• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心臟自由基代謝及p16蛋白表達(dá)的影響

    2017-12-27 06:30:32陳靚崔開宇吳勇楊偉峰
    關(guān)鍵詞:糖苷酶活血心肌

    陳靚,崔開宇,吳勇,楊偉峰

    1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700

    補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心臟自由基代謝及p16蛋白表達(dá)的影響

    陳靚1,崔開宇1,吳勇1,楊偉峰2

    1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700

    目的 觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心臟自由基代謝和p16蛋白表達(dá)的影響,探討其對(duì)衰老大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。方法 100只大鼠隨機(jī)分為青年對(duì)照組、老年對(duì)照組和補(bǔ)腎活血方高、中、低劑量組,每組20只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃,每日1次,連續(xù)16周。末次給藥后1 h,將大鼠麻醉后取血清和心臟。測(cè)定血清和心肌組織一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性;免疫組化檢測(cè)心肌組織β-半乳糖苷酶和p16蛋白表達(dá)。結(jié)果 與老年對(duì)照組比較,補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性顯著升高(P<0.05),補(bǔ)腎活血方各劑量組MDA含量顯著降低(P<0.01);補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠心肌組織NO含量和SOD活性顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05),補(bǔ)腎活血方各劑量組CAT活性顯著升高(P<0.05,P<0.01);補(bǔ)腎活血方各劑量組心肌組織β-半乳糖苷酶和p16蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 補(bǔ)腎活血方通過(guò)抗氧化損傷和抑制抑癌基因p16表達(dá),發(fā)揮抑制老年大鼠心肌老化的作用。

    補(bǔ)腎活血方;衰老大鼠;氧化損傷;p16蛋白表達(dá)

    中醫(yī)對(duì)衰老機(jī)理的認(rèn)識(shí)和研究源遠(yuǎn)流長(zhǎng),傳統(tǒng)理論強(qiáng)調(diào)腎虛是衰老的主要原因。近年來(lái),血瘀致衰逐漸受到重視,提出腎虛血瘀是衰老的基本病機(jī)之一,補(bǔ)腎活血亦成為延緩衰老的一項(xiàng)基本治則[1-2]。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)衰老過(guò)程中心臟發(fā)生的病理性改變已基本達(dá)成共識(shí),隨著年齡的增長(zhǎng),心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能逐漸發(fā)生變化,主要病理特征為心肌細(xì)胞壞死凋亡、心肌細(xì)胞肥大及心肌纖維化等改變,心肌纖維化是心臟老化的一個(gè)重要特征[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎活血方能有效緩解心肌梗死后心肌纖維化程度[4]。本研究觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)自然衰老大鼠心臟氧化損傷相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞周期相關(guān)的p16蛋白表達(dá)的影響,探討其對(duì)衰老大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物

    3月齡和20月齡SPF級(jí)Wistar大鼠各50只,雌雄各半,北京華阜康生物科技股份有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXC(京)2009-0004。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,普通飼料喂養(yǎng),每籠5只,溫度20~25 ℃,12 h光照交替,自由飲水?dāng)z食,分籠飼養(yǎng)。

    1.2 藥物

    淫羊藿、丹參飲片,購(gòu)自北京神農(nóng)飲片有限責(zé)任公司,黃山藥飲片,購(gòu)自云南玉龍中藥材公司,經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院何希榮教授鑒定符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。使用前除去雜質(zhì),干燥,備用。補(bǔ)腎活血方(淫羊藿、丹參、黃山藥)由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提取并制備為含原藥材1 g/mL浸膏。

    1.3 主要試劑與儀器

    超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)測(cè)試盒,南京建成生物工程研究所。β-半乳糖苷酶一抗、多克隆兔抗大鼠p16抗體,北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SABC免疫組化試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒,武漢博士德生物技術(shù)公司。iMARK酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-bad公司),AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司),RM2235組織切片機(jī)、HI1220烤片機(jī)、ST5020全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國(guó)Leica);bx51顯微鏡(日本Olympus),Anymicro DSSTM圖像采集系統(tǒng)(北京裕天世紀(jì)偉業(yè)科技發(fā)展有限公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組和給藥

    大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為青年對(duì)照組、老年對(duì)照組和補(bǔ)腎活血方高、中、低劑量組(10.0、5.0、2.5 g原藥材/kg),每組10只。各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃,青年對(duì)照組和老年對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為10 mL/kg,每日1次,連續(xù)16周。末次給藥后1 h,大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血,3000 r/min離心15 min,收集血清,-20 ℃保存?zhèn)溆茫婚_胸摘取心臟,生理鹽水沖洗,留取部分心臟組織10%中性福爾馬林固定、保存,其余組織-80 ℃凍存。

    2.2 一般狀況觀察

    給藥期間每日觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛、飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量、大小便、對(duì)外界刺激的反應(yīng)等變化。

    2.3 血清超氧化物歧化酶、丙二醛、過(guò)氧化氫酶、一氧化氮檢測(cè)

    取備用血清,測(cè)定血清SOD、MDA、CAT、NO含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    2.4 心肌組織超氧化物歧化酶、丙二醛、過(guò)氧化氫酶、一氧化氮檢測(cè)

    心肌組織稱重,加入一定比例PBS,組織勻漿,3000 r/min離心15 min,取組織勻漿液,測(cè)定心肌組織SOD、CAT活性和MDA、NO含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    2.5 病理組織學(xué)檢查

    10%中性福爾馬林固定心肌組織,常規(guī)石蠟切片(厚度6 mm),HE染色,中性樹膠封片,鏡下觀察拍照。

    2.6 免疫組化檢測(cè)心肌組織β-半乳糖苷酶和p16的蛋白表達(dá)

    所有切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟,免疫組化染色檢測(cè)心肌衰老特異性β-半乳糖苷酶及細(xì)胞周期蛋白p16的蛋白表達(dá)。脫蠟、水化組織切片,經(jīng)枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù)(溫度95 ℃,5 min×3次),自然冷卻,滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。分別滴加β-半乳糖苷酶、p16抗體(抗體效價(jià)1∶200),4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素化二抗,室溫孵育15~20 min,鏡下DAB顯色,蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水、透明、封片,顯微鏡觀察。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    4 結(jié)果

    4.1 一般狀況

    與青年對(duì)照組比較,老年對(duì)照組大鼠出現(xiàn)倦臥、嗜睡懶動(dòng)、毛色發(fā)黃無(wú)光、精神不振等。給予補(bǔ)腎活血方后,老年大鼠外觀表現(xiàn)有所改善。

    4.2 補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老大鼠血清丙二醛、一氧化氮含量和過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

    與青年對(duì)照組比較,老年對(duì)照組大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性顯著降低(P<0.01),MDA含量顯著升高(P<0.01);與老年對(duì)照組比較,補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性顯著升高(P<0.05),補(bǔ)腎活血方各劑量組MDA含量顯著降低(P<0.01),且呈一定的量-效關(guān)系。結(jié)果見表1。

    表1 各組大鼠血清NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較(±s)

    表1 各組大鼠血清NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較(±s)

    注:與青年對(duì)照組比較,**P<0.01;與老年對(duì)照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01

    組別 只數(shù) 劑量/(g/kg) NO/(U/mL) MDA/(nmol/mL)CAT/(U/mL) SOD/(U/mL)青年對(duì)照組 10 3.59±0.36 1.26±0.31 12.59±1.84 14.84±1.60老年對(duì)照組 10 1.96±0.29**2.37±0.46**6.05±1.24**8.57±1.13**補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 2.5 2.19±0.45 1.45±0.38▲▲7.01±1.48 8.84±1.09補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 5.0 2.24±0.38 1.34±0.36▲▲7.90±1.42 9.41±1.49補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 10.0 2.80±0.46▲1.39±0.31▲▲8.00±1.17▲9.63±0.98▲

    4.3 補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老大鼠心肌組織丙二醛、一氧化氮含量和過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

    與青年對(duì)照組比較,老年對(duì)照組大鼠心肌組織NO含量和CAT、SOD活性顯著降低(P<0.05,P<0.01),MDA含量顯著升高(P<0.05);與老年對(duì)照組比較,補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠心肌組織NO含量和SOD活性顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05),補(bǔ)腎活血方各劑量組CAT活性顯著升高(P<0.05,P<0.01),且呈一定的量-效關(guān)系。結(jié)果見表2。

    表2 各組大鼠心肌組織NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較(±s)

    表2 各組大鼠心肌組織NO、MDA含量和CAT、SOD活性比較(±s)

    注:與青年對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與老年對(duì)照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01

    組別 只數(shù) 劑量/(g/kg) NO/(U/mg) MDA/(nmol/mg)CAT/(U/mg) SOD/(U/mg)青年對(duì)照組 10 61.88±15.37 14.50±3.72 325.17±57.55 288.17±69.13老年對(duì)照組 10 40.67±12.85*22.17±4.99*162.33±30.92**197.83±37.59*補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 2.5 51.66±13.16 20.67±4.97 233.33±65.62▲238.67±55.53補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 5.0 48.67±12.32 17.83±3.65 250.50±52.58▲▲247.17±53.38補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 10.0 56.33±10.59▲16.17±3.31▲266.16±57.45▲▲270.16±52.53▲

    4.4 病理觀察結(jié)果

    青年對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列致密,細(xì)胞間質(zhì)較少;老年對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量有所減少,細(xì)胞略肥大,排列不整齊,細(xì)胞間質(zhì)增多;補(bǔ)腎活血方各劑量組大鼠心肌細(xì)胞肥大有所改善,細(xì)胞間質(zhì)相應(yīng)減少。結(jié)果見圖1。

    圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)(HE染色,×40)

    4.5 補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶和p16蛋白表達(dá)的影響

    β-半乳糖苷酶和p16表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞漿染色呈棕黃色。青年對(duì)照組大鼠心肌組織中偶見棕黃色細(xì)胞;老年對(duì)照組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶和p16表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多;補(bǔ)腎活血方各劑量組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶和p16表達(dá)陽(yáng)性數(shù)量有所降低,且呈一定的量-效關(guān)系。結(jié)果見圖2、圖3。

    圖2 各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×40)

    圖3 各組大鼠心肌組織p16蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×40)

    5 討論

    在老年醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中,老化動(dòng)物模型的應(yīng)用十分多見,其中自然衰老動(dòng)物模型和D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型應(yīng)用較為廣泛[5]。自然衰老動(dòng)物模型是在正常生活條件下,通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的飼養(yǎng),讓動(dòng)物正常地進(jìn)行生理發(fā)育直到老化的模型。該模型能較好地反映機(jī)體衰老的病理生理狀態(tài)。因此,相比于藥物或放射等人為干預(yù)致衰老的動(dòng)物模型而言,自然衰老動(dòng)物模型能較好吻合機(jī)體衰老的真實(shí)過(guò)程,最適宜用于衰老機(jī)理及延緩衰老藥物的研究[6]。本研究綜合多因素考慮,為較好反映中藥抗衰老作用及后續(xù)的機(jī)制研究,選擇自然衰老動(dòng)物模型作為研究對(duì)象。β-半乳糖苷酶是老化細(xì)胞在體外識(shí)別的一個(gè)重要標(biāo)志,本研究也顯示老年大鼠心肌細(xì)胞β-半乳糖苷酶明顯增高,而補(bǔ)腎活血方可以明顯降低其含量,表明補(bǔ)腎活血方對(duì)衰老心肌具有保護(hù)作用。

    現(xiàn)代研究認(rèn)為,細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基的有害作用是造成衰老過(guò)程中退行性變化的原因,機(jī)體的衰老過(guò)程與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[7]。其中體內(nèi)參與抗氧化反應(yīng)的酶類主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,其活性反映機(jī)體清除自由基的能力。CAT則是清除H2O2的主要酶,也是體內(nèi)所有酶中轉(zhuǎn)換率最高的酶。GSH-Px則可與SOD發(fā)揮協(xié)同作用,防止脂質(zhì)過(guò)氧化及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。GSH-Px和SOD活性隨機(jī)體的衰老而逐漸降低,體內(nèi)自由基增多,自由基作用于生物膜脂質(zhì)雙分子層中的不飽和脂肪酸,可引起脂質(zhì)過(guò)氧化,形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物。測(cè)定MDA水平能較好地反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平,可以作為評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)之一[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,補(bǔ)腎活血方可升高老年大鼠血清和心肌組織CAT、SOD活性,降低MDA水平,尤以高劑量組作用顯著,且呈一定的量-效關(guān)系,顯示出明顯的抗氧化損傷作用,對(duì)衰老大鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

    抑癌基因p16在衰老細(xì)胞中起重要的作用,p16基因與個(gè)體發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、衰老密切相關(guān)[9],它在復(fù)制衰老時(shí)多呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞衰老時(shí),p16基因的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平升高,抑制細(xì)胞有絲分裂,刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生RB蛋白的磷酸化,從而維持了衰老細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心肌組織p16的蛋白表達(dá)有明顯抑制作用,這種作用可抑制心肌衰老,對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

    綜上,補(bǔ)腎活血方對(duì)老年大鼠心肌有保護(hù)作用,其機(jī)制與其抗氧化損傷和抑制抑癌基因p16的表達(dá)有關(guān)。

    [1] 彭勇,張榮華,蔡宇,等.補(bǔ)腎活血法延緩衰老的機(jī)理探討[J].陜西中醫(yī),2004,25(2):142-144.

    [2] 江晶晶,江勵(lì)華,黃臻,等.補(bǔ)腎活血法在延緩大腦衰老過(guò)程中的應(yīng)用[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(6):1064-1067.

    [3] TUMHEIM K S. When drug the rapy gets old:pharmacok inetics and pharmacodynamics in the elderly[J]. Experimental Gerontology, 2003,38(8):843-853.

    [4] 楊偉峰,李貽奎,楊斌,等.補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠心肌梗塞后心肌纖維化干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)新藥雜志,2012,21(15):1792-1797.

    [5] 彭成.中醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.

    [6] 尹彤,徐斌,朱慶磊,等.自然衰老與半乳糖催老小鼠重要臟器的形態(tài)學(xué)差異[J].中國(guó)臨床康復(fù),2004,8(36):8248-8249,8266.

    [7] PARK D C, YEO S G. Aging[J]. Korean J Audiol,2013,17(2):39-44.

    [8] BOKOV A, CHAUDHURI A, RICHARDSON A, et al. The role of oxidative damage and stress in aging mechanism of aging and development[J]. Mechanism of Ageing and Development,2004,125(6):811-826.

    [9] BAKER D J, WIJSHAKE T, TCHKONIA T, et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders[J]. Nature,2011,479(7372):232-236.

    [10] RAYESS H, WANG M B, SRIVATSAN E S. Cellular senescence and tumor suppressor gene p16[J]. Int J Cancer,2012,130(8):1715-1725.

    [11] FUKUYO Y, TAKAHASHI A, HARA E, et al. E2FBP1 antagonizes the p16(INK4A)-Rb tumor suppressor machinery for growth suppression and cellular senescence by regulating promyelocytic leukemia protein stability[J]. Int J Oral Sci,2011,3(4):200-208.

    Effects of Bushen Huoxue Formula on Free Radical Metabolism and p16 Protein Expression in Heart of Aged Rats

    CHEN Liang1, CUI Kai-yu1, WU Yong1, YANG Wei-feng2(1. Hubei University of

    Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

    Objective To observe the effects of Bushen Huoxue Formula on free radical metabolism and p16 protein expression in heart of aged rats; To discuss its protective mechanism to the heart of aged rats. Methods One hundred were divided into young control group, the natural aging group, Bushen Huoxue Formula high-, medium- and low-dose groups, with 20 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage, once a day for 16 weeks. 1 hour after the last administration, after the rats were sacrificed, serum and heart were taken. The contents of NO and MDA and activities of CAT and SOD in serum and myocardial, β-galactosidase enzyme and p16 protein expression in myocardial tissue were detected. Results Compared with the natural aging group, NO content and SOD activity in the serum of rats in Bushen Huoxue Formula high-dose group increased significantly (P<0.05) and MDA content in all Bushen Huoxue Formula groups decreased (P<0.01); NO content, CAT and SOD activity in the myocardial tissue of rats in Bushen Huoxue Formula high-dose group increased significantly, and MDA content decreased significantly (P<0.05). CAT activity in all Bushen Huoxue Formula groups increased (P<0.05, P<0.01). β-galactosidase enzyme and p16 protein expression in myocardial tissue in all Bushen Huoxue Formula groups decreased. Conclusion Bushen Huoxue Formula can in hibit the aging of myocardial-aged rats, and the mechanism might be related to its anti-oxidative damage and inhibition of tumor suppressor gene p16 expression.

    Bushen Huoxue Formula; aging rats; oxidative stress; p16 protein expression

    10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.014

    R285.5

    A

    1005-5304(2017)01-0055-04

    2016-03-09)

    2016-03-29;編輯:華強(qiáng))

    湖北省自然科學(xué)基金(2012FKB02102)

    楊偉峰,E-mail:sunzhuyang@126.com

    猜你喜歡
    糖苷酶活血心肌
    伴有心肌MRI延遲強(qiáng)化的應(yīng)激性心肌病1例
    知母中4種成分及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    干細(xì)胞心肌修復(fù)的研究進(jìn)展
    復(fù)合心肌補(bǔ)片對(duì)小鼠梗死心肌的修復(fù)效果觀察
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    補(bǔ)腎活血祛瘀方治療中風(fēng)病恢復(fù)期100例
    活血舒筋湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變36例
    活血化痰法在糖尿病治療中的應(yīng)用
    β-葡萄糖苷酶與茶增香及抗病蟲害的研究進(jìn)展
    茶葉通訊(2014年4期)2014-02-27 07:55:49
    免费观看人在逋| 欧美日韩视频精品一区| 免费观看a级毛片全部| 国产成人91sexporn| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产一区二区在线观看av| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产欧美网| 飞空精品影院首页| 欧美人与善性xxx| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产在线一区二区三区精| 99re6热这里在线精品视频| 18在线观看网站| 免费av中文字幕在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产成人一区二区在线| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日本欧美国产在线视频| 午夜免费观看性视频| 久久99一区二区三区| 最近最新中文字幕免费大全7| 美女福利国产在线| 国产野战对白在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 热99国产精品久久久久久7| 在线观看人妻少妇| 国产成人精品在线电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99九九在线精品视频| 国产深夜福利视频在线观看| av有码第一页| 免费不卡黄色视频| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美av亚洲av综合av国产av | 久久精品国产综合久久久| 久久久久久久国产电影| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 中国三级夫妇交换| 最近手机中文字幕大全| 男女无遮挡免费网站观看| 男女免费视频国产| av一本久久久久| 最近的中文字幕免费完整| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 这个男人来自地球电影免费观看 | 岛国毛片在线播放| 亚洲av男天堂| 国产精品久久久久久精品电影小说| 搡老岳熟女国产| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 天天影视国产精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产 一区精品| 午夜老司机福利片| 精品午夜福利在线看| 一本久久精品| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产高清国产精品国产三级| 婷婷色av中文字幕| 亚洲成人av在线免费| 亚洲伊人久久精品综合| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久免费观看电影| 观看美女的网站| 老司机靠b影院| 国产一区二区三区综合在线观看| 免费不卡黄色视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本欧美视频一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 九色亚洲精品在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 成人国产麻豆网| 咕卡用的链子| 久久婷婷青草| 日本av免费视频播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 女性生殖器流出的白浆| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲欧美一区二区三区久久| 成年动漫av网址| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 啦啦啦在线免费观看视频4| 三上悠亚av全集在线观看| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99九九在线精品视频| 一级爰片在线观看| 又大又爽又粗| 国产1区2区3区精品| 九九爱精品视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 一级毛片电影观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人精品在线电影| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品久久久久久久性| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 欧美97在线视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产1区2区3区精品| 涩涩av久久男人的天堂| 男的添女的下面高潮视频| 成人影院久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 免费观看av网站的网址| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜免费鲁丝| 亚洲,一卡二卡三卡| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲精品在线美女| 精品视频人人做人人爽| 国产男女超爽视频在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一本久久精品| 男人舔女人的私密视频| 黄片小视频在线播放| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品美女久久av网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产不卡av网站在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 色播在线永久视频| 日韩视频在线欧美| 一区二区三区精品91| 一二三四中文在线观看免费高清| 美女中出高潮动态图| av在线观看视频网站免费| 国产1区2区3区精品| 一个人免费看片子| 亚洲美女黄色视频免费看| 精品少妇内射三级| 亚洲视频免费观看视频| 最新在线观看一区二区三区 | 1024视频免费在线观看| 高清不卡的av网站| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲美女黄色视频免费看| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品一二三| 在线观看免费午夜福利视频| 97人妻天天添夜夜摸| 99国产精品免费福利视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲成人一二三区av| 国产高清不卡午夜福利| 精品第一国产精品| 国产色婷婷99| 操出白浆在线播放| 免费黄色在线免费观看| 1024香蕉在线观看| 国产一区二区在线观看av| 下体分泌物呈黄色| 成人亚洲精品一区在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 精品一品国产午夜福利视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 免费黄色在线免费观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久久精品精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 这个男人来自地球电影免费观看 | 男的添女的下面高潮视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩欧美一区视频在线观看| 日日撸夜夜添| 国产精品蜜桃在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产av国产精品国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产一区二区三区av在线| 亚洲欧美清纯卡通| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一级片'在线观看视频| 999精品在线视频| 久久人妻熟女aⅴ| 在线观看国产h片| 十八禁高潮呻吟视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产又爽黄色视频| 成人国产麻豆网| 欧美精品亚洲一区二区| 99国产综合亚洲精品| 国产视频首页在线观看| 国产色婷婷99| 亚洲av男天堂| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线看a的网站| 国产99久久九九免费精品| 在线观看人妻少妇| 人人妻人人澡人人看| 9热在线视频观看99| 国产在线免费精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 99久久人妻综合| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产av国产精品国产| 成年动漫av网址| 亚洲欧洲国产日韩| 在线观看www视频免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久久久免费视频了| 成年动漫av网址| av福利片在线| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲成人国产一区在线观看 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 制服人妻中文乱码| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲成人一二三区av| 国产成人精品无人区| 国产免费视频播放在线视频| 蜜桃在线观看..| 亚洲免费av在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 大话2 男鬼变身卡| 咕卡用的链子| 不卡视频在线观看欧美| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本wwww免费看| 秋霞在线观看毛片| av网站免费在线观看视频| av卡一久久| 尾随美女入室| 欧美精品av麻豆av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99热网站在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品成人在线| 亚洲一区中文字幕在线| 国产免费现黄频在线看| 国产精品一区二区在线不卡| 两个人免费观看高清视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩欧美精品免费久久| 黄色一级大片看看| 久久久久久久精品精品| 高清视频免费观看一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 丝袜人妻中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品在线美女| 精品酒店卫生间| 亚洲熟女精品中文字幕| 中文字幕av电影在线播放| 国产深夜福利视频在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 男女国产视频网站| 妹子高潮喷水视频| 午夜福利在线免费观看网站| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品成人av观看孕妇| 捣出白浆h1v1| av片东京热男人的天堂| 国产片特级美女逼逼视频| 18禁国产床啪视频网站| 日本色播在线视频| 丰满少妇做爰视频| 精品人妻在线不人妻| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲精品自拍成人| 最近的中文字幕免费完整| 男女之事视频高清在线观看 | a级毛片黄视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲色图综合在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 两个人看的免费小视频| 久久av网站| 欧美另类一区| av视频免费观看在线观看| xxx大片免费视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产麻豆69| 国产精品蜜桃在线观看| 99香蕉大伊视频| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 国产色婷婷99| 一级片'在线观看视频| 无遮挡黄片免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品久久久久久久久免| 日本午夜av视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费高清在线观看日韩| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲成人av在线免费| 国产免费视频播放在线视频| videosex国产| 色播在线永久视频| 大陆偷拍与自拍| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| av福利片在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 两性夫妻黄色片| 热99国产精品久久久久久7| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 热re99久久国产66热| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成人国产av品久久久| www.av在线官网国产| 精品国产一区二区久久| 欧美另类一区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 麻豆av在线久日| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品 国内视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 国精品久久久久久国模美| 国产xxxxx性猛交| 街头女战士在线观看网站| 美国免费a级毛片| 国产伦理片在线播放av一区| 精品一区二区免费观看| 韩国av在线不卡| 在线天堂最新版资源| 国产一区二区 视频在线| 丝袜喷水一区| 波多野结衣一区麻豆| 高清欧美精品videossex| 久久av网站| 777米奇影视久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲成国产人片在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品国产av在线观看| 最新在线观看一区二区三区 | 午夜激情av网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品少妇久久久久久888优播| 久热这里只有精品99| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久99精品国语久久久| 老司机亚洲免费影院| 伦理电影大哥的女人| 久久影院123| 日韩欧美一区视频在线观看| 大码成人一级视频| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲人成电影观看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美最新免费一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人免费观看mmmm| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美精品一区二区免费开放| 水蜜桃什么品种好| 国产熟女欧美一区二区| 嫩草影院入口| 亚洲精品美女久久av网站| 激情五月婷婷亚洲| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品久久久精品久久久| 大香蕉久久网| 国产精品女同一区二区软件| 精品人妻在线不人妻| 在线观看三级黄色| 精品人妻一区二区三区麻豆| av免费观看日本| 下体分泌物呈黄色| 黄色一级大片看看| www.熟女人妻精品国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99热网站在线观看| 18禁观看日本| 国产成人精品无人区| 丝袜美足系列| 亚洲成人国产一区在线观看 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文字幕制服av| 亚洲人成电影观看| a级毛片黄视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色视频在线一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | √禁漫天堂资源中文www| 国产乱人偷精品视频| 美女主播在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 男的添女的下面高潮视频| 国产1区2区3区精品| 日日啪夜夜爽| 国产在线一区二区三区精| 美女大奶头黄色视频| 看免费av毛片| 赤兔流量卡办理| 久久久久国产一级毛片高清牌| 韩国精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲五月色婷婷综合| 男的添女的下面高潮视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲美女视频黄频| 九九爱精品视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成人三级做爰电影| 亚洲精品一二三| 国精品久久久久久国模美| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲国产精品国产精品| 午夜久久久在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 精品卡一卡二卡四卡免费| 满18在线观看网站| 性色av一级| 日韩精品有码人妻一区| 搡老岳熟女国产| 欧美精品av麻豆av| videosex国产| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久精品国产欧美久久久 | 蜜桃国产av成人99| 亚洲免费av在线视频| 久久久精品免费免费高清| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 9热在线视频观看99| 黄片无遮挡物在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久精品94久久精品| 伦理电影大哥的女人| 在现免费观看毛片| 大香蕉久久成人网| 国产乱人偷精品视频| 夫妻午夜视频| 亚洲中文av在线| 超碰成人久久| 久久99精品国语久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品欧美亚洲77777| 啦啦啦 在线观看视频| 国产在视频线精品| 只有这里有精品99| 91成人精品电影| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲成色77777| 老司机在亚洲福利影院| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品av久久久久免费| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人国产麻豆网| 一区福利在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美成人精品欧美一级黄| 大码成人一级视频| 捣出白浆h1v1| 成年人午夜在线观看视频| 一区在线观看完整版| 搡老岳熟女国产| 色视频在线一区二区三区| 黄频高清免费视频| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲国产欧美在线一区| 国产在线视频一区二区| 在线 av 中文字幕| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久狼人影院| 国产成人免费无遮挡视频| 中文天堂在线官网| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女扒开内裤让男人捅视频| 伦理电影大哥的女人| 国产 精品1| 又大又黄又爽视频免费| 赤兔流量卡办理| 好男人视频免费观看在线| 视频在线观看一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| 男女国产视频网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 天堂俺去俺来也www色官网| 色吧在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品久久久精品久久久| 街头女战士在线观看网站| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 观看美女的网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美日韩亚洲高清精品| 男女边吃奶边做爰视频| 国产男女超爽视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 久久久久视频综合| 久久久久精品人妻al黑| 欧美日韩av久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费看不卡的av| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久97久久精品| 久久久亚洲精品成人影院| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 天天添夜夜摸| 免费看av在线观看网站| 高清av免费在线| 国产免费现黄频在线看| 国产日韩欧美视频二区| 中文字幕色久视频| 国产一区二区激情短视频 | 老司机亚洲免费影院| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产av一区二区精品久久| 久久精品国产综合久久久| 黄片无遮挡物在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 精品少妇内射三级| 亚洲精品,欧美精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丝袜人妻中文字幕| 搡老岳熟女国产| 国产免费视频播放在线视频| 最新的欧美精品一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 久久97久久精品| 午夜日本视频在线| 国产精品久久久av美女十八| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 色精品久久人妻99蜜桃| 无遮挡黄片免费观看| 国精品久久久久久国模美| 麻豆av在线久日| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产1区2区3区精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产xxxxx性猛交| 丝袜美足系列| 亚洲美女黄色视频免费看| h视频一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品无大码| 一区二区日韩欧美中文字幕| 咕卡用的链子| 99香蕉大伊视频| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 久久这里只有精品19| 99re6热这里在线精品视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久久精品94久久精品| 免费观看av网站的网址|