泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與新城疫病毒的早期復(fù)制

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，孟春春，丁 鏟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與新城疫病毒的早期復(fù)制

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，孟春春，丁 鏟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為了研究泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）具體參與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）復(fù)制的哪個階段，本研究通過在NDV感染不同階段加入泛素-蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑MG-132，結(jié)合使用蛋白酶K試驗證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)并未參與NDV入侵細(xì)胞的過程，而是參與了NDV入侵細(xì)胞之后的復(fù)制早期階段（0～6 h）。再利用蔗糖密度梯度離心試驗分離細(xì)胞內(nèi)體，使用針對內(nèi)體標(biāo)志蛋白Rab5的抗體確定內(nèi)體位于第8～10層。建立了檢測Herts/33毒株P(guān)基因的絕對熒光定量方法，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。并通過該絕對熒光定量法比較MG-132和DMSO處理的細(xì)胞內(nèi)體中病毒含量，發(fā)現(xiàn)使用抑制劑處理的細(xì)胞內(nèi)體所在層中病毒含量較高，提示蛋白酶體抑制劑可以使NDV滯留于細(xì)胞內(nèi)體中。本研究首次證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與了NDV進(jìn)入細(xì)胞后從內(nèi)體釋放出來的過程。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；新城疫病毒；MG-132；內(nèi)體

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種多邊形的有囊膜的病毒，病毒粒子直徑大約200～300 nm。其基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA[1]。新城疫病毒是一種在經(jīng)濟(jì)上非常重要的禽類病毒，它可以導(dǎo)致家禽養(yǎng)殖業(yè)巨大的損失[2]。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是真核細(xì)胞中除溶酶體系統(tǒng)外最重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。靶蛋白的泛素化過程一般為泛素活化酶E1通過自身活性位點的半胱氨酸殘基與泛素分子的羧基末端進(jìn)行共價結(jié)合以激活泛素分子。這種含有高能硫酯鍵的泛素分子通過E1的活性位點傳遞至下一級反應(yīng)，即與泛素連接酶E2反應(yīng)。最終泛素蛋白連接酶E3與結(jié)合在E2上的泛素分子和底物蛋白相結(jié)合，將泛素分子轉(zhuǎn)移至底物蛋白上。最終26S蛋白酶體識別并降解已被K48位泛素化修飾的靶蛋白，完成蛋白質(zhì)降解過程[3]。

相關(guān)研究表明冠狀病毒屬中的鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）在使用蛋白酶體抑制劑MG-132后，會被滯留于內(nèi)體（Endosome），或被錯誤誘導(dǎo)至溶酶體（Lysosome）中，阻礙其進(jìn)一步復(fù)制。證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到MHV從內(nèi)體釋放到細(xì)胞質(zhì)的過程中[4]。通過全基因組的RNA干擾篩選發(fā)現(xiàn)一種泛素蛋白連接酶（E3）-Itch蛋白，在Itch蛋白被敲除的細(xì)胞中，流感病毒的病毒核糖核蛋白復(fù)合體可以正常進(jìn)入內(nèi)體，但卻無法從內(nèi)體中釋放出來，這也說明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與流感病毒從內(nèi)體釋放出來的過程[5]。

之前的實驗已經(jīng)初步驗證泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV在細(xì)胞中的復(fù)制[6]。但NDV在進(jìn)入細(xì)胞后，是否也要利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)助其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移卻不清楚。為了進(jìn)一步探索泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV復(fù)制的具體機(jī)制，我們首先利用蛋白酶體抑制劑MG-132確定了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV復(fù)制的早期階段。在初步確定相關(guān)的時間階段后，利用蛋白酶K試驗，確定泛素-蛋白酶體不參與NDV入侵細(xì)胞的過程，而僅參與到入侵細(xì)胞后復(fù)制的早期階段。最后我們利用蔗糖密度梯度離心法來分離細(xì)胞內(nèi)體（Endosome），建立絕對熒光定量法檢測Herts/33毒株P(guān)基因，證明當(dāng)使用蛋白酶體抑制劑MG-132時，大量NDV會被滯留于內(nèi)體中，證明NDV在復(fù)制早期階段會利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)助其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

本試驗所用病毒毒株為NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒Herts/33毒株，由揚州大學(xué)劉秀梵院士惠贈；雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1細(xì)胞和人子宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞由本實驗室保存，細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 蛋白酶體抑制劑階段性加入實驗

參考文獻(xiàn)[4]方法，接種DF1細(xì)胞至35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至90%時，將培養(yǎng)皿分成6組，分別為a組（無MG-132處理）、b組（MG-132預(yù)處理2 h）、c組（MG-132全程處理）、d組（MG-132處理0～6 h）、e組（MG-132處理6～12 h）和f組（MG-132處理12-18 h）。按照該分組方式使用蛋白酶體抑制劑MG-132（10 μmol/mL），每組細(xì)胞都接種1 MOI Herts/33病毒。在病毒感染后6、12、18、24 h收取細(xì)胞上清，并再次換上1.5 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。檢測每個時間點收取細(xì)胞上清TCID50值，結(jié)果按照Reed-Muench法計算。

1.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對NDV入侵過程的影響

1.3.1 蛋白酶K藥物濃度篩選試驗 將DF1細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至90%時，接種1 MOI Herts/33株病毒，置于4℃培養(yǎng)15 min，用PBS漂洗3次后將一個培養(yǎng)皿繼續(xù)置于4℃培養(yǎng)，使NDV僅吸附在細(xì)胞上，另一個培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)15 min，使已經(jīng)吸附在細(xì)胞膜上的NDV可以入侵細(xì)胞。將蛋白酶K進(jìn)行系列稀釋，分別稀釋為0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL，作用細(xì)胞5 min后，用PBS漂洗3次以去除殘留的蛋白酶體K。換上含有3%FBS的維持培養(yǎng)后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收取細(xì)胞上清，檢測其TCID50值。在這個試驗中蛋白酶K被用于洗去吸附于細(xì)胞表面但未能入侵的病毒粒子。蛋白酶K是從林伯氏白色念球菌中純化得到的一種高活性蛋白酶，可用于一般生物樣品中蛋白質(zhì)的降解，切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵[7]。

1.3.2 蛋白酶K藥物試驗 DF1細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至90%時，其中2個培養(yǎng)皿使用10 μmol/mL MG-132處理細(xì)胞2 h，另設(shè)2個相同稀釋度DMSO處理細(xì)胞培養(yǎng)皿。抑制劑預(yù)處理2 h后接種1 MOI Herts/33株病毒，立即將細(xì)胞置于4℃冰箱孵育15 min，用PBS漂洗3次后，換上無抗無血培養(yǎng)基，將一個MG-132處理培養(yǎng)皿和一個DMSO處理培養(yǎng)皿繼續(xù)置于4℃培養(yǎng)15 min，另一組的2個培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)15 min。用0.5 μg/mL蛋白酶K作用細(xì)胞5 min以去除吸附于細(xì)胞表面但未能入侵的病毒粒子，PBS漂洗3次以去除殘留的蛋白酶K。換上維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，12 h之后收取每個培養(yǎng)皿的上清并檢測計算上清TCID50值。

1.3.3 肝素鈉陽性對照試驗 DF1細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至80～90%時，其中一個培養(yǎng)皿用100 μg/mL肝素鈉預(yù)處理2 h，另一個培養(yǎng)皿使用10 μmol/mL MG-132預(yù)處理2 h，作為空白對照的培養(yǎng)皿中只加入無抗無血DMEM培養(yǎng)基。預(yù)處理2 h后，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，感染1 MOI Herts/33病毒后立即置于4℃培養(yǎng)15 min，用PBS清洗3次，換上新鮮培養(yǎng)基后都置于37℃培養(yǎng)15 min，0.5 μg/mL蛋白酶K 處理5 min后，用PBS漂洗3次以去除殘留的蛋白酶體K。換上維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，12 h之后收取每個培養(yǎng)皿的上清并檢測計算TCID50值。文獻(xiàn)報道肝素鈉能阻斷病毒入侵[8]，在本試驗中作為影響病毒入侵的陽性對照藥物。

1.4 蛋白酶體抑制劑對新城疫病毒入侵后影響

1.4.1 蔗糖密度梯度離心 將HeLa細(xì)胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長至90%時，使用0.4 μmol/mL的MG-132預(yù)處理細(xì)胞2 h，接種1 MOI Herts/33株病毒，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h，再換上含有MG-132的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h。設(shè)置相同稀釋度的DMSO處理組。將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗3次后，置于冰上，使用Homogenization buffer（100 mL水，250 mmol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF）裂解細(xì)胞，每個培養(yǎng)皿中加入500 μL Homogenization buffer，冰上裂解30 min后，收集裂解液通過22-G（6.5號）針頭10次，4℃、1000×g的離心15 min，取上清即為PNS（已提取過核酸的上清）。輕輕滴加60%蔗糖溶液，將PNS中蔗糖濃度調(diào)整為40.6%。將2.4 mL上述蔗糖濃度為40.6%的PNS溶液置于13.8 mL超速離心管底層，在上面緩慢加入4.8 mL 35%蔗糖溶液，再上一層為1.5 mL 25%蔗糖溶液，最上一層為1 mL Homogenization buffer。另一個離心管中以同樣方式加入DMSO處理的細(xì)胞樣品，兩個離心管配平后在超速離心機(jī)中以4℃、100 000×g離心1 h。離心結(jié)束后從上至下取出10層溶液置于離心管中，凍存于-80℃。

1.4.2 蔗糖密度梯度離心分層結(jié)果鑒定 從蔗糖密度梯度離心收取的各層溶液中取出80 μL溶液，加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水煮10 min，進(jìn)行Western blot試驗。使用的抗體為針對早期內(nèi)體（Endosome）標(biāo)志物的Anti-Rab5抗體和針對細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志物的 Anti-actin抗體。

1.4.3 蔗糖密度梯度離心分層樣品脫糖及cDNA樣品制備 取實驗1.4.1蔗糖密度梯度離心各層樣品各500 μL置于無RNA酶的離心管中，在其中加入1 mL無水乙醇，混勻后置于-40℃過夜，4℃、12 000×g離心20 min。棄去上清并將離心管液體全部吸干，加入500μL DEPC水溶解即為脫糖樣品，提取脫糖樣品RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4.4 絕對熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)Herts/33病毒 P基因核苷酸序列，設(shè)計并合成1對特異性熒光定量PCR引物。Herts/33-F：5'-ATTTCAGGT CCCGGAGATCC-3'；Herts/33-R：5'-GAGGTG ATCAATGCACGGAC-3'。以Herts/33 P基因質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)其濃度和質(zhì)粒片段長度計算拷貝數(shù)/μL。將該質(zhì)粒進(jìn)行稀釋后作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板。將Herts/33病毒P基因質(zhì)粒稀釋成8個稀釋度，作為模板進(jìn)行Real-time PCR，其PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)后，以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)即log（DNA copies）為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4.5 Real-time PCR法檢測蔗糖密度梯度離心各層樣品 采用試驗1.4.4中相同的Real-time PCR反應(yīng)程序，對蔗糖密度梯度離心后各層樣品cDNA進(jìn)行Real-time PCR試驗，多次檢測后取Ct值的平均值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以計算蔗糖密度梯度離心分離各層樣品中Herts/33病毒P基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 泛素-蛋白酶體參與到NDV增殖的早期階段

我們通過將蛋白酶體抑制劑MG-132的分階段加入結(jié)合細(xì)胞上清病毒滴度檢測試驗來確定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV感染周期的關(guān)鍵性階段，可以從圖1看出當(dāng)全程使用MG-132時，細(xì)胞上清的病毒滴度一直都較低。在0～6 h階段，病毒處在早期增殖階段，每個處理組的病毒滴度都較低，而從6 h開始病毒逐漸增殖，上清中病毒的滴度達(dá)到頂峰。在復(fù)制早期階段（0～6 h）時，c處理組（全程處理）和d處理組（0～6 h處理）的上清病毒滴度最低，而b處理組（2 h預(yù)處理）對病毒滴度的抑制作用幾乎沒有。在病毒增殖的中期和晚期，除了c處理組（全程處理）的病毒滴度受到抑制，其余處理組的病毒滴度與未使用MG-132的空白組幾乎一樣。由此初步證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV復(fù)制早期階段。

圖1 處理各個時間段細(xì)胞上清中的病毒滴度Fig.1 The virus titers of each time period in culture medium

2.2 蛋白酶K工作濃度確定

DF1細(xì)胞感染1 MOI病毒后，立即置于4℃讓病毒吸附15 min后用PBS洗去未吸附的病毒，將一組細(xì)胞繼續(xù)置于4℃，只吸附而沒有或極少病毒可以入侵；另一組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱，使已吸附的病毒粒子可以侵入細(xì)胞；最后兩組細(xì)胞分別用12種不同濃度的蛋白酶K處理5 min，洗去未入侵的病毒，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測上清TCID50值。試驗過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍酌窴濃度大于0.5 μg/mL時，處理5 min后細(xì)胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，說明蛋白酶K濃度過大。而當(dāng)濃度為0.25 μg/mL、0.2 μg/mL或0.1 μg/mL時，無論細(xì)胞是否有37℃的入侵階段，病毒滴度都不發(fā)生改變，說明蛋白酶K的濃度過低，未能洗去未入侵的病毒。而當(dāng)?shù)鞍酌窴濃度為0.5 μg/mL時，一直置于4℃培養(yǎng)的細(xì)胞上清病毒滴度比轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)的細(xì)胞上清滴度要低100.56，說明0.5 μg/mL蛋白酶K處理5 min，可以洗去吸附于細(xì)胞膜表面的病毒。由此，最終確定蛋白酶K 的工作濃度為0.5 μg/mL。

2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)未參與NDV入侵

用10 μmol/mL的MG-132和相同稀釋度的DMSO分別預(yù)處理細(xì)胞2 h后，感染1 MOI Herts/33病毒并先置于4℃使病毒吸附15 min，用PBS洗去細(xì)胞表面未吸附的病毒后，分為兩組，一組繼續(xù)置于4℃、15 min，另一組置于37℃入侵15 min。以0.5 μg/mL蛋白酶K作用5 min處理未入侵病毒后，用PBS漂洗3次，以去除殘留的蛋白酶K，換上維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，檢測細(xì)胞上清TCID50。結(jié)果顯示，當(dāng)將細(xì)胞一直置于4℃時，MG-132處理組病毒滴度為103.67/0.1 mL，DMSO組的病毒滴度為103.72/0.1 mL；當(dāng)細(xì)胞先置于4℃，后置于37℃，使病毒入侵時，MG-132處理組病毒滴度為104.1/0.1 mL，DMSO組的滴度為103.96/0.1 mL。以上結(jié)果暗示，無論病毒入侵細(xì)胞的階段存在與否，蛋白酶體抑制劑MG-132對NDV的入侵沒有影響（圖2）。

圖2 蛋白酶體抑制劑MG-132對病毒入侵的影響Fig.2 Effect of proteasome inhibitor MG-132 on NDV internalization

以相同的試驗方法，使用MG-132和肝素鈉這2個藥物，肝素鈉可以阻斷病毒粒子吸附細(xì)胞作為陽性對照藥物，空白細(xì)胞組的TCID50為104.25/0.1 mL，MG-132處理組的病毒滴度為104.25/0.1 mL，而肝素鈉處理組的病毒滴度為103.8/0.1 mL。發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶體抑制劑MG-132對病毒入侵無影響，而使用肝素鈉的細(xì)胞，因阻止病毒吸附進(jìn)而影響入侵細(xì)胞的病毒粒子數(shù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞上清中病毒滴度降低。由此，進(jìn)一步證實泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV感染的早期階段，雖然不參與入侵階段，但是參與NDV入侵細(xì)胞之后的早期復(fù)制階段（圖3）。

圖3 蛋白酶體抑制劑MG-132和肝素鈉對病毒入侵的影響Fig.3 Effect of proteasome inhibitor MG-132 and Heparin on virus internalization

2.4 蔗糖密度梯度離心后分層結(jié)果

我們用MG-132和DMSO分別作用于HeLa細(xì)胞，預(yù)處理2 h后，感染1 MOI Herts/33病毒后，繼續(xù)用MG-132和DMSO處理細(xì)胞3 h。處理細(xì)胞后進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，離心結(jié)束后從上至下逐層取出1～-10層。使用針對早期內(nèi)體標(biāo)志物的抗體anti-Rab5進(jìn)行Western blot試驗，結(jié)果表明，該蔗糖密度梯度離心法將內(nèi)體主要分離至8～-10層（圖4）。

圖4 蔗糖密度梯度離心分層鑒定Fig.4 Identification of the samples of sucrose density gradient centrifugation

2.5 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

所制備的Herts/33病毒P基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為378.8 ng/μL，質(zhì)粒大小為1200 bp，換算成拷貝數(shù)為2.881×1014copies/μL。將該標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒從5-5～5-12稀釋成8個稀釋度，取每個稀釋度質(zhì)粒2μL作為模板進(jìn)行Real-time PCR，在多次試驗確定最終反應(yīng)條件之后，同時進(jìn)行重復(fù)性試驗。在這個稀釋范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以平均Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.3024X+47.4777，R2為0.9996（圖5）。

圖5 Herts/33病毒P基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of Herts/33 P gene

2.6 蛋白酶體抑制劑對NDV入侵細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)分布的影響

我們將蔗糖密度梯度離心后各層樣品提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為Real-time PCR反應(yīng)的模板，檢測使用蛋白酶體抑制劑MG-132和使用相同稀釋度DMSO處理細(xì)胞中病毒分布情況的差異。將多次檢測結(jié)果Ct值取平均值后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每層樣品中Herts/33病毒P基因的拷貝數(shù)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用蛋白酶體抑制劑MG-132后，第8、9、10層中病毒含量比不使用該抑制劑對照組中病毒含量高，且差異顯著（圖6），而根據(jù)Western blot實驗結(jié)果顯示，第8、9、10層為內(nèi)體所在的層，我們推測當(dāng)使用蛋白酶體抑制劑后，NDV有可能會被滯留于內(nèi)體。

圖6 蛋白酶體抑制劑MG-132導(dǎo)致NDV滯留于內(nèi)體Fig.6 The proteasome inhibitor MG-132 retained the NDV in the endosomes

3 討論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中發(fā)揮降解蛋白質(zhì)功能的26S蛋白酶體，由一個催化核心即20S蛋白酶體分子和位于兩端的兩個19S調(diào)節(jié)復(fù)合體組成。MG-132是一種肽醛類20S蛋白酶體活性抑制劑，它通過與20S蛋白酶體的β內(nèi)環(huán)上活性位點的蘇氨酸氨基端羥基形成共價半縮醛鍵而抑制其蛋白水解活性，是一種常用的泛素-蛋白酶體抑制劑[9]。已經(jīng)有文獻(xiàn)報道泛素-蛋白酶體參與到新城疫病毒的復(fù)制，但該系統(tǒng)參與到新城疫病毒復(fù)制的具體階段卻還不清楚，所以在本實驗中，我們使用MG-132階段性加入，結(jié)合NDV感染實驗，來確定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV感染的何種階段，結(jié)果顯示，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV感染早期階段（0～6 h）。

為了進(jìn)一步確定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是參與到NDV入侵細(xì)胞的階段還是入侵之后的早期復(fù)制階段，我們設(shè)計實驗利用蛋白酶K處理吸附于細(xì)胞表面但還未入侵的病毒粒子。發(fā)現(xiàn)無論是否使用蛋白酶體抑制劑MG-132，NDV在只有吸附過程或同時具有37℃入侵階段時，病毒的增殖都未受到MG-B2的影響，這就說明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)并未參與NDV入侵細(xì)胞的過程。再結(jié)合上述MG-132階段性加入的試驗結(jié)果，我們得出一個初步的結(jié)論，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV進(jìn)入細(xì)胞后早期復(fù)制階段。

早期內(nèi)體一般是內(nèi)吞途徑中用于運輸內(nèi)吞物質(zhì)的囊性小泡，將內(nèi)吞物質(zhì)從細(xì)胞膜表面運送至晚期內(nèi)體和溶酶體之中[10]。副粘病毒屬需要通過識別細(xì)胞上受體蛋白，繼而病毒囊膜與細(xì)胞受體膜發(fā)生融合才能引起病毒感染。在膜融合的過程中，F(xiàn)蛋白在內(nèi)體酸性環(huán)境中發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變是至關(guān)重要的一步[11]。NDV通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞后，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是否參與到NDV進(jìn)入內(nèi)體，并從內(nèi)體釋放的過程是我們關(guān)心的。

為了驗證這一假設(shè)，我們采用蔗糖密度梯度離心的方法分離細(xì)胞內(nèi)體，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報道，我們將細(xì)胞樣品制備成含有40.6%的蔗糖溶液，置于離心管最底層，離心時內(nèi)體逐漸上浮，達(dá)到特定蔗糖密度的所在層。Rab5、Rab7、Rab9和Rab11都是比較好的早期內(nèi)體的標(biāo)志物，在我們的試驗中采用anti-Rab5抗體用于檢測是否分離到內(nèi)體，并確定內(nèi)體分離至8、9、10這三層。我們先制備Herts/33株NDV P基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以此標(biāo)準(zhǔn)品做模板繪制絕對熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)Western blot實驗結(jié)果，將蔗糖密度梯度離心樣品進(jìn)行脫糖，并提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA當(dāng)做模板進(jìn)行絕對熒光定量PCR試驗。將各層樣品中檢測數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每層樣品P基因表達(dá)拷貝數(shù)，結(jié)果顯示在蔗糖密度梯度離心所分離的8、9、10層中，MG-132處理的細(xì)胞中NDV含量比DMSO處理的細(xì)胞要高。從這一試驗的結(jié)果，我們推測，蛋白酶體抑制劑的加入很有可能將NDV滯留于內(nèi)體中，阻止其從內(nèi)體釋放出來，進(jìn)而阻止其基因組RNA的復(fù)制?？傊?，本研究初步證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV入侵細(xì)胞后復(fù)制早期從內(nèi)體釋放出來的過程。

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THE UBIQUITIN-PROTEASOME SYSTEM PARTICIPATES IN THE EARLY STAGE OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS REPLICATION

QU Yu-rong, ZHAN Yuan, QIU Xu-sheng, TAN Lei, SUN Ying-jie, SONG Cui-ping, MENG Chun-chun,DING Chan
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The proteasome system inhibitor MG-132 together with the protease K were used to study the role of ubiquitin-proteasome system (UPS) in the specific replication stage of Newcastle disease virus (NDV) in host cells. The results showed that the ubiquitin-proteasome system did not participate in the NDV invasion stage but was involved in the early stage of replication (0-6 h) after the invasion of the cells. The intracellular endosomes were isolated at 8-10 layers using sucrose density gradient centrifugation assay and confirmed using antibodies against the endosome marker protein Rab5. The absolute fluorescence quantitative method for detecting the P gene of Herts / 33 strain was developed to detect the viruses in endosomes from MG-132 treated cells and DMSO treated cells. It concluded that the MG-132 treated cells had higher viral content in the endosomes, suggesting that ubiquitin-proteasome system inhibited NDV release from endosomes.

Ubiquitin-proteasome system; Newcastle disease virus; MG-132; endosome

2017-05-19

國家自然科學(xué)基金（31372421、31530074 ）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303033）

曲昱蓉，女，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0001-07