條件下亞硝酸態(tài)氮與非離子氨對花鱸幼魚的毒性實驗

    2017-01-18 06:47:16黃杰斯溫海深張美昭李吉方張凱強
    海洋科學 2016年10期
    關鍵詞:排氨率花鱸耗氧率

    韓 楓, 黃杰斯, 溫海深, 張美昭, 李吉方, 張凱強, 王 偉

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    不同鹽度條件下亞硝酸態(tài)氮與非離子氨對花鱸幼魚的毒性實驗

    韓 楓, 黃杰斯, 溫海深, 張美昭, 李吉方, 張凱強, 王 偉

    (中國海洋大學水產學院, 山東青島266003)

    在水溫為25~31℃、pH 7.70~8.17、溶解氧≥5.0mg/L、自然光照的條件下, 作者采用半靜水法研究了亞硝酸態(tài)氮與非離子氨在不同鹽度條件下對花鱸(幼魚(50.33 g±4.35 g)的急性毒性、半致死量濃度、安全質量濃度及不同鹽度條件下氨氮脅迫對花鱸幼魚耗氧率與排氨率的影響。結果表明, 花鱸幼魚在鹽度0、10、20時, 亞硝酸鹽安全濃度分別為16.357、52.540、58.622 mg/L, 總氨氮安全濃度分別為0.794、4.625、5.163 mg/L, 非離子氨安全濃度分別為0.584、2.313、1.951 mg/L。實驗結果說明, 鹽度和氨氮聯合脅迫對花鱸幼魚的耗氧率、排氨率有顯著影響, 鹽度10時耗氧率和排氨率最低。

    鹽度; 花鱸()幼魚; 亞硝酸態(tài)氮; 非離子氨; 急性毒性; 安全濃度; 氨氮脅迫

    花鱸(), 又稱海鱸, 寨花等, 曾用學名, 隸屬鱸形目(Perciformes)、科(Serranidae)、花鱸屬()?;|適溫適鹽性廣, 在咸淡水、低鹽度的河口地區(qū)有生長速度快, 肉質好等特點。在高密度養(yǎng)殖條件下, 水體富營養(yǎng)化、水中無機氮含量較高、鹽度突變等因素引起病害頻發(fā)的現象日益突出, 影響了花鱸產業(yè)健康發(fā)展。養(yǎng)殖水體中無機氮主要以非離子氨、銨態(tài)氮、亞硝酸氮和硝酸鹽氮的形式存在, 其中亞硝酸態(tài)氮與非離子氨對于水生生物有著較大的毒害作用, 會抑制其生長與代謝[1-3], 是制約高密度養(yǎng)殖發(fā)展的主要因素之一。魚類對氨氮的敏感性與所處環(huán)境的鹽度相關, 水體中Na+和Ca2+的濃度會作用于鰓從而改變氨氮的通透性[4]。魚類在早期生活階段由于代謝能力相對較弱, 對環(huán)境變化較為敏感。本實驗以花鱸幼魚為實驗材料, 主要研究不同鹽度條件下亞硝酸態(tài)氮、非離子氨對花鱸幼魚的急性毒性、半致死質量濃度和安全質量濃度; 探索不同鹽度和氨氮聯合脅迫對花鱸幼魚耗氧率和排氨率的影響。通過該項研究, 查明花鱸幼魚對亞硝酸氮和非離子氨敏感性程度, 為花鱸苗種培育過程中水質調控及提高花鱸幼魚成活率提供科學依據。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗魚

    花鱸幼魚來自珠海斗門河口漁業(yè)研究所, 為人工培育的苗種。經4個月的池塘養(yǎng)殖后(鹽度0~5), 選取健康、活潑且個體大小相近(平均體質量50.33 g± 4.35 g)、發(fā)育程度相同的1 000尾幼魚暫養(yǎng)于室內玻璃鋼桶中, 并經過7 d馴化使環(huán)境鹽度逐漸從4分別降低或提高至0、10、20。穩(wěn)定后暫養(yǎng)7 d, 日投喂兩次海水魚配合飼料(粗蛋白≥41.0%), 日投喂量為體質量的4%, 每日換水100%。

    1.1.2 實驗環(huán)境條件

    實驗所需海水取自珠海近海; 淡水為珠海自來水廠供應的自來水。實驗用水由海水與充分曝氣的自來水依據所需鹽度不同按一定比例配置而成。實驗過程中水溫變化范圍為25~31℃; pH 7.70~8.17; 溶解氧≥5.0mg/L ; 實驗采用室內自然光照。

    1.1.3 實驗藥品與配置

    實驗用氯化銨 (NH4Cl) 和亞硝酸鈉 (NaNO2) 為分析純, 根據實驗所需配制成相應濃度的非離子氨、亞硝酸氮的暴露溶液。具體規(guī)格與成分見表1。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 不同鹽度下亞硝酸氮與非離子氨的急性毒性實驗

    急性毒性實驗采用半靜水法, 即每24 h更換全部實驗液。為了避免餌料成分的影響, 實驗前24 h停止投喂餌料, 實驗期間不投餌, 微充氣, 實驗在30 L水箱中進行。為了確定濃度的大致范圍, 先做預實驗, 分別找出不同鹽度條件下亞硝酸氮和非離子氨24 h的絕對致死濃度與最小致死濃度。

    表1 試劑的規(guī)格和成分

    依據預實驗所得到的24h 絕對致死濃度和最小致死濃度, 以等對數間距法設置實驗藥物濃度。鹽度0、10、20中每個鹽度每個藥物設5個濃度組和1 個對照組, 每個濃度組設3 個平行組, 每個濃度放魚8 尾。在曝露過程中觀察其行為、中毒癥狀和死亡效應。以鑷子夾取花鱸幼魚尾部無反應為死亡標準, 死亡個體及時從水中取出。

    實驗處理96 h。實驗的前8 h 連續(xù)觀察, 而后定時觀察魚的中毒癥狀, 記錄其死亡率, 實驗期間隨時撈出死亡個體。

    1.2.2 不同鹽度下氨氮脅迫對花鱸幼魚耗氧率和排氨率的影響

    實驗前48h停止投餌。呼吸代謝實驗使用聚乙烯薄膜蓋于水箱上方, 并密封, 取水采用虹吸的方式進行。實驗分為0、10、20 3個鹽度梯度, 每個鹽度設5個濃度組(0、5、10、15、20 mg/L氨氮)處理, 每個處理3個平行, 每個平行放2尾魚。另外每個濃度設置1個沒有魚的空白組。每次實驗在每日12點進行, 溫度25~31℃。實驗開始后, 先進行120 min衰減處理適應環(huán)境呼吸, 使魚恢復到正常穩(wěn)定的狀態(tài), 避免移動魚體帶來慌亂造成實驗結果誤差。衰減處理后停氧封閉呼吸室, 并虹吸取水樣, 60 min后再次虹吸取樣(根據不同鹽度、溶解氧情況, 虹吸間隔時間為30~60 min)。

    1.2.3 數據采集

    記錄各組24、48、72、96 h的死亡率, 以=(′–)/(1–)計算平均死亡率(′為實驗組死亡百分數,為對照組死亡百分數,為經校正后的死亡百分數)。采用碘量法測定溶解氧; 采用次氯酸鈉氧化法測定氨氮濃度, 參考《海水水質標準》(GB3097- 1997)[5]采用換算氨氮濃度的方式計算非離子氨濃度。

    1.3 數據分析

    運用SPSS(19.0)對96h死亡率進行回歸分析。以濃度的常用對數為橫坐標, 死亡率的概率為縱坐標, 求出概率單位與實驗液質量濃度對數的回歸方程、各藥物的半致死質量濃度(LC50)及各自的95% 可信限, 安全濃度=0.1×96hLC50。運用SPSS(19.0)對耗氧率和排氨率進行ANOVA單因素方差分析, 并進行DUNCAN多重比較, 以<0.05為有顯著性差異; 所有數據用平均數±標準差表示(MeanSD), 最后用EXCEL2013作圖。

    2 結果

    2.1 不同鹽度下亞硝酸氮對花鱸幼魚的急性毒性

    2.1.1 死亡率

    在不同鹽度條件下, 暴露于不同亞硝酸氮濃度中的花鱸幼魚96 h內的死亡率見表2。

    從表2中可知, 各鹽度組別的空白對照組中, 花鱸幼魚死亡率均為0%。同一鹽度下, 隨著暴露濃度的增加, 死亡率升高; 同一鹽度和暴露濃度下, 隨著暴露時間的延長, 死亡率增加; 鹽度、亞硝酸氮暴露濃度、亞硝酸氮暴露時間均對花鱸幼魚的死亡率有影響。進行亞硝酸氮暴露后, 花鱸幼魚出現一系列應激行為, 其中高濃度亞硝酸氮暴露組的中毒癥狀主要體現為: 運動活力降低、逐漸失去平衡; 瞳孔外圈灰色褪去, 體色發(fā)黑; 最后停止運動, 沉于箱底。

    2.1.2 半致死濃度和安全濃度

    如表3所示, 不同鹽度下亞硝酸氮對花鱸幼魚的96h LC50分別為: 鹽度0時為16.357 mg/L, 鹽度10時為52.540 mg/L, 鹽度20時為58.622 mg/L。亞硝酸氮的毒性隨著鹽度的增加而降低, 但并無線性關系?;|幼魚在鹽度0、10、20時的亞硝酸氮安全濃度分別為1.636、5.254、5.862 mg/L。因此, 在鹽度0~20時, 花鱸幼魚對亞硝酸氮的敏感性隨著鹽度的降低而升高。

    2.2 不同鹽度下非離子氨對花鱸幼魚的急性毒性

    2.2.1 死亡率

    在不同鹽度條件下, 暴露于不同氨氮濃度中的花鱸幼魚96 h內的死亡率見表4。

    表2 不同鹽度條件下亞硝酸氮對花鱸幼魚的急性毒性

    表3 不同鹽度條件下亞硝酸氮對花鱸幼魚半致死濃度LC50和安全質量濃度

    各鹽度的對照組中, 花鱸幼魚均未出現死亡。同一鹽度下, 隨著暴露濃度的增加, 死亡率升高; 同一鹽度和暴露濃度下, 隨著暴露時間的延長, 死亡率增加; 鹽度、氨氮暴露濃度、氨氮暴露時間均對花鱸幼魚的死亡率有影響。進行氨氮暴露后, 花鱸幼魚出現一系列應激行為, 其中高濃度氨氮暴露組的中毒癥狀主要體現為: 運動活力降低、逐漸失去平衡, 嘴大張、鰓蓋張開, 體色發(fā)黑, 最后呼吸減弱, 側臥于箱底。

    2.2.2 半致死濃度與安全濃度

    如表5所示, 不同鹽度下總氨氮對花鱸幼魚的96h LC50分別為: 鹽度0時為7.941 mg/L; 鹽度10時為46.254 mg/L; 鹽度20時為51.632 mg/L; 在鹽度0~20時, 總氨氮對花鱸幼魚的毒性隨著鹽度的升高而減小; 花鱸幼魚在鹽度0、10、20時的總氨氮安全濃度分別為0.794、4.625、5.163 mg/L。因此, 在鹽度0~20時, 花鱸幼魚對總氨氮的敏感性隨著鹽度的升高而降低。不同鹽度下非離子氨對花鱸幼魚的96 hLC50分別為: 鹽度0時為0.584 mg/L; 鹽度10時為2.313 mg/L; 鹽度20時為1.951 mg/L; 在鹽度0~20時, 非離子氨對花鱸幼魚的毒性隨著鹽度的升高先減小后增大; 花鱸幼魚在鹽度0、10、20時的非離子氨安全濃度分別為0.058、0.231、0.195 mg/L。因此, 在鹽度10時, 花鱸幼魚對非離子氨的敏感性最低。

    表4 不同鹽度條件下非離子氨對花鱸幼魚的急性毒性

    表5 不同鹽度條件下非離子氨對花鱸幼魚半致死濃度LC50和安全質量濃度

    2.3 不同鹽度下氨氮脅迫對花鱸幼魚耗氧率的影響

    同一鹽度條件下, 隨著氨氮濃度的增加, 耗氧率升高; 在0~15 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的耗氧率最低, 鹽度20組耗氧率最高; 在20 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的耗氧率雖低于另外兩組, 但與鹽度0組的耗氧率無顯著性差異(>0.05) (圖1)。

    數值用平均值±標準差表示, 標有不同字母的數值表示顯著差異(<0.05) , 否則表示差異不顯著(>0.05)

    Values are mean ± SD. Different letters indicate significant difference (0.05), otherwise not significantly different (0.05)

    2.4 不同鹽度下氨氮脅迫對花鱸幼魚排氨率的影響

    同一鹽度條件下, 隨著氨氮濃度的增加, 排氨率降低; 在0~10 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的排氨率最低, 鹽度20組排氨率最高; 在15~20 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的排氨率最低, 0鹽度組和20鹽度組的排氨率沒有顯著性差異(>0.05)(圖2)。

    3 討論

    3.1 不同鹽度下亞硝酸氮對花鱸幼魚的毒性影響

    本實驗中發(fā)現隨著鹽度的升高, 花鱸幼魚對于亞硝酸氮敏感性降低, 耐受度升高。高鹽度對亞硝酸鹽毒性的緩解與以往對于廣鹽性海洋魚類的研究結論相一致, 針對歐洲鰻鱺()[6]、美國紅魚()[7]、虱目魚()[8]等的研究均得出類似結論。亞硝酸氮的毒理作用為: 生物生活環(huán)境中的亞硝酸氮濃度累積到一定程度, 可進入魚體循環(huán)系統(tǒng), 氧化血紅蛋白中的Fe2+為Fe3+, 從而降低血紅蛋白運輸氧氣的能力, 進而造成組織缺氧, 嚴重至窒息死亡。當環(huán)境中鹽度較高時, Cl–濃度較高, 可以阻礙NO2-N從鰓和腸等組織中進入血液, 從而降低了NO2-N的對于生物運輸氧的影響[9-11]; 也有研究認為高鹽度中較高濃度的Ca2+也可以降低NO2-N的毒性[12]。

    數值用平均值±標準差表示, 標有不同字母的數值表示顯著差異(<0.05), 否則表示差異不顯著(>0.05)

    Values are mean ± SD. Different letters indicate significant differences (0.05), otherwise not significantly different (0.05)

    3.2 不同鹽度下非離子氨對花鱸幼魚的毒性影響

    氨氮在養(yǎng)殖水體中以離子銨(NH4+)和非離子氨(NH3)的形式存在, 兩者可以相互轉化, 其所占的比例受到壓力、溫度、鹽度、pH的影響。研究證明非離子氨(NH3)的毒性是離子銨(NH4+)的300~400倍[13], 所以氨氮的毒性作用主要是由非離子氨(NH3)引起的。非離子氨的毒理作用為: 非離子氨不帶電荷, 為脂溶性, 可通過魚的鰓細胞膜進入機體, 導致魚鰓對氣體的通透性增加, 刺激魚體興奮, 使魚發(fā)生痙攣[14]。另外環(huán)境氨氮增加會抑制魚類的氨排泄, 血液中氨氮含量增加會導致血液pH上升、對魚鰓表皮細胞以及魚類其他組織細胞造成損傷[15]; 體液中NH4+取代K+, 天冬氨酸(NMDA)受體感受器過度活化, Ca2+大量進入細胞, 導致細胞死亡[16]。

    本研究中發(fā)現花鱸幼魚在鹽度0~20時, 其對總氨氮的敏感性隨著鹽度(Na+濃度、Ca2+濃度)的升高而降低。在鹽度10時, 花鱸幼魚對非離子氨的敏感性最低。由于非離子氨在總氨氮中所占比例受到鹽度等環(huán)境因子的影響, 花鱸幼魚對總氨氮和非離子氨的敏感性出現了不同的變化規(guī)律, 在此僅對非離子氨進行討論。本研究結果與緣邊鯧鲹()[17]、北美鯧鲹()[18]中的研究結果相同, 這是因為高鹽度環(huán)境中, Na+、Ca2+濃度較高, 有利于氨氮通過鰓上NH4+_Na+離子泵排出體外[19]; 另外廣鹽性硬骨魚類, 其體液等滲點相當于鹽度10~13[20], 在接近等滲點鹽度時呼吸代謝水平相對較低, 耗氧率低、能量消耗少有利于機體在受到環(huán)境脅迫時維持自身內環(huán)境穩(wěn)定。本研究結果與機鯔()[8]、條紋鋸鮨()[20]中的研究結果不同, 可能是由于處理的鹽度過高、與等滲點鹽度差異較大, 掩蓋了滲透壓對非離子氨毒性影響(表6)。

    表6 不同魚類對亞硝酸氮和非離子氨的安全質量濃度

    3.3 不同鹽度下氨氮脅迫對花鱸幼魚耗氧率和排氨率的影響

    本實驗在不同鹽度條件下的氨氮脅迫對花鱸幼魚耗氧率和排氨率的影響中發(fā)現: 鹽度、氨氮脅迫濃度、對幼魚的耗氧率、排氨率有顯著影響; 同一鹽度條件下, 隨著氨氮濃度的增加, 耗氧率升高, 排氨率降低。

    這是因為氨氮脅迫抑制了魚類血液中氨氮向外排放, 且需要提高代謝維持體內內環(huán)境穩(wěn)定。在0~15 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的耗氧率最低, 鹽度20組耗氧率最高, 這與花鱸等滲點接近鹽度10有關, 此鹽度下花鱸可以減少因為調節(jié)滲透平衡所需要的能耗; 在20 mg/L的氨氮脅迫組中, 0鹽度組和10鹽度組的耗氧率沒有顯著性差異, 這可能是由于氨氮排放的耗氧需求逐漸增加, 抵消了10鹽度組調節(jié)滲透平衡耗氧的節(jié)余。在0~10 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的排氨率最低, 鹽度20組排氨率最高, 同樣是因為鹽度10接近花鱸的等滲點; 在15~20 mg/L的氨氮脅迫組中, 鹽度10組的排氨率最低, 0鹽度組和20鹽度組的排氨率沒有顯著性差異, 可能是15mg/L氨氮脅迫已達到鹽度0時的花鱸幼魚致死濃度, 造成花鱸幼魚代謝紊亂。本研究結果與在軍曹魚()的研究中[26]所得結論相似。

    3.4 鹽度和氨氮聯合脅迫對花鱸幼魚的影響

    本研究表明花鱸幼魚在鹽度0、10、20時, 亞硝酸鹽安全濃度分別為16.357、52.540、 58.622 mg/L; 總氨氮安全濃度分別為0.794、4.625、5.163 mg/L; 非離子氨安全濃度分別為0.584、2.313、1.951 mg/L。鹽度、氨氮脅迫濃度、均對花鱸幼魚的耗氧率、排氨率有顯著影響?;|在低鹽度的河口地區(qū)有生長速度快, 肉質好等特點, 低鹽度池塘養(yǎng)殖模式在中國南方得到廣泛推廣, 但是低鹽度水體也會導致花鱸對氨氮的敏感性增加, 特別是在雨季時, 更應該加強養(yǎng)殖水質的調控管理。

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    Toxicity of unionized ammonia and nitrite on juvenileaccording to salinity

    HAN Feng, HUANG Jie-si, WEN Hai-shen, ZHANG Mei-zhao, LI Ji-fang, ZHANG Kai-qiang, WANG Wei

    (Fisheries College, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

    The toxicity of unionized ammonia and nitrite on juvenile(weighing 50.33 ± 4.35 g) was studied at different salinity levels of 0, 10, and 20. The effects of salinity (0, 10 and 20) and ammonia exposure (0, 5, 10, 15 and 20 mg/L) on oxygen consumption and ammonia excretion of juvenilewere also evaluated.The results showed that the safe concentration values of nitrite forat salinity levels of 0, 10 and 20 were 16.357, 52.540 and 58.622 mg/L, respectively. The safe concentration values of ammonia–N (unionized plus ionized ammonia as nitrogen) forat salinity levels of 0, 10 and 20 were 0.794, 4.625 and 5.163 mg/L, respectively. The safe concentration values of ammonia–N (unionized plus ionized ammonia as nitrogen) forat salinity levels of 0, 10 and 20 were 0.584, 2.313 and 1.951 mg/L, respectively. The oxygen consumption and ammonia excretion of juvenilewere significantly affected by salinity and ammonia exposure. Oxygen consumption and ammonia excretion reached the minimum values at salinity level of 10.

    Salinity; juvenile; nitrite; unionized ammonia; acute toxicity; safe concentration; ammonia exposure

    (本文編輯: 譚雪靜)

    Sept. 20, 2015

    [Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period, No. 2011BAD13B03]

    S968.25

    A

    1000-3096(2016)10-0008-08

    10.11759//hykx20150920001

    2015-09-20;

    2016-01-07

    國家“十二五”國家科技支撐計劃重大項目課題(2011BAD13B03)

    韓楓(1992-), 男, 內蒙古通遼人, 碩士研究生, 主要從事魚類生理學研究, E-mail: hanfeng21g@foxmail.com; 溫海深, 通信作者, 教授, E-mail: wenhaishen @ouc.edu.cn

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