恒溫?zé)岣艚^式PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

王 娟，卞國志，王貴平，袁建豐*

(1.廣東海洋大學(xué)畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

恒溫?zé)岣艚^式PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

王 娟1△，卞國志1,2△，王貴平1，袁建豐1*

(1.廣東海洋大學(xué)畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

由于常規(guī)PCR所使用的加熱機(jī)制為熱傳導(dǎo)的熱循環(huán)儀，需要一個精密的數(shù)字控制器來快速加熱和冷卻樣品。近年來，越來越多的研究致力于開發(fā)一種快速、便攜式的核酸檢測PCR平臺。而自然對流作為另一種熱轉(zhuǎn)換方式，能促進(jìn)液體自發(fā)反復(fù)循環(huán)以提供工作所需的變性、退火和延伸溫度，在核酸檢測領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。恒溫?zé)岣艚^式PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)就是采用Rayleigh-Be′nard自然對流原理，利用儀器底部單一熱源對特殊聚碳酸酯毛細(xì)反應(yīng)管底部的紫銅圈接觸加熱，毛細(xì)管上部置入隔熱擋板，上下的溫度差從而使毛細(xì)管內(nèi)部流體對流自發(fā)形成可供PCR擴(kuò)增反應(yīng)的連續(xù)的溫度梯度，LED屏上直接顯示檢測結(jié)果。與傳統(tǒng)的PCR檢測方法相比，具有操作簡便、快速高效、特異性強(qiáng)、儀器成本低等優(yōu)點，已開始運(yùn)用于臨床各種病原體的檢測。

聚合酶鏈反應(yīng)；瑞利-本納德對流；恒溫?zé)岣艚^式PCR

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是用于擴(kuò)增特異性核酸序列的技術(shù)[1]，由于其高特異性和敏感性，成為動植物及人類病原檢測的重要工具之一[2-5]。常規(guī)PCR過程需要使用一個精密的熱控制器反復(fù)加熱和冷卻樣品，通常為25～50個循環(huán)，整個反應(yīng)需2 h～3 h，其中大部分時間消耗于DNA變性加熱和退火及延伸的冷卻過程，難以實現(xiàn)高效和高通量。在早期發(fā)展階段，由于常規(guī)PCR熱循環(huán)儀的尺寸較大，價格偏高和加熱時間較長等原因限制了其在醫(yī)院和實驗室的使用。近年來，開發(fā)的新平臺致力于縮短擴(kuò)增時間，一種方法是通過高電力珀爾帖元件的使用來提高溫度斜坡變化的速率[6-9]，使PCR總體擴(kuò)增時間從2 h～3 h縮短到30 min～40 min，但這種提高溫度斜坡變化效率的方法需要比傳統(tǒng)的熱循環(huán)儀更精密且更昂貴的熱控制器。另一種方法是用一個專門設(shè)計的微流控芯片全部更換的熱循環(huán)儀，該平臺將試劑在微通道內(nèi)通過3個區(qū)域在不同的固定溫度下循環(huán)，雖然微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)制造生物芯片的方法可以顯著縮小這種系統(tǒng)的尺寸，但是此種系統(tǒng)需要額外的泵源、復(fù)雜的微通道設(shè)計以及同時運(yùn)行兩個或3個溫度控制器[10-12]。

封閉體系內(nèi)流體自動對流可以形成穩(wěn)定的溫度梯度，可以應(yīng)用于DNA的擴(kuò)增[13]，當(dāng)樣品中的試劑反復(fù)通過自然對流驅(qū)動的不同溫度區(qū)循環(huán)時，樣品在單循環(huán)中同時進(jìn)行PCR循環(huán)的3個步驟—核酸變性、退火和延伸，而且對流PCR平臺不需要常規(guī)PCR儀中最昂貴的組件——精密的熱控制器，就能將擴(kuò)增時間從數(shù)小時縮短至30 min～40 min[14-15]。然而，目前對流PCR系統(tǒng)使用2個或2個以上的獨立的溫度控制器和復(fù)雜的設(shè)計，需要特定形狀的塑料管或額外的腔室進(jìn)行流體循環(huán)[16-18]。此外，很少有研究檢驗傳統(tǒng)和對流PCR之間引物和擴(kuò)增片段的設(shè)計的差異，限制了對流PCR的多功能應(yīng)用。

本文介紹了一種應(yīng)用對流的新平臺——恒溫?zé)岣艚^式PCR(iiPCR)，利用儀器底部單一熱源加熱，使毛細(xì)管內(nèi)部液體自然對流形成PCR各步驟反應(yīng)所需溫度，達(dá)到擴(kuò)增的目的。iiPCR作為一種快速、便捷、低廉的檢測平臺具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 瑞利-本納德對流PCR

1.1 原理

Krishnan M等[13]在Science上首次報道了利用圓盤腔體內(nèi)自然對流Rayleigh-Be′nard (瑞利-本納德)原理(圖1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，即將PCR反應(yīng)液置于一個封閉的柱形反應(yīng)腔內(nèi)，反應(yīng)腔的上下表面分別進(jìn)行恒溫控制(上端溫度為61℃，下端溫度為97℃)，并通過數(shù)值模擬研究了幾何尺寸對自然對流穩(wěn)定性的影響以及腔體內(nèi)不同位置處流體溫度隨時間的變化，通過上下表面的溫差驅(qū)動液體經(jīng)過不同的溫區(qū)自發(fā)形成自然對流，達(dá)到PCR各步驟所需的熱循環(huán)實現(xiàn)PCR擴(kuò)增。

圖1 瑞利-本納德PCR原理圖

1.2 優(yōu)缺點

1.2.1 優(yōu)點 RB系統(tǒng)簡單，利用自然對流來形成PCR所需要的熱循環(huán)溫度，大幅縮短了反應(yīng)時間，提高了反應(yīng)效率。另外，該方法不需要改變器件的溫度，也不需要外加驅(qū)動來實現(xiàn)樣品的流動，只需要一個反應(yīng)腔，并控制其上下兩端的溫度為恒溫，就可以實現(xiàn)PCR擴(kuò)增，因此容易裝置，加工成本降低。更高層次的流體力學(xué)裝置及優(yōu)化流體系統(tǒng)的研究也許可進(jìn)一步改善和提高此系統(tǒng)潛在的多功能用途。

1.2.2 缺點 反應(yīng)利用幾何學(xué)浮力驅(qū)動原理，衡量自然對流的無量綱數(shù)是Ra=gα(T2-T1)h3/vk，α是流體熱膨脹系數(shù)，g是重力加速度，T1和T2分別是腔體的上下表面溫度，h是腔體的高度，v和k分別是運(yùn)動粘度和熱擴(kuò)散率。對于封閉腔內(nèi)的RB對流，Ra流動越不穩(wěn)定，流動由層流變成湍流的Ra是104數(shù)量級，而Krishnan等文獻(xiàn)中的模型瑞利系數(shù)太大，容易導(dǎo)致對流不穩(wěn)定，所以反應(yīng)重復(fù)性差，反應(yīng)效率低且對環(huán)境溫度敏感。

1.3 應(yīng)用

2003年Braun D等[19]建立分層對流模型能在25 min內(nèi)使DNA片段達(dá)到100 000倍的擴(kuò)增。具體方法是將樣品置于薄圓腔體內(nèi)，腔體中央紅外光加熱器在中心聚焦加熱，腔體中心達(dá)到95℃，而腔體的周壁保持在52℃，這樣圓盤內(nèi)就產(chǎn)生了由恒定水平溫度方向形成的對流，實現(xiàn)PCR所需的熱循環(huán)。此種方法瑞利系數(shù)小，對流穩(wěn)定，但由于需要引入外源的加熱器，且形成的對流體系中，高溫和底溫的恒溫區(qū)位于中心和外側(cè)壁，使流體停留在95℃的時間較短，不利于PCR充分進(jìn)行。

由于RB-PCR系統(tǒng)非常簡單，可以很容易地在任何實驗室組裝。可以通過改善在高縱橫比腔的對流特征和優(yōu)化流動系統(tǒng)PCR的研究，來優(yōu)化和進(jìn)一步提高該系統(tǒng)的潛在的多功能性。

2 毛細(xì)管對流PCR

2.1 原理

參考Rayleigh-Be′nard對流PCR的原理， 毛細(xì)管對流PCR(capillary convective PCR，CCPCR)檢測平臺無需復(fù)雜的微流控芯片設(shè)計、特殊的管道或容器，將毛細(xì)管安裝在固定溫度為95℃的加熱器上，被連續(xù)加熱的毛細(xì)管底部通過對流驅(qū)動最底部分的樣品上升，同時變性模板，由于毛細(xì)管上部與空氣接觸，上升的這部分樣品的溫度迅速被周圍空氣冷卻，當(dāng)樣品到達(dá)管的頂部附近的冷卻區(qū)域時已經(jīng)退火和延伸，然后DNA模板下沉，并再次加熱，PCR循環(huán)以自然對流這種方式得以實現(xiàn)。

CCPCR反應(yīng)前需要把包含樣品的整個毛細(xì)管置于裝置右端的加熱器加熱10 min熱啟動Taq酶，再轉(zhuǎn)移至左端塑料架上，由單一熱源加熱底部引起自然對流從而進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)30 min[20]。

2.2 優(yōu)缺點

2.2.1 優(yōu)點 儀器設(shè)備和操作簡單，不需要任何復(fù)雜的硬件設(shè)施，只需要一個簡單的加熱裝置，因此電蚊香也可以用來進(jìn)行PCR；擴(kuò)增時間大大縮短，從原來的2 h～3 h縮減到30 min～40 min。

2.2.2 缺點 由于毛細(xì)管除底部外全暴露在空氣中，所以環(huán)境溫度及風(fēng)速的變化都對CCPCR反應(yīng)有影響，另外CCPCR要求重新設(shè)計并優(yōu)化引物及擴(kuò)增片段，當(dāng)擴(kuò)增片段小于500 bp、引物溶解溫度較高、變性溫度較低時，試驗結(jié)果更佳。

2.3 應(yīng)用

Chou W P 等[20]建立了毛細(xì)管對流PCR平臺，成功擴(kuò)增出3個病毒的基因組，研究中此方法的敏感性和擴(kuò)增的效率性均高于普通PCR方法，通過試驗驗證發(fā)現(xiàn)CCPCR適合室內(nèi)(4℃～33℃)除特別炎熱的區(qū)域外操作。

由于CCPCR除大大縮短反應(yīng)時間外所需儀器設(shè)備簡單，價格低廉，實驗操作方便，適用于臨床及基層室內(nèi)的核酸快速診斷，具有較大的應(yīng)用前景。

3 恒溫?zé)岣艚^式PCR

3.1 原理

恒溫?zé)岣艚^式PCR(insulated isothermal PCR， iiPCR)仍沿用Rayleigh-Be′nard對流的原理，利用儀器底部單一熱源對特殊聚碳酸酯毛細(xì)反應(yīng)管底部上方2 mm處覆蓋一圈2.5 mm厚的紫銅圈進(jìn)行接觸加熱，使毛細(xì)管底部維持恒定95℃，毛細(xì)管上部置入隔熱擋板，上下部的溫度差從而使毛細(xì)管內(nèi)部流體自發(fā)對流，形成可供PCR擴(kuò)增反應(yīng)的連續(xù)的溫度梯度。 iiPCR是對CCPCR裝置繼續(xù)改造優(yōu)化，顯著降低了環(huán)境溫度波動對PCR擴(kuò)增的影響，使反應(yīng)可在風(fēng)洞以及室溫較低條件下進(jìn)行。具體優(yōu)化隔熱裝置體現(xiàn)在裝置中鋁合金可隔離管周圍水平和垂直空氣對流，隔絕毛細(xì)管外部的影響，儀器底部的單一加熱裝置覆蓋聚碳酸酯以減少熱輻射，毛細(xì)管底部上方加入的隔熱板，減少環(huán)境溫度影響，使毛細(xì)管內(nèi)部形成的對流更加穩(wěn)定[21]。另外，操作系統(tǒng)中加入熒光收集裝置、濾波器、集成電路及液晶顯示屏幕等，使iiPCR裝置不僅可以檢測DNA，還可以檢測RNA，若反應(yīng)加入特異性探針，只需將含反應(yīng)試劑的毛細(xì)管置于裝置中反應(yīng)，任何檢測結(jié)果在1 h內(nèi)可在儀器的液晶顯示屏上直接讀取，顯示為陰性(-)、陽性(+)或者可疑(？)[22]。

3.2 優(yōu)缺點

3.2.1 優(yōu)點 操作簡單、反應(yīng)時間短,1 h內(nèi)便可檢測出結(jié)果。隔熱效果好，可在風(fēng)洞以及室溫較低條件下進(jìn)行試驗，方便攜帶，實現(xiàn)在室外快速進(jìn)行PCR擴(kuò)增操作；儀器成本低，僅需上千元；并有著與普通PCR相適應(yīng)的高特異性及高敏感性。

3.2.2 缺點 由于iiPCR的高敏感性，所需引物特異性較高，因此iiPCR引物設(shè)計要求較高，如引物長度推薦在18 bp～22 bp，擴(kuò)增目的片段在70 bp～150 bp為佳(100 bp內(nèi)更好)，GC含量45%～60%，引物Tm值在56℃～60℃之間。另外，探針的合成費用較高，且探針的設(shè)計也應(yīng)遵循說明書原則，如引物長度應(yīng)大于13 bp (增強(qiáng)特異性)且小于30 bp(保持最佳猝火效果)。

3.3 應(yīng)用

有研究改造發(fā)明此裝置，分別測試了環(huán)境溫度分別為38℃、45℃以及不穩(wěn)定空氣流速的環(huán)境下iiPCR擴(kuò)增結(jié)果，試驗證明加入隔熱裝置可顯著降低環(huán)境溫度波動對PCR的影響，當(dāng)環(huán)境溫度從10℃升到28℃時，毛細(xì)管溫度僅升高1.5℃，溫度波動降低到0.11℃～0.14℃。此外，在風(fēng)洞中試驗毛細(xì)管溫度僅下降1.8℃；并且在模板同樣拷貝數(shù)的條件下，隔熱裝置對流PCR擴(kuò)增條帶比CCPCR明亮清晰[23]。同年Tsai Y L 等[21]成功建立了白斑綜合征病毒iiPCR檢測方法，該方法特異性、敏感性均良好。

由于擴(kuò)增產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測反應(yīng)結(jié)果這一后續(xù)步驟，限制了iiPCR的應(yīng)用。2012年Tsai Y L等[22]在iiPCR裝置的基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化改造，加入由集成控制電路、LED、濾光器以及熒光收集裝置等構(gòu)成的光學(xué)系統(tǒng)，只需在反應(yīng)時加入具有水解性探針，即可直接在儀器上通過熒光顯示系數(shù)判斷擴(kuò)增結(jié)果。研究者通過數(shù)次實驗找出陰性結(jié)果與陽性結(jié)果熒光閾值，發(fā)現(xiàn)S/N(反應(yīng)后與反應(yīng)前熒光信號強(qiáng)度的比值)小于1.34時，表示擴(kuò)增結(jié)果為陰性。此方法敏感性可比普通PCR，在只要有模板DNA含量的情況下，30 min內(nèi)即可檢測出擴(kuò)增的目的條帶，但此方法中要求探針只有在擴(kuò)增出目的片段時才能發(fā)出熒光，且探針引物設(shè)計長度盡可能短。

最新研制的pockit智能型手提式核酸分析儀，可熒光定性檢測DNA及RNA，檢測的準(zhǔn)確度和敏感性極高，整體操作極為簡單，PCR反應(yīng)總反應(yīng)時間僅需58 min，包括前10 min的反轉(zhuǎn)錄過程和48 min的核酸擴(kuò)增時間，反應(yīng)結(jié)束后檢驗結(jié)果直接顯示在LED屏幕上(陰性或者陽性，問號表示結(jié)果可疑)，并存儲在機(jī)器的SD卡上。由于此儀器方便易攜，操作簡便快捷，迅速運(yùn)用于臨床實驗室檢測[24-31]。

4 展望

恒溫?zé)岣艚^式PCR由于其高效性，擴(kuò)增時間小于1 h；高敏感性，最低檢測限度一般在30個拷貝數(shù)以下；方便快捷性，可直接觀察檢測結(jié)果；操作簡單，無需訓(xùn)練精良的實驗操作人員及復(fù)雜精密的儀器；成本低，儀器價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通PCR儀等優(yōu)點，已經(jīng)在臨床核酸快速檢測方向顯示其優(yōu)勢，該檢測手段將作為分子生物學(xué)一種快速檢測技術(shù)廣泛運(yùn)用于各種病原體核酸的快速診斷領(lǐng)域，為及時控制傳染病和臨床快速診斷疾病提供技術(shù)支撐。

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InducedMethodforDifferenationofPancreaticStemCellsintoIstetCells

DUAN Jia-hui，ZHAO Dong-dong，LI Kai-xin,ZHAO Xiao-yan,ZUO Wen-jun,LIN Shu-mei

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang，Liaoning，110866，China)

As a common metabolic disease worldwide,diabetes cause serious damage to human and animal health. Conventional drug and insulin injections are not enough to cure diabetes.In recent years,with the deepening of the stem cell research,use of pancreatic stem cells to differentiate into islet cells to treat diabetes become a research hotspot.The key point for stem cells to treat diabetes is clarifying the source of stem cells and the method of directional differentiation.The paper simply reviewed the research progress on pancreatic stem cells to differentiate into islet cells to treat diabetes.

pancreatic stem cell; diabetes; directed differentiation; insulin

PrincipleandApplicationofInsulatedIsothermalPCR

WANG Juan1，BIAN Guo-zhi1,2,WANG Gui-ping1,YUAN Jian-feng1

(1.GuangdongHaidInstituteofanimalHusbandry&Veterinary,Guangzhou，Guangdong，511400，China; 2.CollegeofVeterinaryMedicineSouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou，Guangdong，510642,China)

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0114-05

2017-03-21

廣東省科技計劃項目(2014A020208052)；廣州市科技計劃項目(201510010250)

王 娟(1991-)，女，湖南岳陽人，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*

Abstract:Because the heating mechanism used in convention PCR based on thermal conductivity still require a delicate digital controller to rapidly heat and cool the sample,in recent years,a growing number of studies have focused on developing a fast and portable PCR platform for nucleic acid testing.Natural convection,another mode of heat transfer,promotes spontaneous and repeated liquid circulation to provide working temperatures for denaturation,annealing and extension.Insulated isothermal PCR (iiPCR),a rapid nucleic acid detection method,based on Rayleigh-Be′nard convection principle，amplification is carried in an iiPCR device in which a special polycarbonate capillary tube(R-tubeTM) is heated isothermally by a copper ring attached to tis bottom and shielded by a thermal baffle around its upper half，spontaneous fluid convection in a R-tube is driven by temperature gradients for PCR reaction.The results show directly on LED display.Compared with the traditional PCR; iiPCR assay shows its advantages in the rapid detection of clinical nucleic acid,and has begun to use in the field of clinical diagnosis of various pathogens for its low cost,simple and easy operation,high specificity,high sensibility and high amplification efficiency.Here we proceeded a review for insulated isothermal PCR covering its introduction,research progress and application prospect.

Keywords:PCR; rayleigh-Be′nard convection; insulated isothermal PCR