多糖碳點(diǎn)的制備及降血糖活性研究

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

·藥學(xué)·

多糖碳點(diǎn)的制備及降血糖活性研究

王書(shū)生，邵太麗

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

目的：：研究牛蒡多糖碳點(diǎn)(CDs)的制備及降血糖活性。方法從牛蒡根中提取多糖(分子質(zhì)量約4500 u)，以該多糖和枸櫞酸為碳源，280℃下反應(yīng)30 min為CDs，通過(guò)體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)，體內(nèi)對(duì)高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠血糖水平試驗(yàn)研究其降血糖活性。結(jié)果體外抑制試驗(yàn)結(jié)果表明CDs濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到89.24%;體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠治療42 d后，CDs組血糖為14.12 mmol /L，低于模型組的16.26 mmol /L。結(jié)論CDs具有較強(qiáng)的抑制葡萄糖苷酶活性，可降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，為進(jìn)一步研究其體內(nèi)降血糖機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

碳點(diǎn)；α-葡萄糖苷酶抑制活性；降血糖活性

糖尿病(diabetes mellitus，DM) 是嚴(yán)重威脅人們健康的慢性疾病之一[1]。臨床上降糖藥物主要是化學(xué)藥物，其效果好、見(jiàn)效快，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生抗藥性和繼發(fā)性失效，并伴隨肝毒性、腎毒性及血糖波動(dòng)頻繁等不良反應(yīng)，于是研究人員把目光投向了療效好、毒性低的植物上[2]。牛蒡根含有多糖類(lèi)物質(zhì)，具有明顯的降血糖等活性[3-7]，由于水提取多糖結(jié)構(gòu)不唯一，因此大多數(shù)提取的多糖分子量雖然相當(dāng)，但卻沒(méi)有活性。熒光碳量子點(diǎn)自2004年報(bào)道以來(lái)，以其抗光漂白，生物相容性好，水溶性好，易功能化等優(yōu)勢(shì)，在生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)研究中顯示出極大的應(yīng)用潛力[8-11]。本研究從牛蒡根中提取純化得到牛蒡多糖，牛蒡多糖和枸櫞酸在高溫下反應(yīng)得碳點(diǎn)(carbon dots，CDs)，研究CDs體外抑制ɑ-葡萄糖苷酶活性，以及降低鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠的血糖水平活性，為進(jìn)一步研究該CDs的體內(nèi)降血糖活性提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑 實(shí)驗(yàn)所用水為超純水，試劑均為分析純。4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside, PNPG)、α-葡萄糖苷酶(Sigma)、阿卡波糖(Acarbose)(Sigma)、鏈脲霉素( streptozoctoin，STZ) (Sigma)、枸櫞酸(國(guó)藥)、96孔可拆酶標(biāo)版、透析袋MD45(1000)(上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司)、0.22 μm微濾膜、D101吸附大孔樹(shù)脂(深圳市寶安區(qū)碩科來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備銷(xiāo)售中心)。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))，高速冷凍離心機(jī)(JW-3021 HR)，F(xiàn)D8-3冷凍干燥機(jī)(GOLD-SIM中國(guó)分公司)，DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(金壇市榮華儀器制造有限公司)，聚四氟乙烯反應(yīng)釜(蕪湖市標(biāo)科儀器銷(xiāo)售部)，熒光酶標(biāo)儀(深圳山特電子有限公司)，血糖儀及標(biāo)配試紙(羅氏)，F(xiàn)A2014N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，艾科浦純水機(jī)(頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 藥材及動(dòng)物 鮮牛蒡購(gòu)自徐州丁氏百年食品有限公司，存放于皖南醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。180～200 g雄性SD大鼠40只(南京青龍山動(dòng)物繁殖廠(chǎng))。

2 方法和結(jié)果

2.1 牛蒡多糖的提取和分離 本課題組對(duì)牛蒡多糖的熱水提取法進(jìn)行了改造優(yōu)化，其工藝流程如下：將鮮牛蒡洗凈、去皮、切片，按照250 g/L料液比80℃水提取2次，第1次提取3 h，第2次提取2 h，合并兩次提取液濃縮至一定體積，用3倍體積95%乙醇醇沉，4℃靜置過(guò)夜。5000 r/min離心5 min獲得沉淀，沉淀以水溶解并再次離心去除不溶物，取上清液濃縮到一定容量，采用Sevage法(氯仿∶正丁醇=4∶1，糖溶液∶Sevag試劑=4∶1，V/V)脫蛋白，直至交界面無(wú)變性蛋白為止，取上層水相溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留有機(jī)試劑，并經(jīng)過(guò)D101吸附大孔樹(shù)脂脫色，收集脫色溶液，經(jīng)過(guò)0.22 μm微濾膜過(guò)濾除菌，采用截留分子質(zhì)量為1000 u的透析袋4℃下流水透析48 h，將得到的溶液冷凍干燥得到牛蒡粗多糖成品。粗糖復(fù)溶后經(jīng)過(guò)Sephadex G-100凝膠柱分離得到單一組份，采用高效液相色譜分析后認(rèn)為是牛蒡多糖純品(分子質(zhì)量約4500 u)，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道相近。

2.2 CDs的制備及表征 稱(chēng)取牛蒡粗多糖和枸櫞酸各1 g左右，置于內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，加入10 mL蒸餾水，攪拌溶解。將反應(yīng)釜放置于280℃干燥箱中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒出過(guò)濾，濾液經(jīng)5000 r/min，4℃離心10 min，收集上清液。取上清液過(guò)0.22 μm濾膜兩次，過(guò)濾后的上清液裝入截留分子質(zhì)量1000 u的即用型高精度RC透析袋中透析48 h，將得到的溶液冷凍干燥得CDs。稱(chēng)取微量?jī)龈善?，加蒸餾水溶解，在365 nm的紫外燈照射下，具藍(lán)色熒光，如圖1。

圖中為熒光圖，在紫外燈365 nm激發(fā)下。

圖1 CDs的透射電鏡圖

2.3 CDs體外抑制α-葡萄糖苷酶的活性 參考文獻(xiàn)[14-16]，以CDs為抑制劑、PNPG為底物，Acarbose作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。優(yōu)化酶促反應(yīng)后，得到最佳反應(yīng)條件為：溶劑為pH 6.8 PBS緩沖液，Acarbose與CDs(0.078～2.5 mg/mL)分別與20 μL α-葡萄糖苷酶(1U/mL)混勻，37℃水浴10 min，加入底物PNPG(5 mmol/L)20 μL混勻，37℃水浴30 min后，加入0.2 mol/L Na2CO3100 μL終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在405 nm處測(cè)定吸光度。反應(yīng)分為空白對(duì)照組、CDs組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組均設(shè)置本底對(duì)照。樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率(%)=[1-(AS-AC)/A0]×100%式中：AS為CDs或Acarbose反應(yīng)組吸收度(CDs組或陽(yáng)性對(duì)照組)，AC為各組自身本底對(duì)照吸收度；A0為等量 PBS 代替樣品溶液的吸收度(空白對(duì)照組)。結(jié)果如表1所示，CDs濃度為2.5 mg/mL時(shí)，抑制率為89.24%，具有良好的抑制活性。

c/(mg/mL)Inhibitoryrate/%AcarboseCDs0．07822．12±10．70a2．31±1．18a0．15634．44±6．74ab12．38±3．36b0．31347．58±11．71bc34．41±2．94c0．62562．12±10．47cd64．88±9．38d1．25072．84±9．60de84．94±3．10e2．50082．67±4．49e89．24±1．67eF18．600203．837P0．0000．000

注：多組間兩兩比較，符號(hào)完全不同表示P<0.05。

2.4 CDs體內(nèi)降血糖活性 參考文獻(xiàn)[6-7], 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分成兩組，空白組(Control)10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。模型組30只，給予高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，模型組禁食過(guò)夜，腹腔注射 STZ(35 mg /kg，STZ 溶于 0. 05 mol /L 檸檬酸緩沖液)。血糖穩(wěn)定1周后，檢測(cè)造模大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG>11.1 mmol /L為糖尿病模型建造成功。統(tǒng)計(jì)成模24只，隨機(jī)等分成3組，每組8只, 分別為模型對(duì)照組(Model)、Acarbose組(200 mg /kg)、CDs組(200 mg /kg )。所有大鼠口服灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6周，給藥治療后每周剪尾采血，監(jiān)測(cè)血糖，連續(xù)測(cè)6周。結(jié)果如表2，經(jīng)過(guò)6周治療后，CDs組與模型對(duì)照組對(duì)比血糖下降為14.12 mmol /L，低于模型組的16.26 mmol /L，其中Acarbose組血糖為13.41 mmol /L。初步表明CDs在體內(nèi)具有一定的降血糖活性，其降低血糖的機(jī)制可能與抑制α-葡萄糖苷酶活性有關(guān)[6]。

GroupDose/(mg/kg)FBG/(mmol/L)0week6weekControl-5．04±0．42a4．85±0．45aModel-16．95±2．07b16．26±1．09bAcarbose20017．35±2．70b13．41±1．83bCDs20017．10±2．55b14．12±1．37cF64．279122．125P0．0000．000

注：多組間兩兩比較，符號(hào)不同表示P<0.05。

3 討論

本文以牛蒡多糖和枸櫞酸為碳源，高溫反應(yīng)得到熒光CDs，通過(guò)體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)來(lái)研究其降血糖活性，體外抑制試驗(yàn)結(jié)果表明CDs濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)89.24%以上，表明該CDs具有較強(qiáng)的葡萄糖苷酶抑制活性；體內(nèi)試驗(yàn)在治療42 d后，模型對(duì)照組血糖為16.26 mmol /L，高于CDs組血糖(14.12 mmol /L)，其中Acarbose組血糖為13.41 mmol /L，初步顯示CDs能降低DM大鼠的血糖水平，為進(jìn)一步研究其體內(nèi)降血糖活性及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Preparationofthepolysaccharide-derivedcarbondotsanddeterminationofthehypoglycemicactivity

WANGShusheng,SHAOTaili

School of Pharmacy, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China

Objective：To determine the hypoglycemic activity ofArctiumlappaL. root polysaccharide-derived carbon dots(CDs).Methods: Polysaccharide(MW 4500) was extracted from the root of theArctiumlappaL. roots. CDs were prepared by pyrolyzation of the polysaccharide and citric acid under 280 ℃ for 0.5 h.Invitrotechnique was used to test ɑ-glycosidase enzyme inhibition and the hypoglycemic activity of CDs in the model rats of diabetic peripheral neuritis induced by streptozotocin.Results:Invitrotest indicated that the inhabitation activity of α-glycosidase was up to 89.24% at concentration of CDs being 2.5 mg/mL, and rats treated with CDs had lower blood glucose level than those in the model group(14.12 mmol /Lvs.16.26 mmol /L) after intragastric administration for 42 days.Conclusion: CDs has strong activity to inhibit α-glycosidase and capability to reduce blood glucose level of diabetic model rats. Our findings may lay a foundation for further investigation of the CDs in the mechanism of regulating the blood sugar.

carbon dots; α-glucosidase inhibitory activity; hypoglycemic activity

1002-0217(2017)06-0525-03

安徽省教育廳人才項(xiàng)目(gxfxZD2016157)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510368012)

2017-04-11

王書(shū)生(1994-)，男，2013級(jí)藥學(xué)專(zhuān)業(yè)本科生，(電話(huà))0553-3932026，(電子信箱)1334260315@qq.com；

邵太麗，女，副教授，博士，(電子信箱) shaotl@mail.ahnu.edu.cn，通信作者。

R 285;R 284

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.06.004