星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選穿山龍咀嚼片提取工藝

方芳，宋小雪，顧媛媛，郭玉巖，姚麗琴，田明*，高士平，賈永囡,鄭文韜

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

制劑工藝

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選穿山龍咀嚼片提取工藝

方芳1，宋小雪1，顧媛媛1，郭玉巖1，姚麗琴1，田明1*，高士平1，賈永囡1,鄭文韜2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選穿山龍咀嚼片提取工藝。方法：以乙醇濃度、提取時間、溶媒比為自變量，以薯蕷皂苷含量為因變量，通過對自變量各水平的多元線性回歸及二項式擬合，用效應(yīng)面法選取出最佳工藝，并進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果：確定最優(yōu)提取工藝為8倍量，80%乙醇，提取2次，每次120 min，提取預(yù)測值與理論值偏差平均值為1.4%，二項式擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)0.976 9。結(jié)論：星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選的穿山龍咀嚼片提取工藝方法簡單，精密度高，可預(yù)測性較好。

穿山龍咀嚼片；星點設(shè)計；提取工藝

穿山龍為薯蕷科蕷薯屬植物穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino)的根莖，味甘、苦，性溫，歸肝、腎、肺經(jīng)[1],主要在我國東三省、內(nèi)蒙古等地分布[2]?，F(xiàn)代已作為甾體激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的重要工業(yè)原料[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其總皂苷類成分具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、改善心血管功能、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[4-6]。本文采用星點設(shè)計效應(yīng)面法，優(yōu)選穿山龍藥材的乙醇提取條件，為穿山龍咀嚼片制劑提取工藝提供生產(chǎn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(ThermoU3000，美國Thermo公司；KQ-300V型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ⅢA鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(BC1，北京中西集團(tuán)公司)；電熱恒溫干燥箱(DNP-9052，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；電子天平(JD1000-2，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52A)。

1.2 試藥

穿山龍(哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片廠)；標(biāo)準(zhǔn)品薯蕷皂苷(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號16062，供含量測定用)；乙醇為分析純，甲醇和乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿山龍薯蕷皂苷含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性研究

色譜柱：AcclaimTM120 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以乙腈-水(55∶45)為流動相；檢測波長為203 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫：25℃；理論塔板數(shù)按薯蕷皂苷峰計算應(yīng)不低于2 000[3]。

2.1.2 對照品溶液的制備

取薯蕷皂苷對照品,精密稱定,加甲醇制成0.301 2 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量吸取上述對照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL注入液相色譜儀中，測定。以含量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為：Y=3.863 8X-0.023 1，R2=0.999 9。結(jié)果表明薯蕷皂苷含量在0.612 4 μg～4.216 8 μg的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。見圖1。

圖1 薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 穿山龍?zhí)崛」に噧?yōu)化

2.2.1 實驗方法及星點試驗設(shè)計

取穿山龍生藥30 g，按照星點試驗設(shè)計安排實驗，得到20次實驗的提取液，分別將提取液適當(dāng)濃縮，加乙醇定容于100 mL容量瓶中。精密量取1 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，濾過，定量轉(zhuǎn)移置10 mL容量瓶中，用于測定薯蕷皂苷含量。

考察因素為乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間和加醇量，因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理比較困難，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)的實際，暫固定為2次，其余因素的水平根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果而定。根據(jù)星點設(shè)計的原理，每因素設(shè)5個水平，用代碼-α、-1、0、1、α來表示。代碼值所代表的實際操作物理量見表1，實驗安排與結(jié)果見表2。

表1 穿山龍?zhí)崛」に噧?yōu)化星點試驗因素水平

表2 穿山龍?zhí)崛」に囆屈c試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 模型擬合

以薯蕷皂苷含量為因變量，運用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0以各因變量分別對自變量進(jìn)行多元線性回歸、二項式擬合，并以相關(guān)系數(shù)(r)和置信度(P)為模型判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇有較大 r 值和較優(yōu)P 值對方程進(jìn)行優(yōu)化，得多元線性回歸方程：Y=7.76+0.17X1+3.22X2+0.49X3(R2=0.877 0,P<0.000 1)；二項式方程：Y=8.90+0.17X1+3.22X2+0.49X3+0.60X1X2+0.084X1X3+0.091X2X3-0.86X12-0.34X22-0.47X32(R2=0.976 9，P<0.000 1)。多元線性回歸復(fù)相關(guān)系數(shù)較低，表示模型擬合度不高，自變量與因變量間線性相關(guān)性較差，所以不宜用線性模型，而二項式回歸方程復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，表明具體實驗因素對效應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。最后選擇多元二項式擬合模型為成功模型，實測值和預(yù)測值基本吻合，有較好的預(yù)測作用。

2.2.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測

根據(jù)優(yōu)化后的二項式方程，運用 Design-Expert 8 軟件作三維效應(yīng)面圖，見圖2～4。由效應(yīng)面圖2～4可知，選擇效應(yīng)面圖上薯蕷皂苷含量大的區(qū)域，可求得提取工藝的最佳工藝參數(shù)，即當(dāng)乙醇濃度在70%

圖2 乙醇濃度和提取時間對薯蕷皂苷含量的影響

圖3 乙醇濃度和加醇量對薯蕷皂苷含量的影響

圖4 提取時間和加醇量對薯蕷皂苷含量的影響

2.2.4 驗證試驗與結(jié)果

稱取10倍量(300 g)藥材，共3份。 按最佳工藝回流提取，分別合并提取液，取提取液的1/10濃縮定容至100 ml量瓶中，按2.2.1項下方法測定薯蕷皂苷含量。結(jié)果分別為11.945 6、11.995 8、12.035 9,驗證試驗結(jié)果與方程預(yù)測值比較，相對偏差[相對偏差=(預(yù)測值-實測值)/預(yù)測值]分別為1.7%、1.4%、1.0%，平均值約為1.4%。偏差都較小，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選的條件重復(fù)性良好，證明該工藝可靠可行。

3 討論

穿山龍藥材主要含有甾體皂苷類化合物，薯蕷皂苷屬于難溶于水的甾體化合物，也是主要有效成分，以其為測定指標(biāo)考察醇提取工藝參數(shù)，具有代表性[7-10]。本試驗采用了星點設(shè)計-效應(yīng)面法對穿山龍?zhí)崛」に囘M(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計方法簡單，試驗次數(shù)少，充分考慮到各因素的交互作用，在中心點進(jìn)行重復(fù)試驗以提高試驗精度，同時采用了二項式回歸方程，相關(guān)系數(shù)及置信度均較好，預(yù)測值與試驗真實值接近，更符合實際，節(jié)約能源，提高了效率，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，為下一步制劑成型工藝研究奠定了基礎(chǔ)。

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[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:267-268.

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OptimalExtractionProcessofDioscoreanipponicaMakinoTabletsbyCentralCompositeDesignResponseSurfaceMethod

FANG Fang1, SONG Xiao-xue1, GU Yuan-yuan1, GUO Yu-yan1, YAO Li-qin1, TIAN Ming1, GAO Shi-ping1, JIA Yong-nan1, ZHENG Wen-tao2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFiratAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To optimize the extraction process ofDioscoreanipponicaMakinotablets by central composite design response surface method(ccd-rsm). Methods: Ethanol concentration, extraction time, solvent ratio were taken as independent variables with diosgenin content as dependent variable, through multiple linear regression and binomial fitting each level of independent variables, using the response surface method to select out the best technology, and carried on the forecast analysis. Results: The optimum extraction process was 8 times of 80% ethanol, twice extraction, each time for 120min, and the average deviation between the predicted and theoretical values was 1.4%, and the binomial fitting complex correlation coefficient was 0.976 9. Conclusion: Method of ccd-rsm was used to optimize the extraction process ofDioscoreanipponicaMakinotablets, the method has the characteristic of easiness, high precision, and good predictability.

DioscoreanipponicaMakinotablets; Central composite design; Extraction process

R284.2

A

1002-2406(2017)06-0085-03

2017-07-12

2017-08-10

哈爾濱市科學(xué)技術(shù)局科技創(chuàng)新人才應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)(青年后備人才)項目(No.2016RQQXJ125)；黑龍江省博士后資助課題(No.LBH-Z16193)

方芳(1980-)，女，助理研究員，博士，博士后，主要從事中醫(yī)藥研究工作。

*通訊作者：田明(1963-)，男，教授，主要研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。