補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心臟自由基代謝及p16蛋白表達(dá)的影響

陳靚，崔開宇，吳勇，楊偉峰

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700

補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心臟自由基代謝及p16蛋白表達(dá)的影響

陳靚1，崔開宇1，吳勇1，楊偉峰2

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700

目的 觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心臟自由基代謝和p16蛋白表達(dá)的影響，探討其對(duì)衰老大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。方法 100只大鼠隨機(jī)分為青年對(duì)照組、老年對(duì)照組和補(bǔ)腎活血方高、中、低劑量組，每組20只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)16周。末次給藥后1 h，將大鼠麻醉后取血清和心臟。測(cè)定血清和心肌組織一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量和過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性；免疫組化檢測(cè)心肌組織β-半乳糖苷酶和p16蛋白表達(dá)。結(jié)果 與老年對(duì)照組比較，補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性顯著升高（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方各劑量組MDA含量顯著降低（P＜0.01）；補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠心肌組織NO含量和SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方各劑量組CAT活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；補(bǔ)腎活血方各劑量組心肌組織β-半乳糖苷酶和p16蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 補(bǔ)腎活血方通過(guò)抗氧化損傷和抑制抑癌基因p16表達(dá)，發(fā)揮抑制老年大鼠心肌老化的作用。

補(bǔ)腎活血方；衰老大鼠；氧化損傷；p16蛋白表達(dá)

中醫(yī)對(duì)衰老機(jī)理的認(rèn)識(shí)和研究源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，傳統(tǒng)理論強(qiáng)調(diào)腎虛是衰老的主要原因。近年來(lái)，血瘀致衰逐漸受到重視，提出腎虛血瘀是衰老的基本病機(jī)之一，補(bǔ)腎活血亦成為延緩衰老的一項(xiàng)基本治則[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)衰老過(guò)程中心臟發(fā)生的病理性改變已基本達(dá)成共識(shí)，隨著年齡的增長(zhǎng)，心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能逐漸發(fā)生變化，主要病理特征為心肌細(xì)胞壞死凋亡、心肌細(xì)胞肥大及心肌纖維化等改變，心肌纖維化是心臟老化的一個(gè)重要特征[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方能有效緩解心肌梗死后心肌纖維化程度[4]。本研究觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)自然衰老大鼠心臟氧化損傷相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞周期相關(guān)的p16蛋白表達(dá)的影響，探討其對(duì)衰老大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

3月齡和20月齡SPF級(jí)Wistar大鼠各50只，雌雄各半，北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXC（京）2009-0004。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通飼料喂養(yǎng)，每籠5只，溫度20～25 ℃，12 h光照交替，自由飲水?dāng)z食，分籠飼養(yǎng)。

1.2 藥物

淫羊藿、丹參飲片，購(gòu)自北京神農(nóng)飲片有限責(zé)任公司，黃山藥飲片，購(gòu)自云南玉龍中藥材公司，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院何希榮教授鑒定符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。使用前除去雜質(zhì)，干燥，備用。補(bǔ)腎活血方（淫羊藿、丹參、黃山藥）由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提取并制備為含原藥材1 g/mL浸膏。

1.3 主要試劑與儀器

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、一氧化氮（NO）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。β-半乳糖苷酶一抗、多克隆兔抗大鼠p16抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SABC免疫組化試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物技術(shù)公司。iMARK酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-bad公司），AE240電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），RM2235組織切片機(jī)、HI1220烤片機(jī)、ST5020全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)Leica）；bx51顯微鏡（日本Olympus），Anymicro DSSTM圖像采集系統(tǒng)（北京裕天世紀(jì)偉業(yè)科技發(fā)展有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為青年對(duì)照組、老年對(duì)照組和補(bǔ)腎活血方高、中、低劑量組（10.0、5.0、2.5 g原藥材/kg），每組10只。各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃，青年對(duì)照組和老年對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)16周。末次給藥后1 h，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心15 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆茫婚_胸摘取心臟，生理鹽水沖洗，留取部分心臟組織10%中性福爾馬林固定、保存，其余組織-80 ℃凍存。

2.2 一般狀況觀察

給藥期間每日觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛、飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量、大小便、對(duì)外界刺激的反應(yīng)等變化。

2.3 血清超氧化物歧化酶、丙二醛、過(guò)氧化氫酶、一氧化氮檢測(cè)

取備用血清，測(cè)定血清SOD、MDA、CAT、NO含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.4 心肌組織超氧化物歧化酶、丙二醛、過(guò)氧化氫酶、一氧化氮檢測(cè)

心肌組織稱重，加入一定比例PBS，組織勻漿，3000 r/min離心15 min，取組織勻漿液，測(cè)定心肌組織SOD、CAT活性和MDA、NO含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.5 病理組織學(xué)檢查

10%中性福爾馬林固定心肌組織，常規(guī)石蠟切片（厚度6 mm），HE染色，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

2.6 免疫組化檢測(cè)心肌組織β-半乳糖苷酶和p16的蛋白表達(dá)

所有切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟，免疫組化染色檢測(cè)心肌衰老特異性β-半乳糖苷酶及細(xì)胞周期蛋白p16的蛋白表達(dá)。脫蠟、水化組織切片，經(jīng)枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù)（溫度95 ℃，5 min×3次），自然冷卻，滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。分別滴加β-半乳糖苷酶、p16抗體（抗體效價(jià)1∶200），4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素化二抗，室溫孵育15～20 min，鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組大鼠出現(xiàn)倦臥、嗜睡懶動(dòng)、毛色發(fā)黃無(wú)光、精神不振等。給予補(bǔ)腎活血方后，老年大鼠外觀表現(xiàn)有所改善。

4.2 補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老大鼠血清丙二醛、一氧化氮含量和過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與老年對(duì)照組比較，補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性顯著升高（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方各劑量組MDA含量顯著降低（P＜0.01），且呈一定的量-效關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較（±s）

表1 各組大鼠血清NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較（±s）

注：與青年對(duì)照組比較，**P＜0.01；與老年對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/（g/kg） NO/（U/mL） MDA/（nmol/mL）CAT/（U/mL） SOD/（U/mL）青年對(duì)照組 10 3.59±0.36 1.26±0.31 12.59±1.84 14.84±1.60老年對(duì)照組 10 1.96±0.29**2.37±0.46**6.05±1.24**8.57±1.13**補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 2.5 2.19±0.45 1.45±0.38▲▲7.01±1.48 8.84±1.09補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 5.0 2.24±0.38 1.34±0.36▲▲7.90±1.42 9.41±1.49補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 10.0 2.80±0.46▲1.39±0.31▲▲8.00±1.17▲9.63±0.98▲

4.3 補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老大鼠心肌組織丙二醛、一氧化氮含量和過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組大鼠心肌組織NO含量和CAT、SOD活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與老年對(duì)照組比較，補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠心肌組織NO含量和SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方各劑量組CAT活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且呈一定的量-效關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠心肌組織NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較（±s）

注：與青年對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與老年對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/（g/kg） NO/（U/mg） MDA/（nmol/mg）CAT/（U/mg） SOD/（U/mg）青年對(duì)照組 10 61.88±15.37 14.50±3.72 325.17±57.55 288.17±69.13老年對(duì)照組 10 40.67±12.85*22.17±4.99*162.33±30.92**197.83±37.59*補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 2.5 51.66±13.16 20.67±4.97 233.33±65.62▲238.67±55.53補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 5.0 48.67±12.32 17.83±3.65 250.50±52.58▲▲247.17±53.38補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 10.0 56.33±10.59▲16.17±3.31▲266.16±57.45▲▲270.16±52.53▲

4.4 病理觀察結(jié)果

青年對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列致密，細(xì)胞間質(zhì)較少；老年對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量有所減少，細(xì)胞略肥大，排列不整齊，細(xì)胞間質(zhì)增多；補(bǔ)腎活血方各劑量組大鼠心肌細(xì)胞肥大有所改善，細(xì)胞間質(zhì)相應(yīng)減少。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)（HE染色，×40）

4.5 補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶和p16蛋白表達(dá)的影響

β-半乳糖苷酶和p16表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞漿染色呈棕黃色。青年對(duì)照組大鼠心肌組織中偶見棕黃色細(xì)胞；老年對(duì)照組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶和p16表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多；補(bǔ)腎活血方各劑量組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶和p16表達(dá)陽(yáng)性數(shù)量有所降低，且呈一定的量-效關(guān)系。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×40）

圖3 各組大鼠心肌組織p16蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×40）

5 討論

在老年醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，老化動(dòng)物模型的應(yīng)用十分多見，其中自然衰老動(dòng)物模型和D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型應(yīng)用較為廣泛[5]。自然衰老動(dòng)物模型是在正常生活條件下，通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的飼養(yǎng)，讓動(dòng)物正常地進(jìn)行生理發(fā)育直到老化的模型。該模型能較好地反映機(jī)體衰老的病理生理狀態(tài)。因此，相比于藥物或放射等人為干預(yù)致衰老的動(dòng)物模型而言，自然衰老動(dòng)物模型能較好吻合機(jī)體衰老的真實(shí)過(guò)程，最適宜用于衰老機(jī)理及延緩衰老藥物的研究[6]。本研究綜合多因素考慮，為較好反映中藥抗衰老作用及后續(xù)的機(jī)制研究，選擇自然衰老動(dòng)物模型作為研究對(duì)象。β-半乳糖苷酶是老化細(xì)胞在體外識(shí)別的一個(gè)重要標(biāo)志，本研究也顯示老年大鼠心肌細(xì)胞β-半乳糖苷酶明顯增高，而補(bǔ)腎活血方可以明顯降低其含量，表明補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老心肌具有保護(hù)作用。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基的有害作用是造成衰老過(guò)程中退行性變化的原因，機(jī)體的衰老過(guò)程與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[7]。其中體內(nèi)參與抗氧化反應(yīng)的酶類主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性反映機(jī)體清除自由基的能力。CAT則是清除H2O2的主要酶，也是體內(nèi)所有酶中轉(zhuǎn)換率最高的酶。GSH-Px則可與SOD發(fā)揮協(xié)同作用，防止脂質(zhì)過(guò)氧化及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。GSH-Px和SOD活性隨機(jī)體的衰老而逐漸降低，體內(nèi)自由基增多，自由基作用于生物膜脂質(zhì)雙分子層中的不飽和脂肪酸，可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物。測(cè)定MDA水平能較好地反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平，可以作為評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)之一[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方可升高老年大鼠血清和心肌組織CAT、SOD活性，降低MDA水平，尤以高劑量組作用顯著，且呈一定的量-效關(guān)系，顯示出明顯的抗氧化損傷作用，對(duì)衰老大鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

抑癌基因p16在衰老細(xì)胞中起重要的作用，p16基因與個(gè)體發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、衰老密切相關(guān)[9]，它在復(fù)制衰老時(shí)多呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞衰老時(shí)，p16基因的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平升高，抑制細(xì)胞有絲分裂，刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生RB蛋白的磷酸化，從而維持了衰老細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心肌組織p16的蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，這種作用可抑制心肌衰老，對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

綜上，補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心肌有保護(hù)作用，其機(jī)制與其抗氧化損傷和抑制抑癌基因p16的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Bushen Huoxue Formula on Free Radical Metabolism and p16 Protein Expression in Heart of Aged Rats

CHEN Liang1, CUI Kai-yu1, WU Yong1, YANG Wei-feng2(1. Hubei University of

Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Objective To observe the effects of Bushen Huoxue Formula on free radical metabolism and p16 protein expression in heart of aged rats; To discuss its protective mechanism to the heart of aged rats. Methods One hundred were divided into young control group, the natural aging group, Bushen Huoxue Formula high-, medium- and low-dose groups, with 20 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage, once a day for 16 weeks. 1 hour after the last administration, after the rats were sacrificed, serum and heart were taken. The contents of NO and MDA and activities of CAT and SOD in serum and myocardial, β-galactosidase enzyme and p16 protein expression in myocardial tissue were detected. Results Compared with the natural aging group, NO content and SOD activity in the serum of rats in Bushen Huoxue Formula high-dose group increased significantly (P＜0.05) and MDA content in all Bushen Huoxue Formula groups decreased (P＜0.01); NO content, CAT and SOD activity in the myocardial tissue of rats in Bushen Huoxue Formula high-dose group increased significantly, and MDA content decreased significantly (P＜0.05). CAT activity in all Bushen Huoxue Formula groups increased (P＜0.05, P＜0.01). β-galactosidase enzyme and p16 protein expression in myocardial tissue in all Bushen Huoxue Formula groups decreased. Conclusion Bushen Huoxue Formula can in hibit the aging of myocardial-aged rats, and the mechanism might be related to its anti-oxidative damage and inhibition of tumor suppressor gene p16 expression.

Bushen Huoxue Formula; aging rats; oxidative stress; p16 protein expression

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.014

R285.5

A

1005-5304(2017)01-0055-04

2016-03-09）

（

2016-03-29；編輯：華強(qiáng)）

湖北省自然科學(xué)基金（2012FKB02102）

楊偉峰，E-mail：sunzhuyang@126.com