一起山羊流產(chǎn)衣原體感染的診斷

吳浩陽(yáng)，黃加利，徐 瑩，孫 裴，付明哲*，許信剛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

一起山羊流產(chǎn)衣原體感染的診斷

吳浩陽(yáng)1,2，黃加利1，徐 瑩1，孫 裴2，付明哲1*，許信剛1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

陜西省某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了一起山羊流產(chǎn)病，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查，臨床癥狀和病理剖檢觀察進(jìn)行初步診斷；利用布魯菌虎紅平板凝集試驗(yàn)、衣原體間接血凝試劑盒對(duì)10份流產(chǎn)母羊血清檢測(cè)；對(duì)病料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)；依據(jù)GenBank收錄的山羊流產(chǎn)性衣原體基因組設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR方法從病料中擴(kuò)增衣原體特異性片段。結(jié)果表明，根據(jù)臨床癥狀和病理變化初步懷疑為布魯菌和鸚鵡熱親衣原體感染；10份血清檢測(cè)結(jié)果為布魯菌病血清全部陰性，衣原體感染血清全部為陽(yáng)性；細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果為陰性；PCR結(jié)果獲得523 bp基因片段，測(cè)序結(jié)果與鸚鵡熱親衣原體100%相似。依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，臨床癥狀和病理剖檢觀察，病原學(xué)和血清學(xué)診斷，最終確診該病為鸚鵡熱親衣原體引起的山羊地方流行性流產(chǎn)。

山羊流產(chǎn)；鸚鵡熱親衣原體；診斷

山羊地方流行性流產(chǎn)是由布魯菌和鸚鵡熱親衣原體引起的母羊繁殖障礙性疾病。衣原體是類似于細(xì)菌或病毒的一種微生物，既有RNA，又有DNA，是一類專門寄生在真核細(xì)胞內(nèi)的革蘭陰性微生物[1]，衣原體目包括3個(gè)科，即衣原體科、副衣原體科和西氏衣原體科。鸚鵡熱親衣原體屬于衣原體科，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)分離到8～10種血清型，且主要存在于病鳥的體內(nèi)，通過(guò)各種方式傳播，病畜和病原攜帶者是本病的主要傳染源，鴿子和麻雀也是本病的病原攜帶者，同時(shí)也能夠引起妊娠豬、牛等多種動(dòng)物發(fā)生流產(chǎn)[2]。鸚鵡熱親衣原體可感染母羊，并引起流產(chǎn)，首次發(fā)生流產(chǎn)的羊群流產(chǎn)率達(dá)20%～30%，流產(chǎn)過(guò)的母羊在下一次生產(chǎn)中，雖然不再發(fā)生流產(chǎn)，但產(chǎn)弱羔較多。弱羔表現(xiàn)神經(jīng)癥狀、肺炎、關(guān)節(jié)炎或結(jié)膜炎等。在流產(chǎn)羊群中公羊出現(xiàn)睪丸炎和附睪炎[3]。2017年2～3月期間陜西某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)中大量妊娠母羊出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或者產(chǎn)出弱胎等癥狀。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖

檢、流產(chǎn)母畜的血清學(xué)檢測(cè)及鸚鵡熱親衣原體基因的PCR檢測(cè)，確診該起病為鸚鵡熱親衣原體引起的山羊流產(chǎn)性衣原體病，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣品采集 無(wú)菌采集流產(chǎn)母羊的血液10份并分離血清，置-20℃凍存?zhèn)溆?。無(wú)菌法采集流產(chǎn)胎兒的肺、脾、羊水和胎盤各3份，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 布魯菌病虎紅凝集試驗(yàn)抗原、陰性血清、陽(yáng)性血清購(gòu)于哈藥集團(tuán)；衣原體間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于蘭州獸醫(yī)研究所；2×EsTaqMaster Mix、DNA Marker DL 2 000 plus 及血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；SPF雞胚由楊凌綠方生物公司提供；其他試劑全部為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)、臨床及病理剖檢診斷 通過(guò)向養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理人員詢問了解該病的發(fā)生情況，并觀察流產(chǎn)母畜、流產(chǎn)胎兒及弱羔的臨床癥狀。將流產(chǎn)胎兒和死胎帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行系統(tǒng)剖檢檢查，記錄眼觀病變。

1.2.2 血清學(xué)檢測(cè) 對(duì)10份血清進(jìn)行布魯菌病虎紅凝集試驗(yàn)，參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，主要程序?yàn)椋罕粰z血清和布魯菌虎紅抗原各0.03 mL滴于玻璃板上，并用干凈的槍頭混勻，在室溫4 min～10 min內(nèi)記錄反應(yīng)，并設(shè)置陰陽(yáng)性血清對(duì)照，判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)試劑盒說(shuō)明書。

用衣原體間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒對(duì)衣原體進(jìn)行檢測(cè)，參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。在血凝板上1～7排的第1～第10孔、第8排的第1～第4孔和第5～第7孔，加稀釋液50 μL/孔；分別取待檢流產(chǎn)母畜血清，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清50 μL，依次加入反應(yīng)板1～6排的第1孔，7排的第1孔和8排的第1孔中，與稀釋液混勻后，吸取50 μL，加于第2孔中，作2倍稀釋至第10孔，第10孔混勻后棄去50 μL。8排的陰性血清稀釋到第4孔，混勻后從該孔棄去50 μL，第5～第7孔為稀釋液對(duì)照，每孔只加入50 μL稀釋液；陰、陽(yáng)性血清和待檢血清稀釋孔和稀釋液對(duì)照孔均加入25 μL的血凝抗原，將反應(yīng)板在微型振蕩器上震蕩1 min～2 min，使血球分布均勻，封膜板封板，室溫靜置3 h～4 h判定結(jié)果。判定：當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清完全凝集，陰性對(duì)照血清和稀釋液對(duì)照都不凝集的情況下，試驗(yàn)成立。判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行判斷。

1.2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將采集的病料肺、脾、羊水和胎盤按照細(xì)菌分離鑒定的基本操作方法劃線接種到鮮血瓊脂平板上，分別置于有氧和無(wú)氧的環(huán)境中37℃，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行觀察。

1.2.4 羊流產(chǎn)衣原體分離 將采集的流產(chǎn)胎兒的肺臟、脾臟和胎盤等內(nèi)臟研碎后，用含適量青霉素(50 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL )的PBS稀釋，4℃放置3 h，再以3 000 r/min離心20 min，取上清，接種于5日齡～7日齡SPF雞胚卵黃囊中。接種后3 d內(nèi)死亡的SPF雞胚丟棄，收集4 d～8 d死亡SPF雞胚的卵黃囊膜，繼續(xù)傳代。同時(shí)無(wú)菌取少量的卵黃囊涂片待干燥后，經(jīng)甲醇固定5 min，干燥后用吉姆薩氏染液染色30 min,用去離子水沖洗干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。假如第1次接種分離時(shí)，SPF雞胚沒有出現(xiàn)死亡再盲傳3代～5代直至SPF雞胚發(fā)生死亡。使用DNA提取試劑盒提取收集的SPF雞胚的卵黃囊膜全基因組，按照參考文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.5 PCR檢測(cè) 為了進(jìn)一步確定流產(chǎn)是否為鸚鵡熱親衣原體所引起，以提取胎水和4 d～8 d死亡的雞胚的卵黃囊膜為材料按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA。根據(jù)GenBank登錄的流產(chǎn)衣原體的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)一段引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：上游引物5′- CCCCAAGCCAGCATCTAATA-3′；下游引物5′- TTAGAGCCCAGGCAGTCTCG-3′。按照參考文獻(xiàn)[5-6]介紹方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR 20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×EsTaqMasterMix，ddH2O 6 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板3 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察目的片段大小

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

懷孕母羊流產(chǎn)前4 d～8 d精神沉郁，但食欲正常，流產(chǎn)后逐漸恢復(fù)正常，當(dāng)時(shí)沒有引起養(yǎng)殖戶足夠的重視，但自2017年1月～3月間，所飼養(yǎng)的27只懷孕母羊中有10只發(fā)生流產(chǎn)，5只產(chǎn)出死羔，3只產(chǎn)出弱羔。流產(chǎn)前期懷孕母羊除了體溫普遍升高至41℃～42℃外，其他沒有明顯的變化，流產(chǎn)后多數(shù)孕羊胎衣滯留，陰道持續(xù)2 d～3 d排出暗紅色的胎衣，并且表面覆蓋一層膠凍樣物質(zhì)。經(jīng)詢問，該養(yǎng)殖戶對(duì)口蹄疫、布魯菌、小反芻獸疫及羊痘均按相關(guān)免疫程序進(jìn)行過(guò)疫苗免疫接種。

2.2 臨床癥狀

懷孕母羊體溫升高1.5℃～2.5℃，持續(xù)1周，食欲減退，精神不安，陰道排出少量黏液性或膿性分泌物，并且有大多數(shù)妊娠母羊在懷孕中期和晚期發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)母畜胎膜血樣水腫，子葉呈暗紅色并壞死，流產(chǎn)的胎兒出現(xiàn)木乃伊、死胎和弱羔三種情況，流產(chǎn)胎兒水腫(圖1)，腹水增多，氣管黏膜由于淤血而形成血斑，產(chǎn)弱羔表現(xiàn)神經(jīng)癥狀、關(guān)節(jié)炎或結(jié)膜炎，有3頭妊娠母羊無(wú)任何癥狀而突然發(fā)生流產(chǎn)。流產(chǎn)后2 d～3 d排出分泌物，大部分流產(chǎn)母畜有胎衣滯留情況。且發(fā)生流產(chǎn)的羊群流產(chǎn)率達(dá)20%～30%，且在流產(chǎn)羊群中有2頭公羊出現(xiàn)睪丸炎和附睪炎。

圖1 流產(chǎn)胎兒

2.3 病理剖檢變化

流產(chǎn)母畜胎衣增厚并呈現(xiàn)水腫，流產(chǎn)胎兒可見其皮下水腫，皮膚上布有淤血斑，皮膚和黏膜通常有斑點(diǎn)狀出血。剖檢發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)胎兒肝臟腫大呈紅黃色，心內(nèi)外膜有出血點(diǎn)，脾臟腫大，腎表面有出血點(diǎn)，結(jié)膜、咽喉、氣管黏膜、舌和淋巴結(jié)上經(jīng)常可見斑點(diǎn)狀出血；腹腔和胸腔有黃色滲出物。淋巴組織由于相關(guān)淋巴液的滯留而腫大。

2.4 細(xì)菌分離結(jié)果

病料在鮮血瓊脂平板上劃線在有氧和無(wú)氧的環(huán)境中37℃，培養(yǎng)48 h，都沒有菌落生長(zhǎng)。

2.5 衣原體分離結(jié)果

病料接種在7日齡的SPF雞胚上，連續(xù)傳代3代～5代后，可使接種的雞胚4 d～8 d出現(xiàn)有規(guī)律性死亡和典型的病變特征：胚體充血并出血，雞胚的頭、背部有出血點(diǎn)；卵黃囊膜變稀薄，尿囊液清亮，囊膜有出現(xiàn)水腫的癥狀。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)存在有藍(lán)色和暗紫色的包涵體。

2.6 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

10份血清經(jīng)布魯菌病虎紅凝集試驗(yàn)檢測(cè)均為陰性，排除布魯菌病可能。使用衣原體間接血凝試驗(yàn)試劑盒對(duì)無(wú)菌采集流產(chǎn)母畜的血液10份進(jìn)行檢測(cè)，在陽(yáng)性血清，陰性血清和稀釋液對(duì)照組結(jié)果成立的情況下，待檢10份流產(chǎn)母羊血清檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

2.6 PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)胎水和卵黃囊膜基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)，均擴(kuò)增出523 bp的目的條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果和鸚鵡熱衣原體基因100%相同。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 plus；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.胎水；3.卵黃囊膜；4.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000 plus；1.Positive control;2.Fetal water;3.Yolk-sac membrane;4.Negative control

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 Electrophoresis of PCR products

3 討論

據(jù)報(bào)道近年來(lái)部分養(yǎng)羊場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)衣原體引起的羊流產(chǎn)病，呈現(xiàn)散在的流行，其傳播途徑多樣，即可通過(guò)流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水污染的飼料、飲水等經(jīng)消化道傳染易感動(dòng)物和人，蜱或昆蟲在本病傳播中也起一定作用，也可通過(guò)交配和精液傳播，并且此病只發(fā)生在懷孕的母畜，懷孕母畜不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，母羊妊娠的中期和晚期發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)的胎兒為木乃伊、死產(chǎn)和弱羔，流產(chǎn)后幾天可排出分泌物，胎衣常滯留，關(guān)于該病沒有準(zhǔn)確的診斷方法，而且對(duì)牛羊親衣原體和鸚鵡熱親衣原體的區(qū)分報(bào)道很少[7]，因此常出現(xiàn)誤診，錯(cuò)過(guò)治療該病的最佳時(shí)期，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。鸚鵡熱親衣原體的天然宿主是禽類和哺乳動(dòng)物；牛羊親衣原體主要感染牛、羊，檢測(cè)該類病時(shí)要注意區(qū)分。

本次檢測(cè)為了進(jìn)一步區(qū)分流產(chǎn)性親衣原體和鸚鵡熱親衣原體，在實(shí)驗(yàn)室診斷方面通過(guò)間接血凝實(shí)驗(yàn)和PCR檢測(cè)SPF雞胚分離病原并對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，共同檢測(cè)病原。PCR檢測(cè)結(jié)果和血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，且該養(yǎng)殖專業(yè)戶沒有打過(guò)任何衣原體的疫苗，PCR測(cè)序結(jié)果顯示與鸚鵡熱親衣原體基因100%相同，綜合流行病學(xué)調(diào)查、病理變化觀察、臨床剖檢、血清學(xué)與PCR診斷最終確診引起該養(yǎng)殖場(chǎng)妊娠母畜流產(chǎn)的病原為鸚鵡熱親衣原體，本次檢測(cè)結(jié)果幫助該養(yǎng)殖專業(yè)戶確定了引起懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn)的病原，為其治療提供了依據(jù)，對(duì)其他懷孕母羊進(jìn)行預(yù)防性注射紅霉素，流產(chǎn)胎兒進(jìn)行深埋防止污染。本次分離鑒定獲得鸚鵡熱親衣原體為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)進(jìn)行衣原體的熒光定量檢測(cè)方法建立與分子克隆奠定了基礎(chǔ)。

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ApplicationofBI-2000ImageAnalysisSysteminRabbitswithHemorrhagicShock

CHEN Xue,AN Ying,SHEN Nan,XU Bo,ZHAO Li-jing

(ExperimentCenter,JilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin,132013,China)

Experimental study of hemorrhagic shock in rabbits is an important part in the experiment of medical function.In the daily teaching process,the traditional classical experiment only observed the change of blood pressure during the experiment.To solve this problem,we introduced the BI-2000 image analysis system,and applied it in the 2014th teaching reforme of clinical medicine,so that students have a more profound understanding of the mechanism of the occurrence and development of shock,and have a more intuitive understanding of the characteristics of the changes of microcirculation blood perfusion in each stage of shock.

BI-2000 image analysis system; rabbit; hemorrhagic shock; experimental method

DiagnosisofChlamydophilaabortusInfectioninGoats

WU Hao-yang1,2,HUANG jia-li1,XU Ying1,SUN Pei2,FU Ming-zhe1,XU Xin-gang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,Chian; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui,230036,Chian)

S852.67

B

1007-5038(2017)12-0133-04

2017-04-27

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-092)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2016KTZDNY02-05)；楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)科技示范推廣項(xiàng)目(TS-2016-13；2017-TS-23)

吳浩陽(yáng)(1991-)，男，河南洛陽(yáng)人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治研究。*

Abstract:The diagnoses of goat miscarriage in a certain goat farm in Shaanxi province were carried out by epidemiological investigation,clinical symptoms and pathological examination,brucellosis tiger red plate agglutination test,chlamydia indirect hemagglutination kit and PCR.The results showed that the chlamydia specific fragment was amplified by PCR from the genome ofChlamydophilaabortusin GenBank,the clinical symptoms and pathological lesions were initially suspected to be infected withBrucellaandChlamydiapsittaci.All the serological tests showed thatBrucellawas negative and theChlamydophilaabortuswas all positive.The PCR results obtained 523 bp gene fragment,sequencing results showed 100% similarity withChlamydiapsittaci.According to epidemiological investigation,clinical symptoms and pathologic examination,etiology and serological diagnosis and PCR,the final diagnosis of the disease was made as native epidemic goat abortion caused byChlamydiapsittaci.

Keywords:goat abortion;Chlamydiapsittaci; diagnosis