口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中Bcl-2、CDK2AP1的基因表達(dá)和臨床意義

張國(guó)富，高建明

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 口腔科，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，湖北 宜昌 443002）

口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中Bcl-2、CDK2AP1的基因表達(dá)和臨床意義

張國(guó)富1，高建明2

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 口腔科，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，湖北 宜昌 443002）

目的研究在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌組織中Bcl-2和CDK2AP1的表達(dá)情況及臨床意義。方法運(yùn)用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)組織中Bcl-2、CDK2AP1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在口腔正常黏膜組織、口腔黏膜白斑組織和口腔鱗癌組織中Bcl-2蛋白細(xì)胞陽(yáng)性率依次為（2.72±1.45）%、（19.29±8.18）%和（57.20±19.37）%；CDK2AP1蛋白細(xì)胞陽(yáng)性率依次為（62.68±11.07）%、（25.68±8.17）%和（7.87±2.18）%。Bcl-2和CDK2AP1 mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平一致。各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論隨著口腔病變惡性程度增高，在口腔正常黏膜、口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中Bcl-2表達(dá)水平上升，而CDK2AP1表達(dá)水平降低，這2個(gè)指標(biāo)可能與口腔腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。

Bcl-2；CDK2AP1；口腔黏膜白斑；口腔鱗癌

近年來(lái)，隨著生活的環(huán)境、習(xí)慣及飲食等結(jié)構(gòu)的變化，口腔癌前病變及口腔鱗癌呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，發(fā)病率有明顯的上升?？谇火つぐ装呤亲畛Ｒ?jiàn)的口腔角化異常，往往伴有上皮異常增生，屬于癌前病變，研究表明，4%～6%[1]的口腔黏膜白斑惡變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌?？谇击[癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的2%～4%，其5年生存率僅30%～40%[2-3]，嚴(yán)重威脅人們的生活和健康?？谇活M面部腫瘤病因復(fù)雜，涉及多種癌基因和抗癌基因的功能改變和相互作用以及環(huán)境和飲食習(xí)慣，本研究通過(guò)對(duì)口腔黏膜白斑惡變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌中B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2-相關(guān)蛋白1(cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1，CDK2AP1）表達(dá)的檢測(cè)，觀察其在口腔白斑癌變過(guò)程中的變化，可為口腔鱗癌的早期診斷、治療以及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料選取2015年3～10月于湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科收治的患者，口腔正常黏膜組織12例；口腔黏膜白斑11例，口腔鱗癌8例，標(biāo)本來(lái)自宜昌市中心醫(yī)院和一醫(yī)院口腔科。所有患者均有完整的隨訪資料，術(shù)后均由病理科確診。

1.1.2 主要試劑鼠抗人抗體Bcl-2和鼠抗人抗體CDK2AP1（購(gòu)自上海博英生物有限公司），二步法檢測(cè)試劑盒、即用型SABC試劑盒和酶底物DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供），Oligod T（購(gòu)自上海生工生物有限公司），逆轉(zhuǎn)錄酶Revert AidTMM-MuLV（購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司），SYBR Premix Ex TaqTM（購(gòu)自TaKaRa公司），Bcl-2、CDK2AP1和β-actin基因的引物（由上海鉑尚生物合成）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)（免疫組化）結(jié)果分析Bcl-2蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，棕黃色顆粒；CDK2AP1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。在高倍鏡下進(jìn)行結(jié)果評(píng)估方法參照CAMPO等[4]標(biāo)準(zhǔn)綜合計(jì)分。基本不著色為0分，著色弱為1分，著色中度的為2分，著色強(qiáng)的為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例為4個(gè)等級(jí)：0～5%為 0分，6%～25%為 1分，25%～50%為2分，50%～為3分。最后以陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度計(jì)分之和所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定：0分為陰性（-）；1、2分為弱陽(yáng)性（+）；3、4分為中等陽(yáng)性（++）；5分或6分以上為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

附表 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA的引物序列

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用Taq Man U-niversal PCR Master Mix和Taq Man microRNA AssayKit檢測(cè)樣本中 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA含量。采用的特異性引物序列為見(jiàn)附表。

反應(yīng)條件為95℃ 5 min變性；95℃ 30 s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得到各個(gè)標(biāo)本和內(nèi)參β-actin的基本循環(huán)數(shù)（Ct值）。根據(jù)公式計(jì)算目的基因相對(duì)含量：2-△△Ct，即 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2蛋白表達(dá)情況

Bcl-2蛋白在人正?？谇火つそM織中陽(yáng)性細(xì)胞分散在上皮基底層；在口腔黏膜白斑組織中隨著上皮異常增生程度的增加，其陽(yáng)性細(xì)胞也呈進(jìn)一步的增加，分布范圍從上皮基底層向表層擴(kuò)散，甚至可達(dá)上皮全層；在口腔鱗癌組織中，Bcl-2蛋白分布于浸潤(rùn)性鱗癌的癌性團(tuán)塊、條索和浸潤(rùn)癌細(xì)胞之中。見(jiàn)圖1。

在人正常口腔黏膜上皮細(xì)胞中Bcl-2蛋白微量或少部分陽(yáng)性表達(dá)，其平均陽(yáng)性率為（2.72±1.45）%，在口腔白斑上皮細(xì)胞平均陽(yáng)性率為（19.29±8.18）%。而在口腔鱗癌細(xì)胞組織中Bcl-2蛋白大部分組織呈陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞平均陽(yáng)性率為（57.20±19.37）%。3組Bcl-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=23.504，P=0.000），且經(jīng)兩兩比較，任意兩組間Bc1-2蛋白細(xì)胞陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Bcl-2蛋白在不同組織中的表達(dá)

2.2 CDK2AP1蛋白表達(dá)情況

CDK2AP1蛋白在人正常口腔黏膜組織中陽(yáng)性細(xì)胞分散在上皮基底層，在口腔黏膜白斑組織中隨著上皮異常增生程度的增加而減少，在口腔鱗癌組織中，CDK2AP1蛋白分布于浸潤(rùn)性鱗癌的癌性團(tuán)塊、條索和浸潤(rùn)癌細(xì)胞之中，癌組織中癌巢周?chē)年?yáng)性表達(dá)強(qiáng)于癌巢中央，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少。見(jiàn)圖2。

圖2 CDK2AP1蛋白在不同組織中的表達(dá)

在人正?？谇火つど掀ぶ蠧DK2AP1蛋白大部分組織呈陽(yáng)性表達(dá)，其細(xì)胞平均陽(yáng)性率為（62.68±11.07）%，在口腔白斑上皮細(xì)胞平均陽(yáng)性率為（25.68±8.17）%。而在口腔鱗癌細(xì)胞組織中CDK2AP1蛋白微量或少部分陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞平均陽(yáng)性率為（7.87±2.18）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在口腔正常黏膜、口腔黏膜白斑、口腔鱗狀細(xì)胞癌中CDK2AP1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=25.172，P=0.000），且經(jīng)兩兩比較，任意兩組間CDK2AP1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 Bcl-2 mRNA表達(dá)情況

正常口腔黏膜、口腔黏膜白斑和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=36.840，P=0.000），兩兩比較結(jié)果顯示，口腔白斑組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平與正?？谇火つそM織中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平相比前者升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而口腔鱗癌組織中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平最高（P＜0.05），與口腔黏膜白斑組織和正?？谇火つそM織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 CDK2AP1 mRNA表達(dá)情況

圖3 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA在正常口腔黏膜組織、口腔黏膜白斑組織、口腔鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)情況

正?？谇火つぁ⒖谇火つぐ装吆涂谇击[狀細(xì)胞癌組織中CDK2AP1 mRNA表達(dá)水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=19.271，P=0.000），兩兩比較結(jié)果顯示，口腔黏膜白斑組織中CDK2AP1 mRNA表達(dá)水平比口腔鱗癌組織中CDK2AP1的mRNA表達(dá)水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而口腔正常黏膜中CDK2AP1的mRNA表達(dá)水平在3者之中最高，與口腔黏膜白斑組織和口腔鱗癌組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

Bc1-2基因是一種抑制凋亡基因，該蛋白位于細(xì)胞中的線粒體內(nèi)膜、核膜及胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[5]。Bc1-2可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致癌變[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bc1-2蛋白在正?？谇火つた梢?jiàn)微量表達(dá)，在口腔黏膜白斑中呈部分陽(yáng)性表達(dá)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，各組間Bc1-2蛋白的表達(dá)有差異，可推斷Bc1-2蛋白在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌的發(fā)病過(guò)程中可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，從而使DNA受損的細(xì)胞得以存活、復(fù)制，破壞細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，繼而誘導(dǎo)癌基因的激活和抑癌基因的失活，產(chǎn)生癌變[7-8]。Bc1-2蛋白在鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)較白斑上皮細(xì)胞的表達(dá)水平增高，可能是在鱗癌組織中有更多的DNA受損細(xì)胞得以存活、累積，使得Bcl-2在鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平增高，這或許能為口腔鱗癌的治療提供一個(gè)新思路。

CDK2AP1是在倉(cāng)鼠的口腔癌模型研究中最先被TODD等發(fā)現(xiàn)[9]，在細(xì)胞各周期的調(diào)控過(guò)程中起到很大作用，可以讓各種信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行傳遞，通過(guò)整合匯集到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖[10-11]。在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，依賴性激酶CDK4C能和Gi/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控因子DK2AP1發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)一步讓S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，從而加劇G期的細(xì)胞進(jìn)入S期，最終讓細(xì)胞增殖失去控制[12-13]。由此可見(jiàn)口腔黏膜組織的病變發(fā)生與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂關(guān)系密切，細(xì)胞周期的調(diào)控因子發(fā)生異常變化可以導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)失控性生長(zhǎng)，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在口腔正常黏膜組織、口腔黏膜白斑組織和口腔鱗癌組織中CDK2AP1表達(dá)率依次降低。各組間有差異，說(shuō)明CDK2AP1在口腔黏膜組織惡變的初始階段就已經(jīng)參與并起到一定的作用，并且在口腔黏膜中的陽(yáng)性表達(dá)率有隨著組織的惡變程度增強(qiáng)而減弱的趨勢(shì)，可以初步判斷CDK2AP1蛋白與口腔的惡性病變程度相關(guān)。

綜上所述，同時(shí)用免疫組化和qRT-PCR兩種方法檢測(cè)Bc1-2蛋白和CDK2AP1蛋白在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中的表達(dá)情況，不僅可以了解口腔白斑和口腔鱗癌的癌變過(guò)程，而且可以為患者早期診斷和干預(yù)提供分子生物學(xué)支持。

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Expression and clinical value of Bcl-2 and CDK2AP1 in oral leukoplakia and oral squamous carcinoma tissue

Guo-fu Zhang1,Jian-ming Gao2
(1.Department of Stomatology,the Affiliated Hospital of Hubei Three Gorges Professional Technology College,Yichang,Hubei 443002,China;2.Department of Physiology and Pathophysiology,Three Gorges University School of Medicine,Yichang,Hubei 443002,China)

Absract:ObjectiveTo investigate expression levels of Bcl-2 and CDK2AP1 in oral leukoplakia and oral squamous carcinoma tissue and its potential clinical value.MethodsPatient samples of oral leukoplakia,oral squamous carcinoma and normaltissue were collected in this study.Immunohistochemistry and the fluorescence quantitative PCR were utilized to identify expression ofBcl-2 and CDK2AP1.ResultsImmunohistochemistry data suggested that ratio of Bcl-2 positive cells in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma tissue were increased significantly when compared with normal oral mucosa[(19.29±8.18)%vs(2.72±1.45)% (P＜0.05), (57.20±19.37)%vs (2.72±1.45)% (P＜0.05),respectively].However,ratio of CDK2AP1 positive cellsin oralleukoplakia and oralsquamouscellcarcinoma tissue were decreased dramatically when compared with normal oral mucosa[(25.68±8.17)%vs(62.68±11.07)%(P＜0.05), (7.87±2.18)%vs(62.68±11.07)%(P＜0.05),respectively].Immunohistochemistry data were well echoed by PCR results and statistical significance among each groups were obtained.ConclusionExpression levels of Bcl-2 increase while CDK2AP1 decreases along with the increase of malignancy from normal oral mucosa,oral leukoplakia to oral squamous cell carcinoma tissue,which may indicates that Bcl-2 and CDK2AP1 may be involved in development as well as prognosis of oral tumors.

Bcl-2;CDK2AP1;oral leukoplakia;oral cancer

R739.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.010

1005-8982（2017）30-0056-04

2017-04-14

高建明，補(bǔ)充 E-mail：jianminggao@163.com；Tel：0717-6397466

（王榮兵 編輯）