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    豬胞內(nèi)勞森氏菌lscN基因的克隆及序列分析

    2017-12-28 20:09:38張敏尹會方屠晶
    湖北畜牧獸醫(yī) 2017年12期

    張敏+尹會方+屠晶

    摘要:胞內(nèi)勞森氏菌是豬增生性腸炎的病原,試驗設(shè)計4條引物,采用半巢式PCR從目的DNA中擴(kuò)增出1 317 bp的胞內(nèi)勞森氏菌lscN基因,并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明,lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%,是勞森氏菌三型分泌系統(tǒng)組件的編碼基因。

    關(guān)鍵詞:胞內(nèi)勞森氏菌;三型分泌系統(tǒng);PCR

    中圖分類號:Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1007-273X(2017)12-0010-02

    豬增生性腸炎(Porcine proliferative enteropathy,PPE)是由勞森氏菌(Lawsonia intracellularis,Li)感染引起的豬接觸性腸道傳染病[1]。該病主要發(fā)生在6~20周齡斷奶豬,育成豬也可感染,引起頑固性腹瀉,嚴(yán)重降低飼料轉(zhuǎn)化率,導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)受到經(jīng)濟(jì)損失[2]。三型分泌系統(tǒng)(Type Three Secretion System,TTSS)是一種跨細(xì)菌內(nèi)外膜、細(xì)胞外空間和宿主細(xì)胞膜的蛋白運(yùn)輸裝置,在革蘭氏陰性菌中廣泛存在,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在TTSS的致病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等[3]。英國學(xué)者David G.E. Smith 在2009年運(yùn)用染色體步移技術(shù)在Li分離株中鑒定到編碼TTSS的基因區(qū)域,其中l(wèi)scN是為效應(yīng)蛋白跨膜提供能量的ATP酶[4],因此,本試驗對lscN進(jìn)行克隆及序列分析,為后續(xù)LscN蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、GoldenView、瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司;Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培養(yǎng)基由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系提供。

    1.1.2 引物 從GenBank中下載lscN(LI_RS02940)的序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,引物由上海華津生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR擴(kuò)增 采用巢式PCR擴(kuò)增目的片段。第一重PCR反應(yīng)體系為:2×PCR LA Mix 12.5 μL,引物1、2各1 μL (10 pmol/L),模板DNA 1 μL,加滅菌超純水至25 μL;PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性40 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。第二重PCR反應(yīng)體系為:2×PCR LA Mix 12.5 μL,引物3、4各1 μL (10 pmol/L),第一重PCR產(chǎn)物1 μL(100倍稀釋),加滅菌超純水至25 μL;PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性40 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。同時設(shè)立空白對照。取第二重PCR產(chǎn)物5 μL加入上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后,用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

    1.2.2 PCR產(chǎn)物回收 將余下的20 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下,放入干凈的離心管中稱重。向膠塊中加入3倍體積Buffer G,50 ℃水浴10 min,其間溫和地上下顛倒數(shù)次。然后加入1倍體積異丙醇,上下顛倒混勻。向已裝入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S,12 000 r/min離心2 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。將前面得到的溶液加入到吸附柱中,室溫放置2 min,12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G,12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W,12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中,空離2 min。將吸附柱放入1.5 mL離心管中,在吸附膜中央加入10 μL Buffer B,室溫靜置1~2 min,12 000 r/min離心1 min,回收得到目的片段。

    1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆T載體 取回收目的片段7 μL,pMD18-T載體0.5 μL,T4 DNA ligase 1.5 μL,T4 DNA ligase buffer 1 μL,4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物5 μL,DH5α 50 μL加入1.5 mL離心管,冰浴30 min,然后42 ℃水浴90 s,接著再冰浴2 min,加入1 mL SOC,搖床振蕩培養(yǎng)45 min,吸取200 μL培養(yǎng)液涂布100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,然后挑菌,PCR鑒定。

    1.2.4 基因測序與序列分析 將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),送上海華津生物科技有限公司測序。對測序獲得的序列進(jìn)行同源性比較分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的片段擴(kuò)增結(jié)果

    采用巢式PCR擴(kuò)增目的片段。第一重PCR擴(kuò)增得到1 517 bp產(chǎn)物,第二重PCR擴(kuò)增得到1 317 bp產(chǎn)物(圖1),結(jié)果與預(yù)期相符。

    2.2 目的片段克隆T載體結(jié)果

    目的片段連接T載體后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)過夜,細(xì)菌生長情況見圖2。

    挑取8個單菌落轉(zhuǎn)接100 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基,PCR鑒定結(jié)果見圖3。1~3、5~8號菌均為陽性克隆。

    2.3 目的片段測序結(jié)果與序列分析

    采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具,將lscN與GenBank中的序列進(jìn)行比較,結(jié)果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%(圖4)。endprint

    3 小結(jié)與討論

    增生性腸炎以回腸炎和結(jié)腸隱窩未成熟細(xì)胞腺瘤樣增生為特征,引起飼料轉(zhuǎn)化率低下,豬只生長遲緩,很大程度上影響生豬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。勞森氏菌是增生性腸炎的致病菌,該菌專性細(xì)胞內(nèi)生長,微需氧,生長要求苛刻。因此,許多分子生物學(xué)技術(shù)難于應(yīng)用其上,相關(guān)研究十分有限,目前研究主要集中于運(yùn)用各種測序技術(shù)尋找在勞森氏菌致病性中發(fā)揮作用的基因或蛋白。英國學(xué)者David G.E. Smith 在2009年運(yùn)用染色體步移技術(shù)在其分離株LR189/5/83中鑒定到編碼三型分泌系統(tǒng)的基因區(qū)域,發(fā)現(xiàn)與耶爾森氏菌yscN、yscO、yscQ高度同源的基因lscN、lscO、lscQ,然而卻未見后續(xù)報道。

    TTSS與許多革蘭氏陰性菌毒力因子分泌有關(guān),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在TTSS的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等。大腸桿菌通過TTSS改變宿主離子通道,傳遞效應(yīng)蛋白Tir、EspF、Map、EspG1、EspG2到宿主細(xì)胞中發(fā)揮毒力作用;沙門氏菌和志賀氏菌通過TTSS入侵宿主,影響宿主膜泡運(yùn)輸[5]。耶爾森氏菌YscN蛋白為ATPase,在識別底物和啟動酶反應(yīng)中起作用,為伴侶蛋白綁定效應(yīng)蛋白提供能量[6]。YscO在大腸桿菌上的同源物EscO有穩(wěn)定EscN結(jié)構(gòu),刺激ATPase活化的作用[7],YscO并不發(fā)揮這樣的作用,而是識別與其綁定配體的保守基團(tuán)[8]。YscQ是TTSS注射小體內(nèi)環(huán)組件,由yscQ翻譯的兩個蛋白組成,可容納YscN。因此推測Li的LscN、LscO、LscQ有相似作用,故本試驗對lscN克隆測序,為后續(xù)蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

    目前,歐美報道的豬勞森氏菌分離株有PHE/MN1-00(美國)、NWumn05(美國)、VPB4(美國)、GB106(美國)、DBumn06(美國)、D15540(丹麥)、PHE-BR(巴西)、963/3(英國)、916/91(英國)、LR189/5/83(英國)等。GenBank中報道全基因組序列的僅有PHE/MN1-00和N343兩株。采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具,將擴(kuò)增到的lscN與GenBank中的序列進(jìn)行比較,結(jié)果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%,說明該基因保守性較高。

    參考文獻(xiàn):

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