53種不同來源靈芝子實體多糖含量差異研究

陳凌華，程祖鋅，許 明

(福建農(nóng)林大學)

0 引言

實驗中通過菌草栽培收集到的不同靈芝屬子實體樣品共53份，范圍涉及松杉靈芝 (Ganodermatsugae)、密紋靈芝(Ganodermatenus)、樹舌靈芝(Ganodermaapplanatum)、紫芝(Ganodermasinense)與赤芝(Ganodermalucidum)等品種.采用熱水浸提法提取靈芝子實體多糖，苯酚硫酸法測定多糖含量.通過對53份來源不同的靈芝屬的子實體多糖的定量分析，發(fā)現(xiàn)各品種的多糖表達量之間具有明顯差異，該研究可為靈芝多糖等活性物質(zhì)的研發(fā)與應(yīng)用提供參考價值.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

供試靈芝菌種53份(見表1)，由福建農(nóng)林大學菌物研究中心保藏，菌株主要分為以下幾類： 赤芝(38個，編號1-38)，樹舌靈芝(1個，編號39)，紫芝(3個，編號40-42)，密紋靈芝(2個，編號43-44)與松杉靈芝 (9個，編號45-53).對照品2個，分別是同期栽培的菌草靈芝與段木靈芝.

表1 靈芝菌種

續(xù)表1 靈藝菌種

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL.

菌草培養(yǎng)料：水∶石膏∶麥皮∶芒萁∶五節(jié)芒=55∶1∶10∶15∶24.

1.1.3 試劑

高職院校生物化學教學改革的探討永遠在路上。作為授課教師，應(yīng)在教學實踐中不斷探索新的教學思路和方法，使學生在有限的學習時間內(nèi)，既掌握專業(yè)基礎(chǔ)理論知識，又具備從事本專業(yè)實際工作的基本技能和初步能力。

無水葡萄糖(基準純)、以及乙醇、濃硫酸、苯酚等生化試劑(分析純).

1.2 方法

1.2.1 熱水法提取靈芝子實體多糖

子實體多糖提取采用實驗室優(yōu)化的熱水法[8]，步驟具體如下：稱取子實體粉末(過10目篩)5 g，95%乙醇100 ℃浸提3次，每次30 min(去除脂溶性物質(zhì)).抽濾，取料渣按1∶30的料水比在100 ℃熱水條件下浸提3 h，浸提液減壓濃縮后，乙醇4 ℃沉淀過夜，凍干得粗多糖樣品.

1.2.2 靈芝多糖含量測定：苯酚-硫酸法

(1)繪制葡萄糖標準曲線

分別用吸量管移取體積為0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL濃度為1.25 mg/mL的葡萄糖標準溶液于試管中，加蒸餾水至2.00 mL，依次加入1.00mL的5%苯酚溶液混勻，快速加入5.00mL的濃硫酸，立即振蕩混勻并于冰浴放置20 min.以2.00mL蒸餾水為試劑空白，室溫下選擇490 nm波長測定上述溶液的吸光度，繪制葡萄糖標準曲線.

(2)53種不同來源靈芝子實體多糖的含量測定

稱取凍干保存的粗多糖10.00 mg，定容于50.00 mL容量瓶，取粗多糖樣品溶液按上述相同操作并測定吸光度，根據(jù)標準曲線換算得到樣品液中的葡萄糖濃度ρ(mg/mL).

公式中ρ為樣品液的葡萄糖濃度(mg/mL)，V為配制的多糖樣品液體積(mL)，m為粗多糖的取樣質(zhì)量(mg).

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖含量測定

2.1.1 多糖標準曲線繪制

苯酚-硫酸法繪制的標準葡萄糖曲線為：A=49.887×ρ+0.011，回歸系數(shù)γ=0.9994 (A表示吸光度，ρ表示葡萄糖濃度).

2.1.2 多糖含量測定

53份靈芝子實體多糖含量的測定結(jié)果見表2.

子實體多糖含量(%)=粗多糖提取率×粗多糖中多糖含量

53份來源不同的靈芝屬子實體多糖定量測定結(jié)果顯示，不同靈芝屬子實體的多糖含量之間有明顯差異(見表3)：(1)在粗多糖平均提取率方面，紫芝最高(6.33%)，樹舌靈芝次之，赤芝的平均粗多糖提取率僅為紫芝的32.54%；3個紫芝品種中42號的粗多糖提取率最高(7.60%)，為對照品菌草靈芝的2.04倍.(2)粗多糖中多糖平均含量方面，赤芝最高(35.74%)，其次是密紋靈芝與松杉靈芝，紫芝較低；紫芝粗多糖中的多糖平均含量僅為赤芝的76.11%；38個赤芝品種中粗多糖的多糖含量最高的為27號(43.52%)，為對照品菌草靈芝的1.29倍.(3)子實體多糖平均含量方面：子實體多糖含量高低是由粗多糖的提取率、粗多糖中多糖含量這兩個方面共同決定的.子實體的多糖平均含量最高的是紫芝(1.72%)，其次為樹舌靈芝，赤芝的子實體多糖的平均含量較低，僅為紫芝品種的(42.44%)；3個紫芝品種中子實體多糖含量最高的為42號(2.05%)，為對照品菌草靈芝的1.64倍.

表2 53份靈芝子實體的的粗多糖提取率與多糖含量

續(xù)表2 53份靈芝子實體的的粗多糖提取率與多糖含量

注： 粗多糖提取率(%)=粗多糖質(zhì)量/子實體質(zhì)量 子實體多糖含量(%)=粗多糖提取率×粗多糖中多糖含量

表3 不同亞屬靈芝的的平均粗多糖提取率與平均多糖含量

該實驗除了以同期生產(chǎn)的菌草靈芝作為對照品外，還測定了段木靈芝的粗多糖含量，結(jié)果表明：盡管菌草靈芝的粗多糖中純多糖的含量不及段木靈芝，但由于菌草靈芝具有較高的粗多糖提取率，因此菌草靈芝子實體的多糖含量(1.99%)在1%的顯著水平下仍然明顯高于段木栽培靈芝(1.92%)，這也從量上反映出靈芝的菌草栽培可有效代替段木栽培.

3 討論

靈芝在我國具有悠久的藥用歷史，其活性成分多糖含量的高低已成為衡量靈芝品質(zhì)的重要指標.由于靈芝品種繁多，種間與品種間的不同均有可能引起有效成分多糖在含量表達上的差異[9].即使是相同的菌株，在生長過程中因外界環(huán)境、營養(yǎng)與栽培形式的不同，仍可引起多糖含量表達的不同.該研究對收集到的53份靈芝屬材料，在嚴格控制客觀的栽培環(huán)境下，重點研究遺傳背景的差異對靈芝多糖含量的影響.該實驗采用綠色環(huán)保的菌草栽培技術(shù)，從母種，原種、栽培袋的制備過程中，嚴格控制接菌量、培養(yǎng)基量的一致，并在相同的大棚栽培環(huán)境下(相對濕度90%，溫度22～28℃，通風，散射光照射)進行生長，并做到同期接菌、同期采收.

排除了客觀的栽培條件或營養(yǎng)條件差異可能對子實體多糖含量的影響，多糖含量差異主要就由其遺傳背景或種性決定.本實驗的多糖含量測定結(jié)果表明，靈芝不同亞屬間的多糖含量存在顯著性差異：紫芝子實體多糖的平均含量最高(1.72%)，其次為樹舌靈芝(1.53%)，然后依次是密紋靈芝(0.94%)、赤芝(0.73%)與松杉靈芝(0.63%)；其中赤芝的子實體多糖的平均含量(0.73%)僅為紫芝品種的42.44%.此外，即使是同一亞屬的靈芝菌株，由于其遺傳背景或來源不同，多糖含量也存在明顯差異，例如本實驗中的38個赤芝菌株，其子實體的多糖含量分布較為廣泛，多糖含量最高的品種(36號南韓靈芝1.55%)是最低的品種(16號京大0.51%)的3倍以上.

目前市場供求的靈芝品種比較豐富，但缺乏有效的國家標準對其質(zhì)量高低進行甄別，而種質(zhì)資源的優(yōu)劣是影響食用菌產(chǎn)量及質(zhì)量的關(guān)鍵因素.本實驗結(jié)果對于高多糖靈芝種質(zhì)的選育以及靈芝活性多糖的研發(fā)具有一定的參考依據(jù).多糖含量測定結(jié)果表明，由于遺傳種性的不同，不同亞屬、以及同一亞屬下的不同菌株的靈芝子實體多糖含量之間存在明顯差異.目前市面上應(yīng)用最為廣泛的主栽品種為赤芝，其次為紫芝.赤芝和紫芝都是《中國藥典》[10]正式收錄的藥用真菌.有研究表明紫芝、松杉靈芝、密紋靈芝等品種具有不同于赤芝的獨特生物學活性[11]，該研究通過比較不同遺傳背景的靈芝子實體在相同栽培環(huán)境下的多糖含量差異，旨在為以靈芝多糖為代表的活性物質(zhì)的研發(fā)以及不同靈芝屬多糖的藥理活性研究提供參考價值.