激動(dòng)素對(duì)AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)的AD小鼠模型大腦病理變化和Aβ表達(dá)的影響

劉 丹，魏云鵬，歐陽(yáng)五慶

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

激動(dòng)素對(duì)AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)的AD小鼠模型大腦病理變化和Aβ表達(dá)的影響

劉 丹，魏云鵬，歐陽(yáng)五慶*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

旨在研究激動(dòng)素對(duì)AD小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。首先用AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合處理制備AD小鼠模型，然后用不同濃度的激動(dòng)素進(jìn)行干預(yù)處理，再通過(guò)HE染色對(duì)大腦海馬CA3區(qū)進(jìn)行病理學(xué)觀察，并對(duì)大腦皮層和海馬部位β淀粉樣蛋白(β amyloid protein，Aβ)進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果表明，AlCl3和D-半乳糖處理過(guò)的小鼠其海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)生明顯的病理變化，而激動(dòng)素的干預(yù)減輕了這一病變，且表現(xiàn)出劑量依賴性。同時(shí)，AlCl3和D-半乳糖處理過(guò)的小鼠與空白組小鼠相比，大腦皮層和海馬區(qū)Aβ1-42分布均顯著增加，但激動(dòng)素干預(yù)能夠使Aβ1-42的表達(dá)和分布明顯減少，且顯示出劑量依賴性的特點(diǎn)。這些結(jié)果說(shuō)明激動(dòng)素對(duì)AD小鼠模型具有一定的正向干預(yù)作用，表明激動(dòng)素可能具有抗AD的潛力。

激動(dòng)素；三氯化鋁；D-半乳糖；病理變化；Aβ

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而急劇上升，其能夠剝奪老年患者的自主生活能力，并嚴(yán)重危害老年人的身心健康。AD的典型病理學(xué)特征包括大腦皮層和海馬區(qū)細(xì)胞外出現(xiàn)大量由Aβ沉積形成的老年斑(senile plaque，SP)[1]，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量由高度磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)[2]和明顯的神經(jīng)元丟失[3]。盡管AD的發(fā)病機(jī)制多樣，但已有研究表明鋁暴露和氧化應(yīng)激是AD發(fā)病的重要原因[5-7]。Al是地殼中含量最豐富的金屬元素，但其對(duì)大腦有著非常明顯的神經(jīng)毒性[8]。鋁(Al)會(huì)引起神經(jīng)元細(xì)胞外Aβ沉積并誘發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，進(jìn)而引起神經(jīng)元氧化應(yīng)激和損傷[9]。D-半乳糖是一種體內(nèi)的還原糖，當(dāng)其在體內(nèi)含量大大高于正常水平時(shí)，它可被半乳糖氧化酶氧化為不可被進(jìn)一步代謝的醛類，其大量蓄積于腦組織中，從而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和衰老凋亡[10]。大量研究表明，三氯化鋁(AlCl3)和D-半乳糖聯(lián)合處理動(dòng)物，尤其是嚙齒動(dòng)物，能夠顯著損傷其學(xué)習(xí)和記憶能力，并能誘導(dǎo)大量的Aβ1-42在大腦皮層和海馬部位表達(dá)和積累[11-12]，且聯(lián)合使用能增強(qiáng)兩者的神經(jīng)毒性效應(yīng)[13]。目前，聯(lián)合應(yīng)用AlCl3和D-半乳糖制備AD小鼠模型已得到國(guó)內(nèi)外的廣泛認(rèn)可。

激動(dòng)素屬于植物細(xì)胞分裂素家族成員，是腺嘌呤的衍生物。研究發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)素可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂和分化，同時(shí)能夠增強(qiáng)植物細(xì)胞抗衰老及抗氧化能力[14-16]。此外，其他相關(guān)研究表明，激動(dòng)素同樣能夠在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮抗衰老和抗氧化損傷的作用。同時(shí)，有報(bào)道稱激動(dòng)素能夠保護(hù)大鼠大腦和體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞免于D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的損傷[16-17]。但激動(dòng)素是否對(duì)AD小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合制備小鼠AD模型，同時(shí)用不同濃度的激動(dòng)素進(jìn)行干預(yù)，然后通過(guò)觀察大腦病理變化及Aβ分布水平來(lái)研究激動(dòng)素對(duì)AD小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雌性昆明小鼠，90只，體重18 g～22 g，均未孕，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)。

1.1.2 主要試劑 激動(dòng)素(純度≥97%)為Sigma公司產(chǎn)品(K0753)；D-半乳糖為Solarbio公司產(chǎn)品(D8310)；兔抗鼠Aβ1-42一抗為Abcam公司產(chǎn)品(ab201060)；HRP山羊抗兔二抗為Solarbio公司產(chǎn)品(SE134)。

1.1.3 主要儀器 病理切片機(jī)為上海徠卡儀器有限公司產(chǎn)品(RM2016)；正置光學(xué)顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品(NIKON ECLIPSE CI)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 將90只小鼠隨機(jī)平均分為6組，分別為空白組、模型組、激動(dòng)素低劑量干預(yù)組、激動(dòng)素中劑量干預(yù)組、激動(dòng)素高劑量干預(yù)組、激動(dòng)素組。模型組和低、中、高激動(dòng)素干預(yù)組每日飼喂含有AlCl3飲用水，每只小鼠每天攝入AlCl3的劑量為100 mg/kg，同時(shí)于頸背部注射200 mg/kg 的D-半乳糖。另外對(duì)低、中、高激動(dòng)素干預(yù)組分別進(jìn)行激動(dòng)素混懸液灌胃，激動(dòng)素混懸液的灌胃劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg；激動(dòng)素組每日飼喂正常飲用水，頸背部注射等量的生理鹽水，同時(shí)用40 mg/kg劑量的激動(dòng)素混懸液灌胃一次；空白組每日飼喂正常飲用水，頸背部注射等量的生理鹽水，同時(shí)灌胃等量的蒸餾水。所有操作連續(xù)進(jìn)行90天。

1.2.2 腦組織固定和取材 以400 mg/kg劑量的巴比妥鈉對(duì)小鼠實(shí)施腹腔麻醉，再用剪刀和鑷子打開(kāi)胸腔，在右心耳處剪開(kāi)一個(gè)小口，將裝有生理鹽水的注射器針頭插入左心室，進(jìn)針不超過(guò)0.5 cm。將生理鹽水緩緩?fù)七M(jìn)小鼠心臟，右心耳流出的液體逐漸變淡至無(wú)色，然后將注射器拔離針頭，針頭不要移動(dòng)，快速將裝有40 mL/L多聚甲醛的去針頭注射器插入，先快后慢推進(jìn)小鼠體內(nèi)，可看到小鼠四肢緊張，尾部卷曲。待小鼠心臟完全停止跳動(dòng)，撤去注射器，用彎頭剪刀小心打開(kāi)并剝離顱骨，再用彎鑷伸入顱底離斷顱底神經(jīng)，取出全腦，放于40 mL/L多聚甲醛中固定24 h以上。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 將固定好的全腦經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，HE染色，對(duì)海馬區(qū)進(jìn)行觀察拍照并分析。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 將1.2.3制備的石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，BSA封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB染色，細(xì)胞核復(fù)染及脫水封片，對(duì)皮質(zhì)和海馬區(qū)進(jìn)行觀察拍照并分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠大腦海馬CA3區(qū)病理組織學(xué)變化結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察表明，空白組小鼠大腦海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞沒(méi)有明顯的形態(tài)變化以及病理學(xué)變化，細(xì)胞整體排列密集整齊、胞體完整、核仁明顯；模型組的錐體細(xì)胞排列錯(cuò)亂、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞深染、形狀不規(guī)則；激動(dòng)素低劑量干預(yù)組的錐體細(xì)胞病理學(xué)變化較模型組略有改善，正常形態(tài)的錐體細(xì)胞數(shù)量略有增多，異常錐體細(xì)胞數(shù)量略有減少；激動(dòng)素中劑量干預(yù)組相比低劑量干預(yù)組出現(xiàn)更多正常的錐體細(xì)胞及更少的異常錐體細(xì)胞；而激動(dòng)素高劑量干預(yù)組相比中劑量干預(yù)組出現(xiàn)更多正常的錐體細(xì)胞及更少的異常錐體細(xì)胞；激動(dòng)素組的錐體細(xì)胞與空白組相比，沒(méi)有明顯的形態(tài)變化和病理學(xué)變化。

C.空白組；M.模型組；LK.激動(dòng)素低劑量干預(yù)組；MK.激動(dòng)素中劑量干預(yù)組；HK.激動(dòng)素高劑量干預(yù)組；K.激動(dòng)素組。綠色箭頭所指的是正常的錐體細(xì)胞，而紅色箭頭所指的是非正常錐體細(xì)胞

C.Control group; M.Model group; LK.Low dose kinetin group; MK.Middle dose kinetin group; HK.High dose kinetin group; K.Kinetin group.The black arrowhead points normal pyramidal cells and red arrowhead points distorted pyramidal cells

圖1各組小鼠大腦海馬CA3區(qū)HE染色顯微圖像

Fig.1 Photomicrograph of hippocampus CA3 region from each experimental group

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，空白組小鼠大腦皮層中染成棕色Aβ1-42斑塊很少；模型組小鼠大腦皮層區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞周?chē)嬖诖罅咳境缮钭厣腁β1-42斑塊，同時(shí)神經(jīng)元間隙也彌散性地廣泛存在染成淺棕色的Aβ1-42；激動(dòng)素低劑量干預(yù)組的神經(jīng)元細(xì)胞周?chē)泊嬖谳^多染成棕色的Aβ1-42斑塊，但染色深度相比于模型組較淺，神經(jīng)元細(xì)胞間隙彌散分布的Aβ1-42也相對(duì)減少；激動(dòng)素中劑量干預(yù)組神經(jīng)元周?chē)蜕窠?jīng)元間隙的Aβ1-42分布相比激動(dòng)素低劑量干預(yù)組進(jìn)一步降低；而激動(dòng)素高劑量干預(yù)組神經(jīng)元周?chē)蜕窠?jīng)元間隙的Aβ1-42分布和激動(dòng)素中劑量干預(yù)組相比更低；激動(dòng)素組小鼠大腦皮層中的Aβ1-42分布和空白對(duì)照組相比差別不大。

此外，空白組小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞周?chē)蝗旧腁β1-42斑塊很少；模型組小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞周?chē)罅看嬖诒蝗境蓽\棕色的Aβ1-42斑塊，細(xì)胞間隙也存在廣泛且彌散的Aβ1-42分布；激動(dòng)素低劑量干預(yù)組相比模型組小鼠，海馬區(qū)錐體細(xì)胞周?chē)图?xì)胞間隙的Aβ1-42分布有所下降；激動(dòng)素中劑量干預(yù)組相比激動(dòng)素低劑量干預(yù)組，海馬區(qū)錐體細(xì)胞周?chē)图?xì)胞間隙Aβ1-42的分布進(jìn)一步減少；激動(dòng)素高劑量干預(yù)組相比激動(dòng)素低劑量中預(yù)組，海馬區(qū)錐體細(xì)胞周?chē)图?xì)胞間隙的Aβ1-42分布更少；激動(dòng)素組海馬區(qū)的錐體細(xì)胞周?chē)图?xì)胞間隙的Aβ1-42分布和空白對(duì)照組相比差別不大。

A.Aβ1-42在大腦皮層中的分布；B.Aβ1-42在大腦海馬區(qū)的分布;C.空白組；M.模型組；LK.激動(dòng)素低劑量干預(yù)組；MK.激動(dòng)素中劑量干預(yù)組；HK.激動(dòng)素高劑量干預(yù)組；K.激動(dòng)素組

A. The distributions of Aβ1-42in cortex ;B.The distribution of Aβ1-42in hippocampus;C.Control group; M.Model group; LK.Low dose kinetin group; MK.Middle dose kinetin group; HK.High dose kinetin group; K.Kinetin treatment alone

圖2小鼠大腦Aβ1-42免疫組化結(jié)果(200×)

Fig.2 Immunohistochemical staining results of Aβ1-42in brain tissues of each group(200×)

3 討論

大量研究表明，鋁元素具有顯著的神經(jīng)毒性，是已知多種神經(jīng)退行性疾病的高風(fēng)險(xiǎn)致病因子[18]。首先，鋁元素的促氧化能力在ROS介導(dǎo)的神經(jīng)變性損傷中起著非常重要的作用。鋁離子可以和超氧陰離子結(jié)合形成一種鋁過(guò)氧化物[19]，誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS，引起氧化應(yīng)激。線粒體既是ROS的主要來(lái)源，也最易遭受其攻擊。線粒體膜和蛋白的損傷會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，損傷線粒體DNA，激活大腦細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，引起神經(jīng)元凋亡[20]。其次，長(zhǎng)期接觸鋁元素會(huì)引起大腦ATP合成速率降低，同時(shí)升高ATP水解速率[21]，從而干擾大腦的能量代謝過(guò)程。再次，在大腦中，鋁易與富含磷酸的核酸結(jié)合，影響遺傳信息的表達(dá)，從而產(chǎn)生基因毒性[6-8]。此外，鋁會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)蛋白和肽段沉積，而沉積的Aβ會(huì)形成老年斑并進(jìn)一步產(chǎn)生Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[9]。鋁除了具有上述神經(jīng)毒性，還能容易地穿過(guò)血腦屏障[18]，從而大大增強(qiáng)了其神經(jīng)毒性。D-半乳糖是一種體內(nèi)的還原糖，正常情況下，其會(huì)被迅速轉(zhuǎn)化為葡萄糖。當(dāng)其高于正常水平時(shí)，它可被半乳糖氧化酶氧化為醛類。大量未代謝的半乳糖以及其代謝物聚集在腦組織中，引發(fā)細(xì)胞滲透壓升高、細(xì)胞內(nèi)ROS升高、細(xì)胞脆性增加及細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦功能的退化，包括認(rèn)知損傷和Aβ沉積[10,22-24]。

大腦中的海馬區(qū)是進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶和空間導(dǎo)航的最重要部位，其從解剖學(xué)上可劃分為若干個(gè)重要的區(qū)域，其中最重要的是齒狀回、CA3區(qū)和CA1區(qū)[25]。其中CA3區(qū)的錐體細(xì)胞可接受來(lái)自三方面的刺激，包括齒狀回顆粒細(xì)胞伸出的苔狀纖維、嗅皮質(zhì)淺層星型角質(zhì)細(xì)胞的穿通軸突以及CA3區(qū)錐體細(xì)胞相互伸出的回返性旁支[26]。由于CA3區(qū)有著復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，所以其在大腦的記憶功能中扮演著重要的角色[25]。本試驗(yàn)中，AlCl3和D-半乳糖處理過(guò)的小鼠海馬CA3區(qū)發(fā)生明顯的退行性病變，例如椎體細(xì)胞排列錯(cuò)亂、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。這些變化說(shuō)明AlCl3和D-半乳糖確實(shí)具有顯著的神經(jīng)毒性，能夠?qū)ｑR區(qū)細(xì)胞造成實(shí)質(zhì)性的損傷并造成顯著的病理變化，這與之前的報(bào)道一致[11,27]。然而，激動(dòng)素的干預(yù)減輕了這一病變，且表現(xiàn)出劑量依賴性，表明激動(dòng)素能減輕AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。

Aβ是由β和γ分泌酶逐步水解β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)所形成的短肽[1]，其主要類型包括Aβ1-40和Aβ1-42，且Aβ1-42被認(rèn)為比Aβ1-40具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性[4]。Aβ能刺激谷氨酸受體引發(fā)興奮性中毒，這在Aβ致病級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著重要的作用[28]。Aβ能抑制中間神經(jīng)元的活性，而異常的神經(jīng)網(wǎng)活動(dòng)可能會(huì)引發(fā)惡性循環(huán)，造成更多Aβ聚集[29]。Aβ神經(jīng)毒性還可能與其能夠引發(fā)氧化應(yīng)激有關(guān)。在AD患者和轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，Aβ能與乙醇脫氫酶在線粒體中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生更多的ROS，使線粒體功能的喪失，最終引起細(xì)胞凋亡[30-31]。ROS能通過(guò)激活各種信號(hào)通路，改變APP代謝進(jìn)程，使Aβ異常產(chǎn)生和積累[9]。另外，Aβ能與糖基化終末產(chǎn)物受體、清除劑受體和絲氨酸蛋白酶抑制劑復(fù)合酶受體結(jié)合，直接或間接激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星型細(xì)胞，釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)、自由基、細(xì)胞因子等，引發(fā)腦部局部炎性反應(yīng)，造成炎癥病變[5]。本試驗(yàn)中，AlCl3和D-半乳糖處理組小鼠大腦相比空白組，其皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ1-42均顯著增加，說(shuō)明AlCl3和D-半乳糖處理確實(shí)能夠增加小鼠大腦Aβ1-42的表達(dá)量，這與此前的報(bào)道相一致。激動(dòng)素干預(yù)后Aβ1-42的表達(dá)和分布明顯減少，且顯示出劑量依賴性的特點(diǎn)。這說(shuō)明激動(dòng)素能抑制AlCl3和D-半乳糖誘導(dǎo)的Aβ1-42過(guò)量表達(dá)，其根本原因可能是激動(dòng)素抑制了鋁的神經(jīng)毒性。已有研究表明，激動(dòng)素能干擾鋁在動(dòng)物體內(nèi)的吸收，其能減慢胃腸黏膜對(duì)鋁的吸收，同時(shí)減弱尿毒癥小鼠對(duì)血漿中鋁的吸收。這是因?yàn)殇X的吸收經(jīng)由細(xì)胞旁路途徑，而旁路吸收途徑會(huì)被激動(dòng)素阻斷[17]。這可能是激動(dòng)素抑制鋁神經(jīng)毒性的可能機(jī)制之一。

綜上所述，激動(dòng)素能夠改善AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合處理造成的小鼠海馬CA3區(qū)的病理變化，同時(shí)能夠抑制AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠大腦皮層和海馬區(qū)Aβ1-42的過(guò)量表達(dá)，說(shuō)明激動(dòng)素對(duì)AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)的AD小鼠模型具有一定的正向干預(yù)作用，說(shuō)明激動(dòng)素可能具有抗AD的潛力。

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EffectsofKinetinonPathologicalLesionsandAβExpressioninBrainofADMouseModelInducedbyAlCl3andD-galactoseCombinationTreatment

LIU Dan,WEI Yun-peng,OUYANG Wu-qing

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

The aim of this study was to investigate the neuroprotective effects of kinetin on AD mouse models.The AD mouse models were prepared by AlCl3and D-galactose,and at the same time were treated with different concentrations of kinetin.The hippocampal CA3 region was observed by HE staining.Immunohistochemical staining of β amyloid protein (Aβ) in the cortex and hippocampus was also performed.The results showed that the pyramidal cells in the hippocampal CA3 region of the mice treated with AlCl3and D-galactose had a significant pathological change,but the intervention of kinetin reduced the lesion.At the same time,the distribution of Aβ1-42in cortex and hippocampus was significantly increased compared with the blank group,but that in kinetin intervention group was significantly decreased.All the results showd kinetin dose-dependent characteristics.These results indicated that kinetin has some positive effects on AD mouse models,and may has the potential to fight AD.

kinetin; AlCl3; D-galactose; pathological lesion; Aβ

2017-04-21

陜西省重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金(K332020916)

劉 丹(1992-)，女，陜西西安人，碩士研究生，主要從事激動(dòng)素藥理學(xué)研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0068-05