實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎小鼠外周血Treg、Tfh細(xì)胞的檢測分析

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎小鼠外周血Treg、Tfh細(xì)胞的檢測分析

王茂林1，孫斌杰1，鮑慧文1，張 鵬1，張浩民1，陶夢穎1，湯興麗2，劉 輝2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：探究Treg、Tfh細(xì)胞在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(EAT)發(fā)病過程中的作用。方法將ICR雌性小鼠分為模型組和對照組。模型組以豬甲狀腺球蛋白(PTg)和弗氏佐劑免疫，合并高碘刺激。酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)和甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)水平；病理學(xué)分析小鼠甲狀腺組織；流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD154+CXCR5+Tfh細(xì)胞的比例。結(jié)果模型組TGAb水平為(138.10±12.10)U/mL，高于對照組的(2.46±0.56)U/mL(P<0.05)；TPOAb水平兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病理學(xué)分析顯示模型組甲狀腺組織呈輕度炎癥改變；模型組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為(6.20±3.27)%，低于對照組的(11.74±3.52)%(P<0.05)；CD4+CD154+CXCR5+Tfh細(xì)胞比例兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)Tg合并高碘刺激5周時(shí)間，可導(dǎo)致小鼠自身免疫發(fā)生，甲狀腺組織輕度炎癥改變；CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞參與了早期自身免疫機(jī)制。

自身免疫性甲狀腺炎；Treg細(xì)胞；Tfh細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是一種由遺傳、環(huán)境及免疫功能紊亂等因素綜合作用而引起的自身免疫性疾病，其發(fā)病是體液免疫與細(xì)胞免疫共同作用的結(jié)果，因具體機(jī)制尚不明朗，且發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，故成為基礎(chǔ)和臨床研究熱點(diǎn)之一。近年來，人們已認(rèn)識到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)和濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中，Treg可以介導(dǎo)免疫耐受，抑制炎癥，是一群具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群；Tfh是近年來新發(fā)現(xiàn)的真正輔助B細(xì)胞功能的CD4+T細(xì)胞亞群，研究證實(shí)，其能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，發(fā)揮體液免疫作用[1]。本實(shí)驗(yàn)采用豬甲狀腺球蛋白(porcine thyroglobulin，PTg)和弗氏佐劑免疫，合并高碘刺激ICR雌性小鼠，為期5周的時(shí)間，建立小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(experimental autoimmune thyroiditis，EAT)早期炎癥模型，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析EAT小鼠外周血中Treg細(xì)胞和Tfh細(xì)胞比例變化，并探究這兩種細(xì)胞在EAT發(fā)病早期階段自身免疫機(jī)制中的意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級ICR雌性小鼠20只；體質(zhì)量(25±2)g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑 豬甲狀腺球蛋白(PTg)、完全弗氏佐劑(CFA)與不完全弗氏佐劑(IFA)，均為sigma公司產(chǎn)品；小鼠抗甲狀腺球蛋白抗體ELISA試劑盒與小鼠抗甲狀腺過氧化物酶抗體ELISA試劑盒，分別購自武漢華美生物工程有限公司和上海江萊生物科技有限公司；碘化鈉購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。紅細(xì)胞裂解液、熒光標(biāo)記抗體(CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE、CD154-PE和CXCR5-PerCP-cy5.5)、固定/破核膜試劑盒均為BD公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 Bio Tek全波長酶標(biāo)儀(型號：Von)、BD流式細(xì)胞儀(型號：Accuri C6)、BECKMAN高速冷凍離心機(jī)(型號：Allegra X-15R)、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平。

1.4 方法

1.4.1 分組 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組，即模型組與正常對照組。

1.4.2 模型建立 用PBS將PTg充分溶解，采用雙注射器乳化法將抗原溶液與等體積弗氏佐劑充分乳化后對模型組小鼠行皮下注射(50 μg/只)，每周1次，連續(xù)5周[2](其中第1、2周采用CFA乳化抗原，第3、4、5周采用IFA乳化抗原，注射部位依次為頸部皮下、背部皮下、頸部皮下、背部皮下、腹腔)；對照組則每次于相同部位注射等劑量生理鹽水。建模期間，模型組飲用高碘水(配置方法為0.64 g碘化鈉溶于1 L自來水[3]，避光儲(chǔ)存，避光給飲)，正常對照組飲用自來水。所有小鼠均于第6周行眼球采血后頸椎脫臼處死，迅速開腹分離出脾臟并稱重。所采血液一部分用于流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞，一部分分離血清用于檢測甲狀腺自身抗體。

1.4.3 甲狀腺自身抗體的檢測 小鼠采血后分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TGAb)和小鼠甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)水平。

1.4.4 甲狀腺組織病理學(xué)檢查 小鼠采血后頸椎脫臼處死，解剖分離附有甲狀腺組織的氣管節(jié)段，立即固定于10%中性福爾馬林中，后經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察甲狀腺組織病理變化。

1.4.5 CD4+CD154+CXCR5+Tfh細(xì)胞比例檢測 小鼠新鮮抗凝血取100 μL于各管中經(jīng)裂解紅細(xì)胞處理后(注意紅細(xì)胞裂解液與血液充分混勻)，除空白管外，其余各管細(xì)胞表面依次用熒光抗體CD4-FITC、CD154-PE、CXCR5-PerCP-cy5.5進(jìn)行熒光染色(注意加入熒光抗體時(shí)避免交叉污染和沾在管壁)，渦旋振蕩，4℃孵育30 min(注意避光，以免造成熒光淬滅)。用PBS 1 mL洗滌兩遍后，每管加入PBS300 μL重懸細(xì)胞，立即上機(jī)檢測。

1.4.6 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例檢測 處理方法與注意事項(xiàng)同Tfh檢測，細(xì)胞表面抗原依次用CD4-FITC與CD25-APC熒光染色，渦旋振蕩，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌，棄上清，加入1 mL新鮮配制的1×Fix/Permbuffer，渦旋振蕩后避光孵育50 min，再加入1×Perm/Wash buffer 1 mL洗滌兩次，棄上清。經(jīng)破膜處理后，用熒光抗體Foxp3-PE進(jìn)行胞內(nèi)染色，渦旋振蕩，4℃避光孵育50 min，再加入1×Perm/Wash buffer 2 mL，4℃，350 g，離心6 min后棄上清，每管加入PBS 300 μL重懸細(xì)胞，立即上機(jī)檢測。

使用流式細(xì)胞儀C6檢測，檢測前用BD公司提供的質(zhì)控微球進(jìn)行設(shè)置和調(diào)節(jié)。預(yù)先設(shè)置空白管、補(bǔ)償管、同型對照管、樣本管。先用空白管在FSC/SSC散點(diǎn)圖上圈門(圈淋巴細(xì)胞區(qū)域設(shè)門，注意將分析細(xì)胞設(shè)在門內(nèi)，盡量減少碎片摻入，保證足夠的細(xì)胞數(shù)量)。隨后以CD4-FITC、CD154-PE和CXCR5-PerCP-cy5.5補(bǔ)償管(檢測Treg時(shí)為CD4-FITC、CD25-APC和Foxp3-PE補(bǔ)償管)進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，最后測定樣本管，分析CD4+CD154+CXCR5+Tfh和CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)胞的百分比。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 建模前所有小鼠飲食、活動(dòng)均正常，皮毛光滑。建模第4周，模型組小鼠免疫部位出現(xiàn)紅腫硬結(jié)，免疫部位周邊毛發(fā)油亮不整，個(gè)別小鼠硬結(jié)輕微破潰、滲血，小鼠有舔舐現(xiàn)象；正常對照組小鼠則為正常。建模第6周，與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量減輕，飲食、活動(dòng)減少，皮毛欠光滑，脾臟增大增重。

2.2 小鼠血清TGAb和TPOAb水平分析 結(jié)果顯示，模型組小鼠TGAb水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；而模型組小鼠TPOAb水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠血清TGAb和TPOAb水平 U/mL

2.3 甲狀腺組織病理學(xué)檢查 正常對照組小鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)正常，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞排列較為整齊疏松，細(xì)胞呈扁平狀。與正常對照組相比，模型組小鼠甲狀腺濾泡部分萎縮，膠質(zhì)減少；濾泡上皮細(xì)胞增生，排列較為緊密，細(xì)胞輕微腫脹呈低柱狀；個(gè)別濾泡上皮細(xì)胞成簇排列為微濾泡結(jié)構(gòu)，可見部分細(xì)胞核增大；淋巴細(xì)胞浸潤不明顯。見圖1 。

A.模型組(×100)；B.模型組(×400)，a：濾泡上皮細(xì)胞，b：濾泡腔；C.對照組(×100)；D.對照組(×400)。

圖1 小鼠甲狀腺組織病理圖

2.4 小鼠外周血Treg和Tfh細(xì)胞的比例分析 小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD154+CXCR5+Tfh流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2所示，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞比例(%)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 但模型組CD4+CD154+CXCR5+Tfh占CD4+T細(xì)胞比例(%)與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

A.淋巴細(xì)胞區(qū)域設(shè)門；B.模型組小鼠CD4+T細(xì)胞比例；C. 模型組小鼠Treg比例；D.模型組小鼠Tfh比例。

圖2 小鼠外周血Treg和Tfh細(xì)胞流式圖

表2 兩組小鼠外周血Treg和Tfh細(xì)胞的比例 %

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎早期炎癥模型建立 EAT動(dòng)物模型建立是研究AIT較好的手段。利用TG、TPO或TSHR等甲狀腺自身抗原成分單獨(dú)或加用CFA等佐劑來免疫動(dòng)物是公認(rèn)的經(jīng)典造模方法[4]。此外，大量的碘攝入可增加碘與Tg的結(jié)合，產(chǎn)生碘化Tg，其可加重Tg免疫誘發(fā)的自身免疫性甲狀腺炎[5]。袁繼紅等[6]通過設(shè)置對照組、高碘組、TG免疫組和聯(lián)合組對BALB/c小鼠進(jìn)行為期8周的EAT模型的建立，結(jié)果顯示：高碘組甲狀腺組織少見淋巴細(xì)胞；TG免疫組可見單個(gè)散在淋巴細(xì)胞；聯(lián)合組可見甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)破壞及局部淋巴細(xì)胞浸潤。另有研究表明[7]，給予小鼠8周的高碘刺激，小鼠血清TGAb水平升高伴甲狀腺組織呈現(xiàn)不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤。上述建模方法經(jīng)過8周時(shí)間的免疫和刺激，均發(fā)生了自身免疫炎癥，甲狀腺組織有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤。而更多的研究證實(shí)8周以上的建模周期可出現(xiàn)較為典型的EAT表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)旨在分析EAT發(fā)病早期階段小鼠的相關(guān)指標(biāo)變化，葉登美等[2]研究發(fā)現(xiàn)，為期5周的EAT模型建立顯示小鼠出現(xiàn)了自身免疫現(xiàn)象。故我們選擇連續(xù)5周給予PTg和弗氏佐劑免疫合并高碘刺激ICR雌性小鼠，觀察小鼠甲狀腺組織的病理學(xué)變化，結(jié)果顯示：正常對照組甲狀腺組織結(jié)構(gòu)正常，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞排列較為整齊疏松，細(xì)胞呈扁平狀；模型組甲狀腺濾泡有部分萎縮，膠質(zhì)減少；濾泡上皮細(xì)胞增生，形態(tài)呈低柱狀，可見部分細(xì)胞核增大，細(xì)胞成簇排列為微濾泡結(jié)構(gòu)，間質(zhì)未出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤。自身抗體檢測，模型組小鼠血清TGAb較對照組升高，TPOAb水平無明顯變化。另外發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠脾臟增大增重。分析上述結(jié)果，模型組小鼠血清TGAb水平升高、脾臟增大，說明自身免疫已經(jīng)發(fā)生；模型組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞由扁平變?yōu)榈椭鶢?，?xì)胞核增大，可能是細(xì)胞在炎癥因子刺激下異常表達(dá)MHC-Ⅱ類分子而呈“激活”狀態(tài)所致[8]；甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生，濾泡有部分萎縮，膠質(zhì)減少，是甲狀腺呈代償性功能活躍的表現(xiàn)，這些均提示甲狀腺已經(jīng)有輕度炎癥改變。但甲狀腺間質(zhì)尚未出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，TPOAb水平也未見升高，提示為期5周的PTg免疫合并高碘刺激，小鼠尚未達(dá)典型炎癥狀態(tài)，只是處于自身免疫炎癥的早期階段。本結(jié)果中TGAb升高而TPOAb未見變化，與自身免疫早期狀態(tài)吻合，因?yàn)樵缙诘拿庖叻磻?yīng)常針對單個(gè)決定簇, 隨后擴(kuò)散到同一靶組織的其他蛋白質(zhì)分子, 稱為分子間擴(kuò)散。TG 和TPO 均可引起甲狀腺組織抗原決定簇的擴(kuò)散, 從而產(chǎn)生其他甲狀腺抗體[4,9]。在TG引起的免疫反應(yīng)尚未擴(kuò)散至甲狀腺組織TPO等其他蛋白質(zhì)分子時(shí)，只產(chǎn)生TGAb，還未來得及產(chǎn)生TPOAb的狀態(tài)是存在的。

本結(jié)果揭示了在造模5周時(shí)間后即可出現(xiàn)小鼠EAT早期輕度炎癥變化，并且小鼠已經(jīng)發(fā)生了自身免疫。提示實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎早期炎癥模型建立成功。

3.2 自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病早期小鼠外周血Treg和Tfh細(xì)胞分析 CD4+CD25+Treg是具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群。Foxp3是維持 Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)有賴于轉(zhuǎn)化生長因子-β的存在[10]。研究表明，CD4+CD25+T細(xì)胞可通過免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化增殖而維持免疫穩(wěn)態(tài)[11-12]。本結(jié)果中，在小鼠自身免疫性甲狀腺炎早期階段，與對照組相比，模型組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例明顯降低，提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用已經(jīng)參與了EAT發(fā)病早期自身免疫機(jī)制。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞主要通過分泌TGF-β等抑制性細(xì)胞因子以及表達(dá)的CTLA-4等抑制性受體而發(fā)揮免疫抑制作用，其數(shù)量和功能的低下導(dǎo)致對自身免疫反應(yīng)性細(xì)胞功能的抑制作用也下降，自身免疫損傷也就難以控制。已知樹突狀細(xì)胞所分泌的IL-10/TGF-β可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生，許多研究已經(jīng)證實(shí)在自身免疫性疾病患者和相關(guān)動(dòng)物模型中，均存在髓系樹突狀細(xì)胞功能缺陷，這會(huì)導(dǎo)致CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量和功能異常[13]。本結(jié)果中Treg細(xì)胞的減少是否也與樹突狀細(xì)胞功能缺陷有關(guān)呢？這需要進(jìn)一步研究。

近年來，輔助T細(xì)胞另一新成員Tfh被證實(shí)在許多自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[14-15]。因其主要位于淋巴濾泡，能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、介導(dǎo)體液免疫，且表型為CXCR5+CD154+ICOS+，不同于Th1和Th2，故命名為Tfh[16]。CXCR5分子表達(dá)于所有成熟B細(xì)胞和識別抗原后的部分CD4+T細(xì)胞上，它是Tfh細(xì)胞遷移到外周淋巴器官B細(xì)胞區(qū)的關(guān)鍵的“運(yùn)輸分子”[17]。CD154分子與其在B細(xì)胞表面的受體CD40結(jié)合對介導(dǎo)B細(xì)胞的活化有重要作用。

Tfh細(xì)胞在CXCR5配體CXCL13的趨化吸引下定位于B細(xì)胞淋巴濾泡來直接輔助B細(xì)胞，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)效應(yīng)性和記憶性B細(xì)胞的形成以及特異性抗體產(chǎn)生的過程[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠外周血CD4+CXCR5+CD154+Tfh占CD4+T細(xì)胞比例與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然有研究表明Tfh參與了某些自身免疫疾病的發(fā)生，但本結(jié)果提示EAT早期自身免疫炎癥階段，Tfh細(xì)胞未見明顯變化?？赡苁且?yàn)檩o助體液免疫的細(xì)胞有多種如Tfh、Th2等，而Tfh細(xì)胞是B細(xì)胞在淋巴濾泡內(nèi)應(yīng)答的輔助細(xì)胞，在生發(fā)中心形成后發(fā)揮作用，主要通過分泌IL-21等機(jī)制輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體類別轉(zhuǎn)換等事件，發(fā)揮作用比較遲[19]。我們推測Tfh細(xì)胞只在炎癥后期參與輔助B細(xì)胞應(yīng)答，所以在本實(shí)驗(yàn)的炎癥早期，Tfh細(xì)胞未見明顯變化，這也可能是此時(shí)TPOAb水平未見升高的一個(gè)原因。Tfh細(xì)胞參與EAT發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)得到皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室的大力支持，同時(shí)，得到皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科曹曉智老師和皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陸曉華、陳京、吳敏等多位老師的悉心指導(dǎo)，在此一并感謝!)

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DetectionoftheTregandTfhcellsintheperipheralbloodinexperimentalautoimmunethyroiditismice

WANGMaolin,SUNBinjie,BAOHuiwen,ZHANGPeng,ZHANGHaomin,TAOMengying,TANGXingli,LIUHui

School of Clinical Medicine, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China

Objective：To investigate the function of Treg and Tfh cells in the pathogenetic process in experimental autoimmune thyroiditis in mice.Methods: ICR female mice were divided into model group and normal control group. Mice in the model group were immunized with porcine thyroglobulin(PTg) and Freund′s adjuvant combined with high iodine stimulation, and sacrificed at the 6th week. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to detect the thyroglobulin antibody (TGAb) and thyroid peroxidase antibody(TPOAb) levels, and thyroid tissues obtained from the mice were pathologically examined. Flow cytometry was used to determine the percentages of CD4+CD25+Foxp3+Treg and CD4+CD154+CXCR5+Tfh cells in peripheral blood from experimental mince.Results: Mice in the model group had higher TGAb level than those in the control group[(138.10±12.10)U/mLvs. (2.46±0.56)U/mL,P<0.05)], yet the TPOAb level remained no significant difference between groups (P> 0.05).Pathological examination showed minor inflammation in the thyroid tissues. Percentage of circulating CD4+CD25+Foxp3+Treg cells was significantly higher in the model group than the control group[(6.20±3.27)%vs. (11.74±3.52)%,P<0.05)], whereas the two groups had no significant difference regarding CD4+CD154+CXCR5+Tfh cells (P> 0.05).Conclusion: PTg combined with high iodine stimulation for five weeks may lead to autoimmune in mice, when mild inflammation occurs in the thyroid tissues. CD4+CD25+Foxp3+Treg cells may be associated with autoimmune response in early stage.

autoimmune thyroiditis; Treg cells; Tfh cells; flow cytometry

1002-0217(2017)06-0521-05

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510368007)

2017-05-11

王茂林(1995-)，男，2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，(電話)18375338724，(電子信箱)1240874877@qq.com；

劉 輝，女，副教授，(電子信箱)hegenlh@sina.com，通信作者。

R 581.4;R 392.1

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.06.003