奶牛源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及氟苯尼考耐藥基因fexA的克隆

趙素君，曹 冶，謝 晶，于吉峰，李江凌，王秋實(shí)，廖黨金

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066)

奶牛源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及氟苯尼考耐藥基因fexA的克隆

趙素君1,2*，曹 冶1,2，謝 晶1,2，于吉峰1,2，李江凌1,2，王秋實(shí)1,2，廖黨金1,2

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066)

從100個(gè)奶牛場(chǎng)環(huán)境及膿汁樣品中分離、鑒定了9株奶牛源耐氟苯尼考金黃色葡萄球菌，分別提取質(zhì)粒DNA和基因組DNA，通過特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增氟苯尼考耐藥基因fexA，以質(zhì)粒DNA為模板的PCR分別擴(kuò)增出了1 446 bp特異性目的片段，而以基因組DNA為模板的PCR未擴(kuò)增出該目的片段。將該目的片段克隆到pET-32(a)載體上，成功構(gòu)建了pET-fexA質(zhì)粒載體，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入BL21中，藥物敏感性試驗(yàn)顯示構(gòu)建的pET-fexA/BL21基因工程菌對(duì)氯霉素和氟苯尼考高度耐藥。同時(shí)，fexA陽性金黃色葡萄球菌分離株對(duì)氯霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著高于質(zhì)控菌株，說明fexA基因貢獻(xiàn)細(xì)菌對(duì)氯霉素和氟苯尼考的交叉耐藥。成功構(gòu)建了一個(gè)基因背景清楚且對(duì)氟苯尼考耐藥的細(xì)菌模型，排除了細(xì)菌中其他氟苯尼考耐藥基因或泵出蛋白對(duì)fexA基因貢獻(xiàn)細(xì)菌耐藥的影響，為fexA基因編碼的蛋白定位研究奠定了基礎(chǔ)。

金黃色葡萄球菌；氟苯尼考；fexA基因；奶牛

近年來，我國奶牛業(yè)向規(guī)?；⒓s化方向發(fā)展，奶牛飼養(yǎng)規(guī)模逐漸擴(kuò)大。奶牛乳房炎是阻礙奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最主要的疾病之一，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是一種重要的人畜共患病病原，是奶牛乳房炎三大主要病原菌之一，同時(shí)也能危害奶牛的生產(chǎn)性能，造成子宮內(nèi)膜炎及其他疾病[1-4]。氟苯尼考是氯霉素類廣譜抗生素，由其同系物甲砜霉素分子結(jié)構(gòu)改造而來，具有更好的安全性和抗菌效果，是氯霉素和甲砜霉素的理想替代物。20世紀(jì)90年代以來氟苯尼考開始在全球范圍內(nèi)使用，因其廣譜、高效、吸收迅速、分布廣泛、安全等特點(diǎn)，成為應(yīng)用最廣泛的獸用抗生素之一，常用于獸醫(yī)臨床金黃色葡萄球菌感染的治療。但隨著用藥量的增多，耐藥性問題也日漸嚴(yán)重，一方面給臨床治療帶來困難，另一方面動(dòng)物源耐藥菌還可通過食物鏈感染人體或?qū)⒛退幓蜣D(zhuǎn)移至人體病原菌，給食品安全和人體健康帶來潛在危害，也給研究者提出了新的研究熱點(diǎn)。

目前，在葡萄球菌中已發(fā)現(xiàn)cfr和fexA2種氟苯尼考耐藥基因。2004年，Kehrenberg等[5]首次報(bào)道了從緩慢葡萄球菌的質(zhì)粒pSCFS2上克隆到一種新的耐氟苯尼考fexA基因，編碼的蛋白由475個(gè)氨基酸組成，有14個(gè)跨膜區(qū)。fexA基因是首個(gè)從革蘭陽性球菌鑒定出的編碼外排泵的基因，是E-4族成員，與其他氯霉素類藥物的外排泵基因同源性很低，可同時(shí)介導(dǎo)對(duì)氯霉素和氟苯尼考耐藥。與其他外排蛋白不同的是，在fexA基因上游存在1個(gè)類似衰減子的結(jié)構(gòu)，因此fexA基因的誘導(dǎo)表達(dá)可通過翻譯衰減來進(jìn)行調(diào)節(jié)。自該基因首次發(fā)現(xiàn)后，動(dòng)物源和人源葡萄球菌的耐氟苯尼考fexA基因相繼報(bào)道。有研究在12株葡萄球菌中檢測(cè)到fexA基因，其中有3株分別為豬源、人源、馬源金黃色葡萄球菌[6]；Argudin M A等[7]在豬、豬場(chǎng)的土壤、牛奶及肉品中的金黃色葡萄球菌中也發(fā)現(xiàn)了fexA基因。大量研究表明，除了動(dòng)物源細(xì)菌，人源的氟苯尼考耐藥菌株也不斷被發(fā)現(xiàn)[8-9]，可見氟苯尼考的耐藥性問題日益嚴(yán)重，研究其耐藥機(jī)制，對(duì)于食品安全和人類健康具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究從四川規(guī)?；膛?chǎng)的環(huán)境樣本中分離耐氟苯尼考金黃色葡萄球菌，檢測(cè)氟苯尼考耐藥基因fexA并對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析，為金黃色葡萄球菌對(duì)氟苯尼考耐藥機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)，從而更好地控制耐藥性傳播，保障養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌CVCC3055購自中國獸醫(yī)藥品檢查所中國獸醫(yī)微生物菌種保存管理中心，作為質(zhì)控菌株。大腸埃希菌JM109、BL21為動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 樣品采集 采集四川省5個(gè)不同的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境及化膿組織樣品100個(gè)。

1.1.3 主要試劑TaqDNA聚合酶，dNTPs，DL2000 DNA Marker，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ，為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，為AXYGEN公司產(chǎn)品；pET-32(a)載體，為Novagen公司產(chǎn)品；氟苯尼考、氯霉素等，為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；引物合成及核酸測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中葡萄球菌耐氟苯尼考fexA基因、金黃色葡萄球菌編碼耐熱核酸酶的nuc基因序列設(shè)計(jì)引物如下：fexA-F:5′-GATGAGCTCATGAAAAAGGATAGTAAATCTAAAG-3′(含SacⅠ酶切位點(diǎn))，fexA-R:5′-CGCGGATCCTTACCCACGCTTTTTTAAACCT-3′(含BamHⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為1446 bp；nuc-F:5′-TTAGCCAAGCCTTGACGA- AC-3′，nuc-R:5′-AGGGCAATACGCAAAGAGGT-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為480 bp。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 在無菌條件下，從養(yǎng)殖糞污及化膿組織取樣。糞污樣品先用1 mL的生理鹽水稀釋，再吸取100 μL置于滅菌的高鹽LB肉湯中，37℃培養(yǎng)10 h～12 h；用接種環(huán)挑取菌液劃線于含8 mg/L氟苯尼考的甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。將疑似葡萄球菌單菌落劃線接種于血瓊脂平板，于37℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落在血瓊脂平板上再次劃線，獲得純培養(yǎng)的菌株。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定試驗(yàn) 將菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落的大小、形態(tài)，同時(shí)革蘭染色，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)特征，并采用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(bioMerieux公司，VITEK 2 Compact System)進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3fexA基因的PCR擴(kuò)增及攜帶fexA基因的陽性菌株的鑒定 將上述分離的疑似金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒DNA和基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增目的基因fexA，以質(zhì)控菌為對(duì)照。對(duì)攜帶fexA基因的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行nuc基因的測(cè)定，來確定金黃色葡萄球菌菌株。nuc基因是耐熱核酸酶的編碼基因，為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性，因此，很多研究以nuc基因作為擴(kuò)增的靶基因[10-11]。

PCR反應(yīng)體系：10×ExTaqbuffer(含MgCl2)2.5 μL，dNTP mixture(各2.5 mmol/L)2 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，TaKaRa ExTaq(5 U/μL) 0.2 μL，滅菌雙蒸水加至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：nuc基因94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。fexA基因94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 pET-fexA質(zhì)粒的構(gòu)建及基因工程菌pET-fexA/BL21耐藥性檢測(cè) 參照pET-32(a)載體說明書進(jìn)行連接，將目的基因與pET-32(a)載體經(jīng)SacⅠ、BamHⅠ雙酶切后，用T4連接酶進(jìn)行連接。經(jīng)42℃熱激法轉(zhuǎn)入JM109中，37℃培養(yǎng)12 h～16 h，選擇白色菌落經(jīng)酶切和PCR兩種方法鑒定出陽性菌，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。pET-fexA質(zhì)粒成功構(gòu)建后，提取質(zhì)粒，經(jīng)42℃熱激法轉(zhuǎn)入BL21中，選取氨芐陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)氟苯尼考和氯霉素進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)后，通過最小抑菌濃度試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)氟苯尼考和氯霉素的敏感性。

1.2.5 分離菌最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 采用二倍瓊脂稀釋法，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推薦的方法進(jìn)行操作[12]，并參照其標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。CLSI沒有規(guī)定金黃色葡萄球菌對(duì)氟苯尼考的耐藥臨界值，參考文獻(xiàn)報(bào)道把MIC≥16 mg/L的葡萄球菌歸為耐藥菌[13]。金黃葡萄球菌CVCC3055為藥物敏感性測(cè)定質(zhì)控菌。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離與純化結(jié)果

葡萄球菌在甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基瓊脂平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤的菌落，顏色呈金黃色或淡紅色，邊緣常為淡色。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色或白色菌落，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，在菌落周圍形成溶血環(huán)，培養(yǎng)至72 h整個(gè)菌落均變?yōu)榻瘘S色。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)及生化鑒定結(jié)果

革蘭染色結(jié)果顯示為革蘭陽性球菌，經(jīng)顯微鏡觀察成葡萄串狀。經(jīng)生化鑒定儀鑒定結(jié)果為金黃色葡萄球菌。

2.3 fexA基因的PCR擴(kuò)增以及攜帶fexA基因陽性菌株的鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示(圖1和圖2)以質(zhì)粒DNA為模板的PCR分別擴(kuò)增出了1 446 bp特異性目的條帶，與預(yù)期片段大小相符；而以基因組DNA為模板的PCR未擴(kuò)增出該目的片段，對(duì)照的質(zhì)控菌均未擴(kuò)增出目的條帶。以基因組DNA為模板檢測(cè)nuc基因的特異性，分別擴(kuò)增出了480 bp目的條帶，與預(yù)期片段大小一致。DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank上序列同源性90%以上，在分子水平上證明了是金黃色葡萄球菌的耐藥菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～2.分離株質(zhì)粒DNA的PCR產(chǎn)物；3～4.分離株基因組DNA的PCR產(chǎn)物；5.質(zhì)控菌質(zhì)粒DNA的PCR產(chǎn)物；6.質(zhì)控菌基因組DNA的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR products of plasmid DNA of isolates；3-4.PCR products of genomic DNA of isolates； 5.PCR products of plasmid DNA of control strain； 6.PCR products of genomic DNA of control strain

圖1fexA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification result offexAgene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～2.分離株；3.對(duì)照株

M.DNA Marker DL 2 000 ；1-2.Isolates；3.Control strain

圖2nuc基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR amplification result of the nuc gene

2.4 pET-fexA質(zhì)粒的鑒定

fexA基因的PCR純化產(chǎn)物與pET-32(a)載體連接后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，經(jīng)PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出的DNA片段大小與目的片段大小一致，說明重組質(zhì)粒含有目的基因(圖3)。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到了約5 900 bp和1 446 bp 的兩條特異條帶，說明重組質(zhì)粒含有目的基因。與測(cè)序結(jié)果相符，表明原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fexA構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.重組質(zhì)粒pET-fexA的酶切產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒pET-fexA的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000； 1.Enzymatic digestion products of the recombinant isolates pET-fexA； 2.PCR products of the recombinant isolates pET-fexA

圖3重組質(zhì)粒pET-fexA的PCR和酶切鑒定

Fig.3 Enzyme digestion identification and PCR amplification of pET-fexAplasmid

2.5 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

pET-fexA質(zhì)粒被成功構(gòu)建后，轉(zhuǎn)入基因工程菌E.coliBL21中，菌株命名為pET-fexA/BL21。pET-fexA/BL21和BL21以及fexA陽性金黃色葡萄球菌分離株和質(zhì)控菌株分別經(jīng)0.5 μg/mL終濃度的氟苯尼考和氯霉素溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，其對(duì)氟苯尼考和氯霉素的敏感性結(jié)果見表1，pET-fexA/BL21對(duì)氯霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著增強(qiáng)，fexA陽性金黃色葡萄球菌分離株對(duì)氯霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著高于質(zhì)控菌株。

3 討論

在廣譜抗菌藥物長(zhǎng)期、廣泛和不規(guī)則使用的巨大壓力下，細(xì)菌通過基因突變和自然選擇以及耐藥基因的水平傳播等途徑，使得細(xì)菌耐藥性越來越復(fù)雜和嚴(yán)重。染色體是細(xì)菌最穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，遺傳信息可經(jīng)由親代染色體DNA的復(fù)制直接傳遞給子代，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)期處于抗菌藥物的壓力時(shí)，最終產(chǎn)生突變，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，耐藥基因也可通過多種方式整合入細(xì)菌染色體，親代獲得的耐藥性狀能夠穩(wěn)定攜帶與遺傳，從而介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的垂直傳播；細(xì)菌的質(zhì)粒是一類能夠獨(dú)立于染色體外的可以進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，其在體外通過結(jié)合轉(zhuǎn)移等方式進(jìn)入到其他細(xì)菌體內(nèi)，將耐藥基因傳遞給其他同種甚至不同種屬的藥物敏感菌，完成了細(xì)菌耐藥性的水平傳播。雖然遺傳物質(zhì)的突變?cè)诩?xì)菌耐藥中起著重要的作用，但是研究表明通過獲得耐藥基因而表現(xiàn)耐藥的方式更占主導(dǎo)。

表1 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

注：Ff.氟苯尼考；Cm.氯霉素。

Note:Ff.Florfenicol；Cm.Chloramphenicol.

近年來，研究者相繼報(bào)道了動(dòng)物源和人源葡萄球菌耐氟苯尼考fexA基因，研究顯示fexA基因多數(shù)位于質(zhì)粒上，也有少數(shù)位于染色體上的報(bào)道。Kehrenberg C等[6]在302株氯霉素耐藥的葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了12株fexA陽性菌株，既有定位在質(zhì)粒上的，也有定位在染色體上的。本研究中，從質(zhì)粒中分離到fexA基因，說明位于質(zhì)粒上的fexA基因介導(dǎo)了金黃色葡萄球菌氟苯尼考耐藥性的傳播。fexA基因的核苷酸序列分析表明，同源性非常高，這可能與其通過質(zhì)粒進(jìn)行水平傳播的方式有關(guān)。Kehrenberg C等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)該基因是新型轉(zhuǎn)座子Tn558的一部分，該轉(zhuǎn)座子位于質(zhì)粒pSCFS2中，這在一定程度上增加了fexA傳播的可能性。Kehrenberg C等通過側(cè)翼序列的分析，對(duì)12株fexA陽性菌株進(jìn)行研究，多數(shù)菌株均可以檢測(cè)到完整的Tn558的結(jié)構(gòu)存在。雖然該類型轉(zhuǎn)座子屬于非結(jié)合型轉(zhuǎn)座子，但由于攜帶fexA基因的轉(zhuǎn)座子存在于質(zhì)粒中，說明fexA基因可通過質(zhì)粒發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，在不同種屬的細(xì)菌之間很容易傳播擴(kuò)散，這樣動(dòng)物源金黃色葡萄球菌的氟苯尼考耐藥性就有可能通過接觸、動(dòng)物性食品加工等途徑傳播至人源金黃色葡萄球菌。

由于臨床上的耐藥菌株普遍攜帶多重耐藥基因，為了排除細(xì)菌中其他氟苯尼考耐藥基因或泵出蛋白對(duì)fexA基因貢獻(xiàn)細(xì)菌耐藥的影響，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了一個(gè)基因背景清楚且對(duì)氟苯尼考耐藥的細(xì)菌模型，為fexA基因編碼的蛋白定位研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Felipe V,Morgante C A,Somale P S,et al.Evaluation of the biofilm forming ability and its associated genes inStaphylococcusspecies isolates from bovine mastitis in Argentinean dairy farms[J].Microb Pathog,2017,104:278-286.

[2] Xu J,Tan X,Zhang X,et al.The diversities of staphylococcal species,virulence and antibiotic resistance genes in the subclinical mastitis milk from a single Chinese cow herd[J].Microb Pathog,2015,88:29-38.

[3] Abebe R,Hatiya H,Abera M,et al.Bovine mastitis:prevalence,risk factors and isolation ofStaphylococcusaureusin dairy herds at Hawassa milk shed,South Ethiopia[J].BMC Vet Res,2016,12(1):270.

[4] Keefe G.Update on control of Staphylococcus aureus andStreptococcusagalactiaefor management ofmastitis[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract,2012,28(2):203-216.

[5] Kehrenberg C，Schwarz S.FexA,a novelStaphylococcuslentusgene encoding resistance to florfenicol and chloramphenicol[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(2):615-618.

[6] Kehrenberg C，Schwarz S.Distribution of florfenicol resistance genesfexAandcframong chloramphenicol-resistantStaphylococcusisolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(4):1156-1163.

[7] Argudín M A,Tenhagen B A,Fetsch A,et al.Virulence and resistance determinants of GermanStaphylococcusaureusST398 isolates from nonhuman sources[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(9):3052-3060.

[8] Cui L,Wang Y,Li Y,et al.Cfr-mediated linezolid-resistance among methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from infections of humans[J].PLoS One,2013,8(2):e57096.

[9] Zhang A,Yang Y,Wang H,et al.Prevalence of sulfonamide and florfenicol resistance genes inEscherichiacoliisolated from yaks (Bosgrunniens) and herdsmen in the Tibetan pasture[J].J Wildl Dis,2015,51(3):626-633.

[10] Pinto B,Chenoll E，Aznar R.Identification and typing of food-borneStaphylococcusaureusby PCR-based techniques[J].Syst Appl Microbiol,2005,28(4):340-352.

[11] Shittu A,Lin J，Morrison D.Molecular identification and characterization of mannitol-negative methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2007,57(1):93-95.

[12] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:eighteenth informational supplement,M100-S19[S].Wayne,PA,2009.

[13] Hidalgo A,Carvajal A,García-Feliz C,et al.Antimicrobial susceptibility testing of Spanish field isolates ofBrachyspirahyodysenteriae[J].Res Vet Sci,2008,87(1):7-12.

[14] Kehrenberg C， Schwarz S.Florfenicol-chloramphenicol exporter genefexAis part of the novel transposon Tn558[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):813-815.

[15] Dai L,Wu C M,Wang M G,et al.First report of the multidrug resistance genecfrand the phenicol resistance genefexAin a Bacillus strain from swine feces[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(9):3953-3955.

IsolationandIdentificationofStaphylococcusaureusfromDairyCattleandCloningofFlorfenicolResistanceGenefexA

ZHAO Su-jun1,2,CAO Ye1,2,XIE Jing1,2,YU Ji-feng1,2,LI Jiang-ling1,2, WANG Qiu-shi1,2,LIAO Dang-jin1,2

(1.SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu,Sichuan,610066,China; 2.AnimalBreedingandGeneticskeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu,Sichuan,610066,China)

A total of 9 florfenicol-resistantStaphylococcusaureusstrains from dairy cattle were isolated and identified from the 100 dairy farm environmental samples and festering tissue samples.Plasmid DNA and genomic DNA of the 9 isolates were extracted.PCR analysis of plasmid DNA and genomic DNA with primers specific for the florfenicol resistance genefexAdemonstrated that the 1446bp amplicon was specifically detected in plasmid DNA and none in genomic DNA.The amplified fragment offexAgene was cloned into pET-32(a) vector,and a positive plasmid was obtained and named plasmid pET-fexA.The recombinant plasmids were successfully transformed intoE.coliBL21.A significant resistance to florfenicol and chloramphenicol was found in this strain.At the same time,the results of antimicrobial resistance revealed that the resistances to florfenicol and chloramphenicol of the positiveStaphylococcusaureusisolates withfexAgene fragment were significantly higher than that of quality-control strain.The research showed that thefexAgene conferred cross-resistant to florfenicol and chloramphenicol.In this study,we successfully established a florfenicol-resistant bacterial model with a clear genetic background,it ruled out the influence of other drug-resistant genes and efflux protein in bacteria on thefexAgene conferring drug-resistant bacteria,which will provide a basis for determining the localization offexAprotein.

Staphylococcusaureus; florfenicol;fexAgene; dairy cattle

2017-03-10

四川省畜牧科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(SASA2014A14)

趙素君(1977- )，女(滿族)，遼寧錦州人，副研究員，博士，主要從事分子遺傳學(xué)研究。*

S852.611

A

1007-5038(2017)12-0034-05