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    胃饑餓素對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及機(jī)制探討

    2017-12-27 18:52:56岳朝馳楊向東李俊陳小朝屈景輝
    關(guān)鍵詞:饑餓結(jié)腸癌蛋白

    岳朝馳 ,楊向東 ,李俊 ,陳小朝 ,屈景輝

    (1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)科,四川 瀘州 646000;2.成都肛腸??漆t(yī)院結(jié)直腸外科,四川 成都 610015)

    臨床研究·論著

    胃饑餓素對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及機(jī)制探討

    岳朝馳 1,楊向東 2,李俊 1,陳小朝 2,屈景輝 2

    (1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)科,四川 瀘州 646000;2.成都肛腸??漆t(yī)院結(jié)直腸外科,四川 成都 610015)

    目的探討胃饑餓素(Ghrelin)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響及作用機(jī)制。方法收集90例行手術(shù)切除的結(jié)腸癌(CRC)組織及癌旁組織,免疫組織化學(xué)染色檢測組織Ghrelin表達(dá),分析Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床資料、生存預(yù)后的關(guān)系。按照轉(zhuǎn)染類型將細(xì)胞分為3組:空白對照組(WT)、陰性對照組(NC)和sh-Ghrelin轉(zhuǎn)染組。采用短發(fā)夾RNA(shRNA)技術(shù)抑制結(jié)腸癌HT29、SW480細(xì)胞Ghrelin表達(dá),CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及早期凋亡的情況,劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力,Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力,Western blot檢測磷脂酰肌醇 3- 激酶(PI3K)、蛋白激酶 B(Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表達(dá)水平。結(jié)果結(jié)腸癌組織Ghrelin高表達(dá)率為64.4%(58/90),癌旁組織Ghrelin高表達(dá)率為27.8%(25/90),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=24.347,P=0.001)。腫瘤直徑≥5 cm組Ghrelin高表達(dá)率高于腫瘤直徑<5 cm組,Ⅲ、Ⅳ期組Ghrelin高表達(dá)率高于Ⅰ、Ⅱ組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ghrelin高表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Ghrelin表達(dá)與性別、年齡及腫瘤分級無關(guān)(P>0.05)。生存曲線分析顯示,Ghrelin高表達(dá)組總生存期和無病生存率均低于Ghrelin低表達(dá)組(P<0.05)。在結(jié)腸癌HT29和SW480細(xì)胞中,sh-Ghrelin組細(xì)胞增殖能力低于NC組和WT組,處于S期比例、早期凋亡比例高于NC組和WT組(P<0.05)。處于G0/G1期比例低于NC組和WT組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。sh-Ghrelin組細(xì)胞遷移距離、侵襲細(xì)胞數(shù)少于NC組和WT組(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,在HT29、SW480細(xì)胞中,sh-Ghrelin組PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白相對表達(dá)量低于NC組和WT組(P<0.05),NC組、WT組間PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論結(jié)腸癌組織Ghrelin表達(dá)上調(diào),并與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后有關(guān)。干擾Ghrelin表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲,其作用機(jī)制可能與抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路有關(guān)。

    胃饑餓素;結(jié)腸癌;增殖;細(xì)胞周期;侵襲;信號通路

    結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤,居癌癥相關(guān)死亡的第4位[1]。盡管結(jié)腸鏡等腔鏡技術(shù)的發(fā)展和普及有利于結(jié)腸癌早期發(fā)現(xiàn),然而據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示[2],全球每年結(jié)腸癌發(fā)病人口依然>100萬,其中,60%的CRC患者確診時已是中晚期。即使給予手術(shù)、放、化療等,結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存依然不容樂觀。因此了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。胃饑餓素(Ghrelin)[3-4]是由胃合成和分泌的一種生長激素,在調(diào)控人體食欲、食物攝取及機(jī)體能量平衡方面發(fā)揮重要作用。近年來有研究報道[5-6],胃饑餓素對不同細(xì)胞的增殖和遷移有不同的影響,如胃饑餓素能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖,但對肺癌細(xì)胞則有抑制作用。也有報道稱[7],饑餓素能促進(jìn)腸道惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展,結(jié)腸癌患者血清胃饑餓素水平高于正常人群,并且胃饑餓素水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。但是關(guān)于胃饑餓素與結(jié)腸癌發(fā)病的關(guān)系及作用機(jī)制尚未見報道。鑒于此,本研究分別檢測結(jié)腸癌組織和細(xì)胞胃饑餓素表達(dá)水平,并探討不同胃饑餓素表達(dá)水平對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響及作用機(jī)制,旨在為結(jié)腸癌的預(yù)防、治療和診斷提供潛在的作用靶點。

    1 資料與方法

    1.1 樣本收集

    選取2010年4月-2011年4月本院收治的90例結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①入組前未接受任何抗癌治療;②入院后擬行手術(shù)治療;③術(shù)前簽署知情同意書,并自愿捐獻(xiàn)組織樣本供本研究使用;④術(shù)后經(jīng)病理學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重自身免疫性疾病及不宜或拒絕手術(shù)者。所有患者術(shù)中切除結(jié)腸癌組織及配對的癌旁組織(距癌組織切緣>5 cm),組織樣本取出后分成兩部分,一部分立即置于液氮中保存,另外一部分用10%甲醛固定用于免疫組織化學(xué)(免疫組化)染色。術(shù)后對患者進(jìn)行電話隨訪或門診復(fù)查,定義無病生存期(disease-free survival,DFS):從術(shù)后第2天開始至疾病復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或因結(jié)腸癌死亡的時間;總生存期(overall survival,OS):從術(shù)后第2天開始至因任何原因引起死亡的時間。本研究隨訪截止時間2016年12月31日。本研究樣本的采集、患者的治療均得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

    1.2 細(xì)胞來源

    人結(jié)腸上皮細(xì)胞HIEC、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29及SW480均購自美國菌種保藏中心(美國弗吉尼亞州),所有細(xì)胞均接種于DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)。培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100u/ml青霉素及100u/ml鏈霉素,在培養(yǎng)箱中37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)。每隔2天更換1次培養(yǎng)基,細(xì)胞融合達(dá)80%~90%時傳代,選擇傳>3代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

    1.3 實驗試劑

    pGPU6/GFP/Neo-sh-Ghrelin表達(dá)載體(購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),短發(fā)夾RNA(shRNA)序列,正向引物:5'-GUAAUGAGGAGGGCUAUUA-3',反 向 引 物 :5'-CGU AUGCGCGUACUCUAAUTT-3'。Lipofectamine 2000TM購自(美國Invitrogen公司),Trizol試劑、RIPA裂解液(購自廣州碧云天生物技術(shù)研究所),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒(購自美國Fermentas公司),CCK-8增殖活性測定試劑盒(購自長沙貝博生物科技有限公司),細(xì)胞周期檢測試劑盒(購自北京雷根生物技術(shù)有限公司),Transwell小室、Matrigel人工基底膜(購自美國Sigma公司)???Ghrelin(1∶100,武漢博士德生物公司)、抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)(1∶50,上海生工生物工程有限公司)、抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)(1∶500,海門碧云天生物技術(shù)研究所)、抗磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylation mTOR,p-mTOR)(phosphorylationAkt,p-Akt)(1∶200,海門碧云天生物技術(shù)研究所)、抗蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)(1∶100,上海生工生物工程有限公司)、抗磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation Akt,p-Akt)(1∶100,上海生工生物工程有限公司)、抗β-actin(1∶200,武漢博士德生物公司),流式細(xì)胞儀(購自美國BD公司),PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(購自美國Millipore公司)。

    1.4 方法

    1.4.1 免疫組化染色檢測結(jié)腸癌組織Ghrelin表達(dá)將甲醛固定的結(jié)腸組織和癌旁組織常規(guī)石蠟包埋,制成5 μm的切片,脫蠟至水,加熱修復(fù)抗原,加入H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶。滴加2、3滴Ghrelin抗體,4℃孵育過夜。PBS沖洗3次,滴加1、2滴二抗,37℃孵育15 min,DAB顯色液顯色10 min,顯微鏡下觀察圖像。染色強(qiáng)度參考以下標(biāo)準(zhǔn),0分:無染色,1分:弱陽性染色,2分:陽性染色,3分:強(qiáng)陽性染色。陽性細(xì)胞比例參考以下標(biāo)準(zhǔn),1分:0~25%,2分:26%~75%,3分:76%~100%。每張切片隨機(jī)選擇5個視野,由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評價,若判定結(jié)果不一致,則由第3位醫(yī)師做出最后判定。免疫染色評分(immunoreactive score,IRS)以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例綜合判定,兩者相乘,IRS評分0~9分,其中0分為陰性,1~2分為低表達(dá),3~9分為高表達(dá)。

    1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h,將HT29和SW480鋪于6孔板,細(xì)胞密度為1×106個/孔,加入培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)80%融合度,利用Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。按照轉(zhuǎn)染類型將細(xì)胞分為3組:空白對照組(WT)、陰性對照組(NC)和 sh-Ghrelin轉(zhuǎn)染組,空白對照組加入等量Lipofectamine 2000TM試劑,陰性對照組加入陰性對照的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000TM試劑,sh-Ghrelin轉(zhuǎn)染組加入sh-Ghrelin質(zhì)粒和Lipofectamine 2000TM試劑。質(zhì)粒和Lipofectamine 2000TM試劑按照1∶3比例進(jìn)行配置,轉(zhuǎn)染6 h后,再向每孔中加入300μl FBS,轉(zhuǎn)染24h后更換為DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染72h后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測 Ghrelin mRNA表達(dá)以評價轉(zhuǎn)染效率。

    1.4.3 qRT-PCR檢測Ghrelin mRNA表達(dá)取生長旺盛期細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗3次,加入Trizol試劑,按照試劑說明書依次氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇洗滌;將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,參考SYBR GREEN定量PCR說明書進(jìn)行PCR反應(yīng),總反應(yīng)體系30μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min,95℃變性 5 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 2 min,總計40個循環(huán)。Ghrelin正向引物:5'-GTTGGGTGTGATG GAGGGAAG-3',反向引物:5'-CCTTCTCAGTGGTGC AACTGTG-3';β-actin 正向引物:5'-CACCATTGGC AATGAGGGGTTC-3',反向引物:5'-AGGTCTTTGCG GATGTCCACGT-3'。定量分析結(jié)果以Ct值表示,以β-actin作為內(nèi)參,2-△△Ct作為目的基因相對表達(dá)量。

    1.4.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性將細(xì)胞鋪于96孔板中(2×103個/孔),同時設(shè)置試劑空白對照孔和細(xì)胞空白對照空,孵育24 h后于每孔中加入預(yù)先配置好的CCK-8試劑(10 μl/孔),37℃繼續(xù)孵育,于450 nm處檢測吸光度值,并以標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出樣品的光密度值(OD)。

    1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞生長周期細(xì)胞鋪于6孔板中(1×106個/孔),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集貼壁細(xì)胞,加入75%乙醇固定,4℃過夜;第2天棄去固定液,加入RNA酶以消除RNA的干擾;再加入PI染液(10 μl),上機(jī)檢測,每次實驗操作3次,取平均值。

    1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞鋪于6孔板中(1×106個/孔),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集貼壁細(xì)胞,依次加入 Annexin V(400μl)和 Annexin V-FITC(5 μl)染液,避光孵育 15 min,再加入 PI染液(10 μl),上機(jī)檢測,每次實驗操作3次,取平均值。

    1.4.7 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力用不含血清的培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×105個/ml,Transwell上室每孔接種150 μl細(xì)胞,下室加入600 μl含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基作為趨化劑,37℃培養(yǎng)48 h,輕輕拭去表面非侵襲性細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下統(tǒng)計穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)。

    1.4.8 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力將細(xì)胞接種于6孔板,Marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線,每孔中鋪1×105個細(xì)胞,細(xì)胞融合度≥80%時用無菌用移液槍槍頭在單層細(xì)胞沿底部劃出“一”字劃痕,PBS沖洗3次后,培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下測量劃痕愈合的寬度。

    1.4.9 Western blot檢測 PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,PBS沖洗,加入離心管中,再加入1 ml RIPA裂解液置于冰浴上裂解30 min,4℃條件下離心15 min,BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白純度。將20 μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離,常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜,加入5%脫脂牛奶孵育封閉2 h。分別加入PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 及 p-mTOR 抗體,4℃孵育 24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次,按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影,以β-actin作為內(nèi)參照,分析目的條帶相對表達(dá)量。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較用SNK-q檢驗,計數(shù)資料以構(gòu)成比(%)表示,分析用χ2檢驗,Kaplan-Meier法繪制ROC曲線,比較用Log-rank χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Ghrelin在肺癌組織中表達(dá)

    免疫組化染色結(jié)果顯示,Ghrelin蛋白主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞質(zhì),出現(xiàn)棕色顆粒為陽性細(xì)胞(見圖1)。結(jié)腸癌組織Ghrelin高表達(dá)率為64.4%(58/90),癌旁組織Ghrelin高表達(dá)率為27.8%(25/90),結(jié)腸癌組織Ghrelin高表達(dá)率高于癌旁組織(χ2=24.347,P=0.001)。

    2.2 Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床資料及生存預(yù)后的關(guān)系

    Ghrelin表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),腫瘤直徑≥5 cm組Ghrelin高表達(dá)率高于腫瘤直徑<5 cm組,Ⅲ、Ⅳ期組Ghrelin高表達(dá)率高于Ⅰ、Ⅱ組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ghrelin高表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Ghrelin表達(dá)與性別、年齡及腫瘤分級無關(guān)(P>0.05)(見附表)。90例結(jié)腸癌患者共計有82例獲得完整隨訪,其中,低表達(dá)隨訪30例,高表達(dá)隨訪52例。生存曲線分析顯示,Ghrelin高表達(dá)總生存期和無病生存率均低于Ghrelin低表達(dá)(χ2=4.983和4.001,P=0.034和0.043)。見圖2。

    2.3 靶向Ghrelin shRNA抑制目的基因mRNA的表達(dá)

    圖1 結(jié)腸癌和癌旁組織Ghrelin表達(dá) (免疫組化)

    附表 Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床資料的關(guān)系

    HIEC、HT29及SW480細(xì)胞Ghrelin mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.210,P=0.000)。HT29、SW480細(xì)胞Ghrelin mRNA相對表達(dá)量高于HIEC 細(xì)胞(P<0.05),HT29、SW480細(xì)胞間 Ghrelin mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖3A)。NC、WT及sh-Ghrelin組HT29細(xì)胞和SW480細(xì)胞的Ghrelin mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.431和6.193,P=0.014和0.000),sh-Ghrelin組HT29和SW480細(xì)胞的Ghrelin mRNA相對表達(dá)量低于WT組和NC組(P<0.05)(見圖 3B、C)。NC、WT及 sh-Ghrelin組 HT29細(xì)胞和SW480細(xì)胞的Ghrelin蛋白相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.037和5.172,P=0.031和0.025),sh-Ghrelin組HT29和SW480細(xì)胞的Ghrelin蛋白相對表達(dá)量低于WT組和NC組(P<0.05)(見圖3D、E),證實sh-RNA轉(zhuǎn)染成功。

    圖2 Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

    圖3 各組細(xì)胞Ghrelin mRNA表達(dá)水平

    2.4 靶向Ghrelin shRNA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖

    對HT29和SW480細(xì)胞的CCK-8檢測結(jié)果顯示,從培養(yǎng)的24~120 h,NC組和WT組細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);從48~120 h,sh-Ghrelin組細(xì)胞增殖能力低于NC組和WT組(P<0.05)(見圖4A、B)。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示,在HT29和SW480細(xì)胞中,sh-Ghrelin組細(xì)胞處于S期的比例高于 NC 組和 WT 組(FHT29=18.043,PHT29=0.000;FSW480=19.247,PSW480=0.000),而 NC 組、WT 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4C、D。

    2.5 靶向Ghrelin shRNA促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

    利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡情況,結(jié)果顯示NC、WT及sh-Ghrelin組HT29和SW480細(xì)胞早期凋亡比例比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.910和12.943,均P=0.000),在HT29和SW480細(xì)胞中,sh-Ghrelin組細(xì)胞早期凋亡比例高于NC組和WT組(P<0.05),NC組、WT組間細(xì)胞早期凋亡比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

    圖4 各組細(xì)胞周期和增殖

    2.6 靶向Ghrelin shRNA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移

    劃痕實驗顯示,NC、WT及sh-Ghrelin組HT29、SW480細(xì)胞的遷移距離比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=75.016 和 72.940,均P=0.000),HT29、SW480 細(xì)胞中,sh-Ghrelin組細(xì)胞遷移距離少于NC組和WT組(P<0.05),NC組、WT組間細(xì)胞遷移距離比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖 6A、B)。Transwell小室實驗結(jié)果顯示,NC、WT及 sh-Ghrelin組HT29、SW480細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.401 和 20.745,均P=0.000),HT29、SW480 細(xì)胞中,sh-Ghrelin組侵襲細(xì)胞數(shù)少于NC組和WT組(P<0.05),NC組、WT組間侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

    2.7 靶向Ghrelin shRNA抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路

    Western blot檢測結(jié)果顯示,NC、WT及sh-Ghrelin組HT29細(xì)胞中PI3K、p-Akt以及p-mTOR蛋白相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FPI3K=7.641,PPI3K=0.001;Fp-Akt=6.218,Pp-Akt=0.000;Fp-mTOR=4.732,Pp-mTOR=0.002),NC、WT 及 sh-Ghrelin組SW480細(xì)胞中PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FPI3K=6.590,PPI3K=0.000;Fp-Akt=7.321,Pp-Akt=0.000;Fp-mTOR=5.470,Pp-mTOR=0.011), 在 HT29、SW480 細(xì)胞中,sh-Ghrelin 組 PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量低于NC組和WT組(P<0.05),NC組、WT 組間 PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 及 p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

    圖5 各組細(xì)胞凋亡的影響

    圖6 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力

    圖7 干擾Ghrelin表達(dá)對PI3K-Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白的影響

    3 討論

    胃饑餓素是由胃黏膜細(xì)胞分泌的一種活性多肽,已被證實與迷走神經(jīng)的興奮性有關(guān)。胃饑餓素與內(nèi)源性受體結(jié)合,刺激下丘腦攝食中樞,使食欲增加和減少脂肪分解。有研究發(fā)現(xiàn)[8],胃饑餓素能夠維持葡萄糖穩(wěn)態(tài),在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中展現(xiàn)潛在的價值。近年來大量研究指出,胃饑餓素在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展方面發(fā)揮一定作用。杜成雄[9]報道,終末期、分化程度低的直腸癌患者血清胃饑餓素升高。TAKIGUCHI等[10]也證實,組織胃饑餓素表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度、分化類型及TNM分期密切相關(guān)。本研究顯示,結(jié)腸癌組織Ghrelin高表達(dá)率高于癌旁組織,Ghrelin表達(dá)水平與結(jié)腸癌瘤體大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示胃饑餓素在結(jié)腸癌中可能起到類似癌基因的作用。TAKIGUCHI等[11]對行根治性遠(yuǎn)端胃切除術(shù)的胃癌患者進(jìn)行隨訪觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃饑餓素可以使患者胃排空延遲,并導(dǎo)致術(shù)后化療相關(guān)惡心嘔吐;血漿胃饑餓素水平越高,患者3年生存率越低。本研究對結(jié)腸癌患者術(shù)后進(jìn)行規(guī)律隨訪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ghrelin高表達(dá)組總生存期和無病生存率均低于Ghrelin低表達(dá)組,提示胃饑餓素亦可以作為評價結(jié)腸癌預(yù)后生存的指標(biāo)之一。

    為進(jìn)一步探討Ghrelin對結(jié)腸癌生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制,本研究采用shRNA技術(shù)干擾人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和SW480中Ghrelin的表達(dá),結(jié)果顯示HT29、SW480細(xì)胞Ghrelin mRNA相對表達(dá)量高于HIEC細(xì)胞,說明結(jié)腸癌細(xì)胞Ghrelin高表達(dá),Ghrelin可能是結(jié)腸細(xì)胞惡性病變的標(biāo)志物。干擾HT29、SW480細(xì)胞 Ghrelin表達(dá),sh-Ghrelin組細(xì)胞增殖能力低于陰性對照組(NC組)和野生組(WT組),說明敲除Ghrelin基因能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力。李振遠(yuǎn)等[12]報道,Ghrelin參與維持核糖體的正常功能,并促進(jìn)DNA的復(fù)制和相關(guān)蛋白的合成,這也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程。抑制Ghrelin的表達(dá),腫瘤細(xì)胞正常功能蛋白合成受阻,增殖功能也受到影響。細(xì)胞的增殖與分裂周期密切相關(guān),本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抑制Ghrelin表達(dá)能夠引起細(xì)胞分裂阻滯S期,從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。有研究顯示[13],Ghrelin能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)和Cyclins-CDKs復(fù)合物功能,使DNA合成加速并誘導(dǎo)瘤體生長。也有學(xué)者認(rèn)為[14],特異性沉默Ghrelin基因,能夠序貫性降低下游Cyclin D1基因的表達(dá),導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞S周期轉(zhuǎn)變“檢查點”功能失調(diào),細(xì)胞被特異性阻滯S周期。限本研究的設(shè)計方案,尚未深入探討Ghrelin對細(xì)胞周期阻滯的具體機(jī)制。

    細(xì)胞凋亡是真核生物最重要的生長調(diào)控機(jī)制,也是影響細(xì)胞增殖速度的主要因素。細(xì)胞凋亡由一系列凋亡途徑所介導(dǎo),細(xì)胞的凋亡增加,必然引起細(xì)胞增殖能力減弱。國外研究顯示[15],抑制Ghrelin能夠下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2和p53,并激活凋亡因子Caspase家族成員(Caspase-3、Caspase-9),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加速。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,抑制Ghrelin可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞早期凋亡比例。但需要注意的是,對絕大多數(shù)結(jié)腸癌細(xì)胞,p53在早期已經(jīng)發(fā)生突變,理論上無法參與后續(xù)的凋亡信號途徑,因此Ghrelin所介導(dǎo)的促凋亡效應(yīng)可能與其他機(jī)制有關(guān)。有研究報道稱[16],胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT時,TGF-β能夠促進(jìn)Ghrelin表達(dá),而Ghrelin過表達(dá)又能反過來刺激TGF-β表達(dá)增加,使細(xì)胞獲得侵襲、遷移的能力。本研究也發(fā)現(xiàn),HT29、SW480細(xì)胞中,sh-Ghrelin組侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移距離低于NC組和WT組,說明抑制Ghrelin可以阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)行為。但是本研究尚無法證實侵襲、遷移的抑制是否與阻斷EMT有關(guān)。

    PI3K-Akt-mTOR信號通路是調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17-18],包括細(xì)胞周期調(diào)控、血管新生、基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯等。激活磷脂肌醇3-激酶可以誘導(dǎo)蛋白激酶B(Akt)磷酸化,活化的Akt又將信號傳遞至下游底物雷帕霉素靶體蛋白,并控制諸如凋亡、轉(zhuǎn)錄及翻譯等生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示[19],絲蘇氨酸激酶抑制劑能夠抑制PI3K-AktmTOR通路,阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲等行為。PARK等[20]也證實,PI3K-Akt-mTOR信號通路激活程度可以作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究顯示,結(jié)腸癌HT29、SW480細(xì)胞中,sh-Ghrelin組PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白相對表達(dá)量低于NC組和WT組,說明抑制Ghrelin表達(dá)能夠阻斷PI3KAkt-mTOR信號通路,并抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。上述研究結(jié)果也說明Ghrelin可能是通過PI3K-AktmTOR信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)行為。

    綜上所述,結(jié)腸癌組織Ghrelin表達(dá)上調(diào),并與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后有關(guān)。干擾Ghrelin表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲,其作用機(jī)制可能與抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路有關(guān)。

    [1]DAMANIA D,SUBRAMANIAN H,BACKMAN V,et al.Network signatures of nuclear and cytoplasmic density alterations in a model of pre and postmetastatic colorectal cancer[J].J Biomed Opt,2014,19(1):16016.

    [2]POTTER M B.Strategies and resources to address colorectal cancer screening rates and disparities in the United States and globally[J].Annu Rev Public Health,2013,34(1):413-429.

    [3]KASACKA I,ARCISZEWSKI M,?EBKOWSKI W.Extraordinary level of hormone and number of ghrelin cells in the stomach and duodenum of an obese woman[J].Acta Histochem,2014,116(1):230-234.

    [4]高寅生,侯亞勃,楊曉軍,等.胃饑餓素/肽YY/刺鼠相關(guān)蛋白信號在胃旁路手術(shù)治療2型糖尿病中的作用[J].中華實驗外科雜志,2016,33(5):1247-1249.

    [5]EOM J,HONG M,CONE R D,et al.Zebrafish ghrelin is expressed in pancreatic endocrine cells and regulated by metabolic state[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,439(1):115-120.

    [6]NORTHRUP R,KURODA K,DUUS E M,et al.Effect of ghrelin and anamorelin(ONO-7643),a selective ghrelin receptor agonist,on tumor growth in a lung cancer mouse xenograft model[J].Support Care Cancer,2013,21(9):2409-2415.

    [7]畢建成,田偉,王國文,等.結(jié)腸癌患者血清脂聯(lián)素和胃饑餓素水平的臨床分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2015,22(4):291-293.

    [8]LIU B W,LU Q,MA C M,et al.The study of soluble intercellular adhesion molecule-1 and ghrelin in adolescents with family history of type 2 diabetes[J].Endocrine,2012,42(3):599-605.

    [9]杜成雄.兩種手術(shù)方式直腸癌術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)期胃饑餓素的動態(tài)變化及其臨床意義[J].中國普通外科雜志,2014,23(10):1440-1443.

    [10]TAKIGUCHI S,TAKATA A,MURAKAMI K,et al.Clinical application of ghrelin administration for gastric cancer patients undergoing gastrectomy[J].Gastric Cancer,2014,17(2):200-205.

    [11]TAKIGUCHI S,HIURA Y,TAKAHASHI T,et al.Effect of rikkunshito,a Japanese herbalmedicine,on gastrointestinal symptoms and ghrelin levels in gastric cancer patients after gastrectomy[J].Gastric Cancer,2013,16(2):167-174.

    [12]李振遠(yuǎn),李方方,張勇,等.胃饑餓素:生物學(xué)特征及對動物采食量的調(diào)控[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2016,28(1):35-42.

    [13]WASEEM T,DUXBURY M,ASHLEY S W,et al.Ghrelin promotes intestinal epithelial cell proliferation through PI3K/Akt pathway and EGFR trans-activation both converging to ERK 1/2 phosphorylation[J].Peptides,2014,52(50):113-121.

    [14]LEE J H,PATEL K,TAE H J,et al.Ghrelin augments murine T-cell proliferation by activation of the phosphatidylinositol-3-kinase,extracellular signal-regulated kinase and protein kinase C signaling pathways[J].FEBS Lett,2014,588(24):4708-4719.

    [15]ZHU J,ZHENG C,CHEN J,et al.Ghrelin protects human umbilical vein endothelial cells against high glucose-induced apoptosis via mTOR/P70S6K signaling pathway[J].Peptides,2014,52(2):23-28.

    [16]RODRíGUEZ A,GóMEZ-AMBROSI J,CATALáN V,et al.The ghrelin O-Acyltransferase-Ghrelin system reduces TNF-α-Induced apoptosis and autophagy in human visceral adipocytes[J].Diabetologia,2012,55(11):3038-3050.

    [17]郭琳,王強(qiáng).PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,17(8):1585-1589.

    [18]周笑,楊鵬,于雁,等.PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤[J].國際免疫學(xué)雜志,2016,39(3):280-284.

    [19]ZHANG X,SHI H,TANG H,et al.MiR-218 inhibits the invasion and migration of colon cancer cells by targeting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Int J Mol Med,2015,35(5):1301-1308.

    [20]PARK J H,KIM J J,BAE Y S.Involvement of PI3K-Akt-mTOR pathway in protein kinase CKII inhibition-mediated senescence in human colon cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,433(4):420-425.

    Regulation of Ghrelin in proliferation and invasion of colon carcinoma

    Chao-chi Yue1,Xiang-dong Yang2,Jun Li1,Xiao-zhao Chen2,Jun-hui Qu2
    (1.Department of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Colorectal Surgery,the Anorectal Specialist Hospital of Chengdu,Chengdu,Sichuan 610015,China)

    ObjectiveTo investigate the effect of Ghrelin on cellular proliferation and invasion of colon carcinoma and potential mechanisms.MethodsA total of 90 patients diagnosed with colon carcinoma were included in this study,and cancer as well as paracancerous normal tissue was collected.Expression of Ghrelin wasmeasured by Immunohistochemicalstaining assay;Co-relationship analysisbetween ghrelin expression and clinical manifestation of patients including survival rate was performed.Expression of Ghrelin in colon carcinoma cell line HT29 and SW480 was genetically inhibited by short hairpin RNA (shRNA).Cellular proliferation,cell cycle as well as apoptosis,migration,and cell invasion were determined by CCK-8 assay,Flow cytometry,Wound heal assay,and Transwell assay,respectively.Expression levels of PI3K,Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR protein were measured by Western blot.ResultsExpression of Ghrelin in cancer tissue,group with tumor diameter≥5 cm,and group with tumor underⅢ~Ⅳ phase was upregulated when compared with that in paracancerous tissue,group with tumor diameter<5 cm group,group with tumor under metastasis-free phase,respectively (P<0.05).No correlation between Ghrelin expression and gender,age and tumor grade respectively was observed (P>0.05).Overall survival and disease-free survival in group with highly expressed Ghrelin was significantly lower than that in group with lowly expressed Ghrelin (P<0.05).Proliferation,migration and invasion capacity of HT29 and SW480 cells decreased while ratio of cells in S phase and early apoptosis increased significantly in sh-Ghrelin group when compared with those in NC group and WT group(P<0.05).In HT29 and SW480 cells expression levels of PI3K,p-Akt,p-mTOR protein were dramatically down-regulated in sh-Ghrelin group when compared with those in NC group and WT group (P<0.05).No statistical difference in the expression of PI3K,Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR protein in NC group and WT group was observed (P>0.05).ConclusionsThe expression of Ghrelin is up-regulated in colon carcinoma tissue,which is closely associated with disease prognosis.Beneficial effect of Ghrelin is potentially mediated through inhibition of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway.

    Ghrelin;colon carcinoma;proliferation;cell cycle;invasion;signaling pathway

    R735.35

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.005

    1005-8982(2017)30-0026-10

    2017-05-04

    (王榮兵 編輯)

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