電針對抑郁大鼠行為學及海馬β—CaMKⅡ蛋白的影響

尹平 陳澤欽 韓栩珂 徐世芬

摘要 目的：觀察針刺對抑郁大鼠的行為學改變及作用機制。方法：將18只雄性WKY大鼠隨機分為電針組（EA）、假針組（sham EA）、模型組（model）。Wistar雄性大鼠6只設為正常組（normal）。21 d后通過糖水使用、強迫游泳實驗對大鼠進行行為學評價，用免疫熒光法檢測大鼠海馬中β-CaMKⅡ表達。結果：與正常組比較，模型組海馬β-CaMKⅡ表達和蔗糖水攝入比均明顯下降（P<0.05），強迫游泳的不動時間增加（P<0.05）。與假針組比較，電針組海馬β-CaMKⅡ表達和蔗糖水攝入比均明顯增加（P<0.05），強迫游泳的不動時間減少（P<0.05）。結論：電針對WKY抑郁模型大鼠的行為學核心癥狀有明顯的改善作用，明顯增加海馬中β-CaMKⅡ的表達，這可能是電針通過影響海馬的β-CaMKⅡ從而治療抑郁癥的機制之一。

關鍵詞 電針；抑郁癥；韁核；β-CaMKⅡ

Abstract Objective：To observe the effects of electroacupuncture（EA） on depressive-like behavior and its mechanism.Methods：Eighteen male WKY rats were randomly divided into EA，Sham，and model groups.Six Wistar rats were divided into normal group.The behaviors were evaluated by sucrose preference test and force swimming test after 21 days，and the expression of β-CaMKⅡ was detected by immunofluorescence.Results：Compared with the control group，the level of β-CaMKⅡ expression of hippocampus in the model group decreased significantly along with Sucrose preference test（P<0.05）.Meanwhile，immobile time of force swimming test increased significantly （P<0.05）.Compared with sham group，EA group increased significantly in the β-CaMKⅡ expression of hippocampus and sucrose preference test （P<0.05），and decreased significantly in immobile time of force swimming test（P<0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can improve the WKY rats′ depressive-like behaviors and the expression of β-CaMKⅡ protein in hippocampus.This might be one of the mechanisms of Electroacupuncture on depression which is mediated by hippocampus.

Key Words Electroacupuncture； Depression； Hippocampus； β-CaMKⅡ

中圖分類號：R245.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.037

抑郁癥是一種以悲傷、內(nèi)疚、興趣減弱、快感缺失等多種軀體心理癥狀為表現(xiàn)的嚴重精神障礙性疾病，嚴重者有自殺傾向[1]。研究顯示，抑郁癥的發(fā)病在世界范圍內(nèi)逐年上升，帶來的巨大的經(jīng)濟和精神心理負擔給家庭和社會造成了巨大的影響[2]。抑郁癥病因復雜而多樣，可能與基因、心理及周圍環(huán)境等多種因素共同作用而相關[3]。經(jīng)典的抗抑郁藥物使用普遍，但仍具有作用效果延遲、藥物使用依賴、治療效果不確定性等缺點[4]。傳統(tǒng)病理生理學分子機制認為抑郁癥主要與大腦內(nèi)的單胺能神經(jīng)遞質在腦內(nèi)的水平失衡相關，近年來另外一種神經(jīng)可塑性假說受到了越來越多的認可[5]。該假說認為韁核中β-CaMKⅡ在抑郁癥發(fā)病機制中起到了關鍵的作用，長期的負面情緒對包括韁核、海馬在內(nèi)的與獎賞情緒相關的神經(jīng)環(huán)路造成可塑性的變化，從而加重抑郁癥狀[6]。針灸在調治精神疾患的使用已具有上千年的歷史，且療效顯著易于推廣[7]。電針治療后對海馬β-CaMKⅡ的研究尚少，我們在本實驗旨在觀察電針后海馬活性的改變，從而探討電針治療抑郁癥的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

4周齡Wistar和Wistar Kyoto（WKY）SPF級雄性大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：SCXK（京）2012-0001。動物購進后適應性喂養(yǎng)1周，自由攝食飲水，12 h晝夜循環(huán)，室溫（22±2）℃，相對濕度為50%～60%。

1.1.2 試劑與儀器

蔗糖，購于Sigma公司。5%蔗糖水溶液：蔗糖100 g溶于蒸餾水中，定容至2L；異氟烷，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；4%多聚甲醛，上海元象醫(yī)療器械有限公司；一抗，novus公司NB600-1428，1：50；熒光二抗，488-山羊抗小鼠，谷歌生物GB25301；二甲苯，國藥集團化學制劑有限公司；DAPI，谷歌生物，G1012；抗熒光淬滅封片劑，谷歌生物，G1401；G6805_1A電針治療儀購于上海華誼醫(yī)用儀器廠；強迫游泳實驗系統(tǒng)購于上海移數(shù)信息科技有限公司；包埋機，武漢俊杰電子有限公司，JB-P5；倒置熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)，日本尼康，Nikon Eclipse Ti-SR/Nikon DS-U3。

1.2 方法

1.2.1 分組與操作 18只WKY大鼠隨機分至電針組、假針組和模型組；Wistar大鼠6只設為正常組。并記錄初始體重。正常組、模型組常規(guī)飼養(yǎng)，不予治療。

電針組：WKY大鼠8只，適應性喂養(yǎng)1周。根據(jù)《實驗動物針灸穴位圖譜》選取大鼠“百會”“印堂”穴為治療穴位。將電針治療儀導線的正負極兩端露出銅絲并纏繞于0.25 mm×25 mm—次性不銹鋼毫針上，膠布固定。在透明儲物盒底部鉆3個直徑約為1 cm的小孔，與導線相連的毫針通過其中一個孔，另外2個小孔為通氣孔。治療時，將大鼠置于實驗臺上，分別刺入百會，印堂穴約5 mm，膠布固定針灸針。將事先準備好的透明儲物盒蓋住大鼠后，采用電針儀，頻率設置為2Hz連續(xù)波電，電流強度根據(jù)大鼠的耐受情況調整，即頭部出現(xiàn)顫動并且不嘶叫為度，從0.1 mA開始依次逐漸加大，每次治療15 min，共3周。治療過程中，注意觀察大鼠是否要將針灸針剝掉，如有上述情況，可輕輕拍打儲物盒，轉移大鼠注意力。另外，保持整個實驗環(huán)境的安靜，避免聲音或動作過大造成大鼠恐慌。

假針組：WKY大鼠6只，適應性喂養(yǎng)1周。采用與電針組同樣的抓取方法，將同型號針灸針刺入大鼠百會、印堂體表，針灸針與導線相連，不通電。留針時間與治療時間均同電針組。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 糖水偏好實驗（Sucrose Preference Test，SPT）

正式實驗前48 h，訓練大鼠適應含糖飲水。第一個24 h，每籠均放置2個水瓶，其中1瓶為5%蔗糖水150 mL，另一瓶為純水150 mL。隨后24 h，禁食禁水。正式實驗時，給予大鼠5%蔗糖水和純水各150 mL，12 h后兩瓶水的位置進行調換，24 h后根據(jù)每只大鼠的糖水和純水的飲用量來分別得出糖水喜好比。計算公式為：[（糖水飲用量）/（糖水飲用量）+（純水飲用量）]×100%[8]。

1.2.2.2 強迫游泳實驗（Force Swimming Test，F(xiàn)ST）

強迫游泳實驗裝置為高40 cm，直徑30 cm的透明丙稀酰胺樹脂材料圓桶。將大鼠置于水溫為23～25 ℃，水位32 cm的圓桶中，保證大鼠后肢不能觸及圓桶底部。實驗第一天對全部大鼠進行15 min預游，結束后擦干繼續(xù)飼養(yǎng)。24 h后進行5 min的強迫游泳測試，記錄并分析不動時間（漂于水面，不動或微小動作時間）。每只大鼠測試結束后需重新?lián)Q干凈的水，避免遺留糞便及氣味對下一只大鼠測試造成干擾。

1.2.2.3 免疫熒光（Immunofluorescence）

行為學試驗后麻醉、開胸，經(jīng)左心室冷藏生理鹽水沖洗至兩肺變白后，4%多聚甲醛灌流固定，取腦后石蠟包埋，修整切片（6um）。之后操作如下：

1）石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-5%乙醇5 min-蒸餾水洗。2）抗原修復：置于檸檬酸抗原修復緩沖液（pH6.0）中修復。中火8 min，停火8 min，轉中低火7 min。冷卻后置于PBS（pH7.4）中晃動洗滌5 min×3次。3）BSA封閉：滴加3%BSA室溫封閉30 min。4）加一抗?jié)窈袃?nèi)4 ℃孵育過夜。5）加二抗，晃動洗滌5 min×3次。滴加二抗避光室溫孵育50 min。6）DAPI復染細胞核，晃動洗滌5 min×3次。滴加DAPI染液避光室溫孵育10 min。7）封片：晃動洗滌5 min×3次用抗熒光淬滅封片劑封片。8）鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm；FITC紅光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm）。DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，β-CaMKⅡ陽性表達為相應熒光素標記的紅光。在顯微鏡下記錄陽性表達個數(shù)，每只大鼠選取5張切片，每個切片選取3個視野，取其平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析處理。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較用LSD法。所有統(tǒng)計結果均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電針對各組大鼠蔗糖水喜好比的影響 電針組與假針組比較，喜好率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；模型組、假針組與正常組比較喜好率明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。表示W(wǎng)KY鼠蔗糖水喜好率低于正常大鼠，可代表為興趣缺失的表現(xiàn)，電針可改善抑郁模型大鼠興趣缺失的癥狀。見表1。

2.2 電針對各組大鼠強迫游泳實驗的影響 電針組與假針組比較，強迫游泳的不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），模型組與正常組比較不動時間顯著增大，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。WKY大鼠在強迫游泳中的不動時間越長，表明求生欲望越低，其抑郁癥狀越明顯，該數(shù)據(jù)表明與正常組比較，WKY大鼠抑郁癥狀明顯，經(jīng)電針治療后，可減少WKY大鼠強迫游泳中不動時間，改善抑郁癥狀。見表2。

2.3 電針對β-CaMKⅡ免疫熒光技術的檢測 免疫熒光檢測結果顯示，圖中箭頭所指色的圓圈樣表達為β-CaMKⅡ的陽性表達，藍色為細胞核的顯像，由上至下分別為電針組、假針組、模型組和正常組；由左至右分別為單β-CaMKⅡ的陽性表達、單細胞核表達和β-CaMKⅡ與細胞核融合圖。電針組與假針組比較，海馬中β-CaMKⅡ陽性表達個數(shù)明顯增加（P<0.05），模型組與正常組比較β-CaMKⅡ陽性表達數(shù)減少（P<0.01）。β-CaMKⅡ在WKY大鼠海馬中表達越高，說明海馬的突觸可塑性傳遞活性越強，其抑郁癥狀越輕，該數(shù)據(jù)表明與正常組比較，WKY大鼠海馬活性較低，經(jīng)電針治療后，可增加海馬核中β-CaMKⅡ的表達，改變海馬活性，改善抑郁癥狀。見圖1。

3 討論

抑郁癥在中醫(yī)屬于“郁病”“癲病”“百合病”等病癥范疇。中醫(yī)認為情志是抑郁癥的重要致病原因，但是否發(fā)病與情志刺激的強度、持續(xù)時間和體質狀況有密切聯(lián)系。此病位在腦，與心、肝、腎等多個臟腑有關。“病變在腦，首取督脈[9]”，治療應以督脈的穴位為主來醒腦開竅、化郁開結、暢達情志。督脈與腦的關系密不可分，在治療抑郁癥中起著重要的作用。百會為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰肝經(jīng)之會，位于頭頂之顛，有醒腦開竅，升提陽氣之功，是寧心安神、定驚益智的要穴。《針灸大成》云：“主心煩悶，驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚?！庇√脼榻?jīng)外奇穴，是督脈在前額所過之處，為調神清腦、疏通腦絡的要穴，兩穴相配伍可增強治療情志疾患的療效，而且可以減少多個穴位在治療中產(chǎn)生的不確定性。本課題組長期應用此二穴于抑郁癥的治療，不僅起效快、無不良反應，還可以有效改善飲食、消化、運動等多系統(tǒng)伴發(fā)紊亂的癥狀[10]。

WKY抑郁模型大鼠模擬了抑郁癥患者的核心臨床癥狀，被廣泛應用于機制和療效研究[11]。本實驗中WKY大鼠明顯處于抑郁狀態(tài)，與正常大鼠SPT和FST中活動性的測試均可體現(xiàn)出興趣降低、快感缺失等特點，證明該模型符合抑郁模型成功的評判標準。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，電針可明顯的改善抑郁大鼠行為學癥狀，可以增加大鼠對蔗糖水的攝入量，減少大鼠在強迫游泳中的不動時間，多方面改善大鼠的抑郁行為學表現(xiàn)。而這種電針對行為學的作用，可能是通過調節(jié)海馬的β-CaMKⅡ而實現(xiàn)的。

關于抑郁癥的發(fā)病機制，傳統(tǒng)經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質學說認為是由于腦內(nèi)去單胺類神經(jīng)遞質功能紊亂而造成的，然而此學說并不能完全解釋抑郁癥的機制，且在其指導下的用藥也有局限性。Li[6]等發(fā)現(xiàn)韁核中β-CaMKⅡ的過度表達可增加突出傳遞效率和抑郁樣核心癥狀，通過干預下調其表達后，則動物的抑郁癥狀發(fā)生了逆轉。在臨床的突破性治療中也證實了韁核在其中的作用[12]。他在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單胺類神經(jīng)調節(jié)中有著關鍵的作用，是連接前腦邊緣系統(tǒng)和中腦單胺中心的中心樞紐[13]。刺激韁核能抑制5-羥色胺能中心中縫背核及中縫核（Dorsal Raphe Nucleus，DRN）和多巴胺能中心腹側被蓋區(qū)（Ventral Tegmental Area，VTA）的神經(jīng)元活動[14-15]，對下游海馬也起到直接和間接的抑制作用。電針干預后，通過影響韁核的活性，使韁核的活性降低，繼而減少對下游腹側被蓋區(qū)、中縫核和中縫背核、海馬等核團的抑制，從而相繼增加了β-CaMKⅡ在海馬中的表達，改善海馬突觸活性[16]，增加遞質的釋放而起到治療作用。多年的研究表明，針刺改善抑郁癥的機制是多靶向的復合作用[17]，但進一步深入研究韁核-海馬關系在電針治療抑郁癥中具有著深刻的意義。

參考文獻

[1]Dennis Cl A K.Interventions（other than pharmacological，psychosocial or psychological）for treating antenatal depression[Z].The Cochrane Library：The Cochrane Collaboration，2009.

[2]Tanahashi N，Takagi K，Amagasu N，et al.Effect of acupuncture stimulation on rats with depression induced by water-immersion stress[J].NEUROSCI LETT，2016，618：99-103.

[3]Lawson R P，Nord C L，Seymour B，et al.Disrupted habenula function in major depression[J].2016.

[4]H M.Evaluation of Outcomes With Citalopram for Depression Using Measurement-Based Care in STAR*D：Implications for Clinical Practice[Z].Am J Psychiatry，2006：28-40.

[5]Nissen C，Holz J，Blechert J，et al.Learning as a Model for Neural Plasticity in Major Depression[J].BIOL PSYCHIAT，2010，68（6）：544-552.

[6]Li K，Zhou T，Liao L，et al.CaMKII in Lateral Habenula Mediates Core Symptoms of Depression[J].SCIENCE，2013，341（6149）：1016-1020.

[7]紀倩，李志剛，唐銀杉，等.不同電針刺激對慢性應激抑郁模型大鼠行為學及海馬谷氨酸轉運體的影響[J].針刺研究，2013，38（3）：202-207.

[8]Xu J，She Y，Su N，et al.Effects of Electroacupuncture on Chronic Unpredictable Mild Stress Rats Depression-Like Behavior and Expression of p-ERK/ERK and p-P38/P38[J].EVID-BASED COMPL ALT，2015，2015：1-8.

[9]徐世芬.抑郁癥發(fā)病機制及其針刺干預的研究進展[J].針灸臨床雜志，2007，23（6）：51-54.

[10]徐世芬，莊禮興，唐純志.針刺對抑郁大鼠行為學及神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：3137-3138.

[11]She Y，Xu J，Duan Y，et al.Possible antidepressant effects and mechanism of electroacupuncture in behaviors and hippocampal synaptic plasticity in a depression rat model[J].BRAIN RES，2015，1629：291-297.

[12]Karl Kiening P K F H.Remission of Major Depression Under Deep Brain Stimulation of the Lateral Habenula in a Therapy-Refractory Patient[J].BIOL PSYCHIAT，2010（67）：e9-e11.

[13]Li B.Synaptic potentiation onto habenula neurons in learned helplessness model of depression[J].NATURE，2011，7335（470）：535-539.

[14]Yang L，Hu B，Xia Y，et al.Lateral habenula lesions improve the behavioral response in depressed rats via increasing the serotonin level in dorsal raphe nucleus[J].BEHAV BRAIN RES，2008，188（1）：84-90.

[15]Heldt S A，Ressler K J.Lesions of the habenula produce stress-and dopamine-dependent alterations in prepulse inhibition and locomotion[J].BRAIN RES，2006（1073/1074）：229-239.

[16]Mao L M，Jin D Z，Xue B，et al.Phosphorylation and regulation of glutamate receptors by CaMKII[J].Sheng Li Xue Bao，2014，66（3）：365-372.

[17]Liang J，Lu J，Cui S，et al.Effect of acupuncture on expression of brain-derived neurotrophic factor gene and protein in frontal cortex and hippocampus of depression rats[J].Zhen ci yan jiu=Acupuncture research，2012，37（1）：20-24.