豬乙型腦炎（HW1株）細(xì)胞滅活疫苗免疫抗體水平分析

周丹娜+段正贏+李文浩+郭銳+楊克禮+袁芳艷+劉澤文+劉威+陳文杰+孟麗+田永祥

摘要：為評估豬乙型腦炎（HW1株）細(xì)胞滅活疫苗的免疫原性，用商品化的乙型腦炎鼠腦疫苗、乙型腦炎弱毒疫苗（SA14-14-2株）以及自制乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗（HW1株）分別免疫仔豬，通過抗體水平監(jiān)測試驗、中和抗體試驗、小鼠攻毒保護(hù)試驗分別檢測了其特異性抗體消長情況、中和抗體效價產(chǎn)生情況及疫苗對小鼠的攻毒保護(hù)率。結(jié)果顯示，3種疫苗均能產(chǎn)生中和抗體，乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗免疫組中和抗體水平要高于鼠腦疫苗和弱毒疫苗免疫組，乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗和弱毒疫苗免疫組對小鼠的攻毒保護(hù)率高于鼠腦疫苗免疫組，但兩者之間差異不顯著。抗體消長情況顯示，至8周觀測期結(jié)束，鼠腦疫苗免疫組的抗體陽性率為80%，乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗和弱毒疫苗免疫組抗體陽性率為100%。結(jié)果表明豬乙型腦炎（HW1株）細(xì)胞滅活疫苗的免疫原性優(yōu)于鼠腦滅活疫苗和弱毒疫苗。

關(guān)鍵詞：豬乙型腦炎病毒；滅活疫苗；細(xì)胞；免疫

中圖分類號：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）12-0005-02

日本腦炎病毒（Japanese encephalitis vrus， JEV）是一種危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病原，可引起人類腦炎，平均死亡率高達(dá)20%，而幸存者中約有57%～68%留有不同程度的后遺癥[1]。全球每年感染JEV人數(shù)超過1 000萬人，亞洲每年乙型腦炎（JE）病例有5萬多人，而我國是JE發(fā)病最多的國家，占全世界當(dāng)年總發(fā)病人數(shù)的80%以上，因此JE是我國公共衛(wèi)生的重要問題之一[1]。據(jù)調(diào)查我國豬群JE陽性率為18.12%～46.68%，不同地域流行存在差異[2]。JEV對豬的致死率不高，主要引起繁殖障礙性疫病，但豬是JEV的主要增殖宿主和傳染源。我國豬的飼養(yǎng)數(shù)量大、更新快，JEV容易通過豬-蚊-豬的循環(huán)擴(kuò)大病毒的傳播，預(yù)防和控制豬的感染和滅蚊是防止人患JE的重要措施。我國豬用乙型腦炎疫苗現(xiàn)有SA14-14-2株減毒活疫苗和HW1株鼠腦滅活疫苗。豬感染JEV后會出現(xiàn)較高的毒血癥，雖然已有報道SA14-14-2株穩(wěn)定性較好，但主要毒力蛋白上依然有回復(fù)突變可能[3]，且SA14-14-2可在三帶喙庫蚊體內(nèi)繁殖[4]，該毒株對乙型腦炎的流行與傳播的影響尚不清楚。而鼠腦滅活疫苗抗原成分較為復(fù)雜，副反應(yīng)較大。因此，研究更為安全、穩(wěn)定的JE疫苗是防治該病的主要方向。本研究選擇免疫保護(hù)性較好的乙型腦炎HW1株，用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來代替鼠腦增殖，制備了一批滅活疫苗，并對比了商品化的乙型腦炎鼠腦疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）以及自制乙型腦炎細(xì)胞滅活苗（HW1株）的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

乙型腦炎病毒HW1株、BHK21均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；20只15 kg左右的仔豬購自武漢某豬場。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、青、鏈霉素購自GIBCO公司；水包油相佐劑SDA-25購自賽德奧生物科技（北京）有限公司；豬乙型腦炎油乳劑滅活疫苗購自武漢中博生物股份有限公司；豬乙型腦炎減毒活疫苗、豬乙型腦炎抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病毒增殖 采用細(xì)胞懸浮技術(shù)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞至其密度為3×107個/mL。用DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒至TCID50=107/mL，將病毒液與細(xì)胞懸液按1∶10的體積混合，經(jīng)48 h懸浮培養(yǎng)后收獲培養(yǎng)液，反復(fù)凍融2次后，離心取上清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒TCID50的測定 準(zhǔn)備長滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板，將待檢病JEV毒液用DMEM培養(yǎng)基做10倍梯度稀釋至10-5～10-10，每個稀釋度接種8個孔，每孔100 μL，并設(shè)立陰性對照孔。觀察記錄細(xì)胞病變情況，計算各稀釋度病變細(xì)胞孔的百分率。按Reed-Muench法計算待測病毒的TCID50。

1.3.3 乙型腦炎滅活疫苗的制備 將制苗用病毒液按體積加入0.2%甲醛溶液，37 ℃滅活48 h。將滅菌處理的SDA-25佐劑與病毒液按體積比1∶3乳化30 min，乳化結(jié)束前加入1%硫柳汞，定量分裝，加蓋密封，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 仔豬免疫試驗 將20只JEV抗體為陰性仔豬隨機(jī)分為4組，每組5只。分別接種乙型腦炎鼠腦疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）、自制乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗（HW1株）以及PBS。商品化疫苗按疫苗說明書進(jìn)行免疫，自制疫苗每只肌注2 mL，首免14 d后同等劑量加強(qiáng)免疫一次。所有仔豬于首免后的1、2、3、4、5、6、7、8周無菌采血，分離血清，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 免疫抗體水平檢測 使用乙腦抗體檢測試劑盒檢測血清抗體，并使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同免疫組陽性峰值血清進(jìn)行血清中和效價的檢測，具體方法為：將JEV病毒稀釋為200 TCID50，待檢血清補(bǔ)體滅活后倍比稀釋至2-2～2-8，將病毒與不同稀釋度的待檢血清等量混合，置于37 ℃作用60 min。每個稀釋度接種6個孔，觀察并記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按Reed-Muench法計算半數(shù)保護(hù)量（PD50），然后計算待檢血清的中和效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒毒價測定

在BHK21懸浮細(xì)胞上進(jìn)行HW1株的增殖，連續(xù)傳5次，其TCID50分別為106.9/mL、107.1/mL、107.5/mL、107.4/mL和107.3/mL，毒價穩(wěn)定，可用于配制疫苗。

2.2 仔豬血清乙型腦炎抗體檢測及抗體消長情況

乙型腦炎弱毒疫苗免疫組在免疫1周以后抗體轉(zhuǎn)陽，鼠腦滅活疫苗和細(xì)胞滅活疫苗免疫組均在免疫后第2周抗體轉(zhuǎn)陽。鼠腦滅活疫苗在隨后的抗體監(jiān)測結(jié)果與未免疫組差異不顯著。弱毒疫苗組和細(xì)胞滅活疫苗組分別在第2周和第3周出現(xiàn)抗體峰值，隨后逐周下降，但直至第8周抗體水平仍然呈陽性（圖1）。endprint

2.3 血清中和試驗

血清中和試驗結(jié)果（圖2）顯示，鼠腦滅活疫苗組、弱毒疫苗組和細(xì)胞滅活疫苗組的平均中和效價分別為1∶4、1∶22和1∶107。細(xì)胞滅活疫苗組高于陰性對照組、鼠腦滅活疫苗組和弱毒疫苗組，且差異均極顯著（P<0.01）。

3 小結(jié)與討論

目前我國豬乙型腦炎病主要采用弱毒活疫苗（SA14-14-2株）來進(jìn)行預(yù)防控制，圍繞該毒株也進(jìn)行了不少類型疫苗的研制與探索[5，6]，但該疫苗毒株源于人用疫苗毒株，且能在中間宿主蚊子體內(nèi)增殖，雖然尚無該毒株反強(qiáng)的報道，但廣泛地應(yīng)用在豬乙型腦炎病的防控中是存在一定風(fēng)險的。

本研究對比了乙型腦炎鼠腦滅活疫苗（HW1株）、弱毒疫苗（SA14-14-2株）和自制細(xì)胞滅活疫苗（HW1株）對仔豬的免疫效果。從IgG抗體水平檢測以及血清中和試驗的結(jié)果來看，自制細(xì)胞滅活疫苗的免疫效果要優(yōu)于鼠腦滅活疫苗（HW1株）和弱毒疫苗（SA14-14-2株），且免疫保護(hù)期與弱毒疫苗相當(dāng)?？紤]到弱毒疫苗除激活體液免疫產(chǎn)生中和抗體外，還能引起機(jī)體的細(xì)胞免疫，下一步將開展動物攻毒保護(hù)試驗，進(jìn)一步評價豬乙型腦炎（HW1株）細(xì)胞滅活疫苗免疫效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] RUPINFERJEET K，MANISH R，SUDHANSHU V. Immunogenicity in mice of cationic microparticle-adsorbed plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein[J].Vaccine， 2004，22（8）：2776-2782.

[2] 范 煜，曹瑞兵，陳溥言.2014年我國不同生態(tài)地區(qū)豬乙型腦炎野毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2014年學(xué)術(shù)年會論文集[C].廣州：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2014.

[3] 許樂燕，徐聞青，徐帆洪，等.乙型腦炎病毒SA-（14）-14-2減毒疫苗株的生物學(xué)和基因穩(wěn)定性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2008（10）：833-837.

[4] 馮 云，張海林，俞永新，等.三帶喙庫蚊胸腔接種乙型腦炎減毒活疫苗病毒的感染動態(tài)及致病力觀察[J].中國人獸共患病學(xué)報， 2007（3）：278-281.

[5] 李自力，陳煥春，徐高原，等.表達(dá)乙腦病毒PrM基因重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38（1）：53-58.

[6] 王曉杜，趙凡凡，代 兵，等.豬日本乙型腦炎病毒DNA復(fù)制子載體的構(gòu)建及外源基因表達(dá)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2015，46（1）：111-118.endprint