不同生長期一枝蒿中3種化學成分的含量測定

蘭冬冬，朱國強，郭雄飛，田樹革

(1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

不同生長期一枝蒿中3種化學成分的含量測定

蘭冬冬1，朱國強2，郭雄飛2，田樹革3*

(1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：建立HPLC-DAD法測定一枝蒿中一枝蒿酮酸、綠原酸、木犀草素在不同生長期的含量。方法：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm), 流動相為0.5 %冰乙酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min,10.5%～14.5% B;12～23 min,22%～26% B;29～46 min,27.5%～28.5% B)，檢測波長一枝蒿酮酸250 nm、綠原酸和木犀草素338 nm， 柱溫35℃，流速：1 mL/min。結果：一枝蒿酮酸0.306 3～4.90 μg(r=0.999 9)；綠原酸在0.1338～2.14 μg(r=0.999 4)；木犀草素在0.023 9～0.143 μg(r=0.999 1) 線性范圍內線性關系良好。平均回收率分別為95.7%(RSD=0.75%)，103.2%(RSD=1.77%)，100.7% (RSD=2.64%)。結論：該方法簡便，可靠，準確度高，能夠有效監(jiān)測一枝蒿中3種化學成分在不同生長期的含量變化，為確定合理的采收時間提供理論依據(jù)。

一枝蒿;一枝蒿酮酸;綠原酸;木犀草素

一枝蒿為菊科蒿屬苦艾組植物巖蒿ArtemisjarμpestrjsL.，維吾爾語稱為“一孜乎艾曼尼”[1]，在維吾爾醫(yī)理論指導下，通過長期臨床實踐和總結，一枝蒿清熱解毒、消食健胃、散瘀消腫、抗過敏、解蛇毒、利膽等功效顯著，主要用于感冒發(fā)燒、消化不良、腹胃脹痛、蕁麻疹、蛇蟲咬傷、肝炎等癥[2-4]。一枝蒿作為一種療效確切的藥材，隨著新疆民族藥物研究領域的開發(fā)，已被應用于臨床實踐。例如在復方一枝蒿顆粒、蒿藍感冒顆粒、復方一枝蒿眼用熏洗劑等產(chǎn)品中，也使用到一枝蒿藥材。

據(jù)文獻報道，田紅林[5]等人研究發(fā)現(xiàn)一枝蒿花、莖、葉中一枝蒿酮酸，木犀草素的含量存在差異。一枝蒿在不同生長期(5～8月)形態(tài)特征變化明顯[3,6]，不同部位(葉、莖、花)比重發(fā)生改變,各類化學成分的含量變化有待探究，此類文章卻鮮有報道。倍半萜類、苯丙素類、黃酮類是一枝蒿的主要成分[7-9]，劉勇民[10]等人從一枝蒿中分離出倍半萜類化合物一枝蒿酮酸，張素挽[11]等人從一枝蒿中分離出苯丙素類化合物綠原酸，王燕[1]等人從一枝蒿中分離出黃酮類化合物木犀草素。HPLC法分別測定一枝蒿酮酸、綠原酸、木犀草素[12-13]的技術較為成熟，本文確定一枝蒿酮酸、綠原酸、木犀草素3種成分，采用 HPLC-DAD法同時測定。本法經(jīng)濟、簡便、準確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點，測定一枝蒿在不同生長期中3種化學成分的含量，為確定合理的采收時間和控制一枝蒿藥材的質量提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

安捷倫1220型高效液相色譜儀(安捷倫科技(中國)有限公司)；AB lO4-N型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托力多儀器有限公司)；手動移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)；KQ-500DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

一枝蒿酮酸(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號20160329)，綠原酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413)，木犀草素(中國藥品生物制品檢定所，批號491-70-3)；乙腈為色譜純，水為超純水，冰乙酸，甲醇為分析純。

1.3 藥材

一枝蒿藥材采自銀朵蘭板房溝種植基地(2015年樣品屬于第一茬，2016年樣品屬于第2茬)，共7批(批號：20150515、20150618、20150705(花蕾初期)、20160513、20160608、20160705(盛花期)、20160715)。經(jīng)新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院資源教研室徐海燕副教授鑒定。

2 實驗方法及結果

2.1 供試品制備

取一枝蒿藥材粉末(過3號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取50%甲醇50 mL,稱重，超聲提取40 min(300 W，40 KHz) ,放置室溫，再稱定，用50%甲醇補足減失的重量[14]，搖勻后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾過液既得供試品，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 對照品溶液

分別精密稱取對照品一枝蒿酮酸4.90 mg、綠原酸2.14 mg和木犀草素2.15 mg,分別置入10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻后過0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾過液既得對照品，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)：流動相為0.5%冰乙酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min,10.5%～14.5%B;12～23 min,22%～26%B;29～46 min,27.5%～28.5%B)，流速：

1 mL/min;檢測波長250 nm和338 nm,柱溫35℃,進樣量10 μL,分析時間50 min，按上述色譜條件，不同檢測波長HPLC色譜圖見圖1，三種化合物對照品及樣品全波長掃描光譜圖見圖2。

圖1 不同檢測波長HPLC色譜圖 (1.綠原酸;2.木犀草素;3.一枝蒿酮酸)

圖2 3種化合物對照品及樣品全波長掃描光譜圖

2.4 標準曲線繪制

取2.2配制的一枝蒿酮酸和綠原酸對照品溶液分別稀釋1、2、4、8、16倍，木犀草素溶液稀釋15、20、30、60、90倍。按2.3項色譜條件，依次進樣10 μL，以對照品濃度X(μg/μL)為橫坐標，面積積分值Y為縱坐標，得到一枝蒿酮酸、綠原酸和木犀草素的線性回歸方程結果如表1。

表1 一枝蒿酮酸、綠原酸和木犀草素的線性考察試驗

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL(一枝蒿酮酸、綠原酸和木犀草素濃度分別為0.153 6 mg/mL、0.003 92 mg/mL、0.014 62 mg/mL),連續(xù)進樣6次，依法測定，面積積分值的平均值分別為4 082.3、960.5、471.2。RSD值分別為1.46%、1.46%、1.89%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同批次(20160705)一枝蒿藥材，按2.1項方法制備供試品溶液分別在0、2、4、8、24、48 h依法進行測定。測得供試品溶液中一枝蒿酮酸、綠原酸、木犀草素面積積分值的平均值為2741.5、487.3、228.4。RSD分別為0.66%、1.06%、1.46% ，結果表明樣品在48 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同批次(20160705)一枝蒿藥材，取6份，精密稱定1.0 g，按2.1項方法制備供試品，依法進樣測定。結果一枝蒿酮酸、綠原酸、木犀草素的面積積分值的平均值為2 734.8、492.0、230.2。RSD值為分別為1.86%、1.84%、2.70%。結果表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已測知含量的一枝蒿樣品(20160705)6份，每份0.5 g，精密稱定。分別加入一枝蒿酮酸、綠原酸，木犀草素，0.49 mg、0.196 mg、0.215 mg。按2.1項方法處理樣品，依法進樣測定。計算出一枝蒿酮酸回收率范圍(95.1%～97.1%)，綠原酸回收率范圍(99.9%～104.7%)，木犀草素回收率范圍(97.3%～103.6%) 結果見表2，表明回收率符合要求。

表2 一枝蒿酮酸、綠原酸和木犀草素加樣回收試驗

2.9 樣品測定

將采集7批不同生長期的一枝蒿樣品，分別按2.1項方法制備成供試品溶液后進樣分析，記錄一枝蒿酮酸，綠原酸，木犀草素的峰面積，以外標法計算樣品含量，一枝蒿酮酸在生長期和盛花期含量較高，綠原酸在生長期含量較高，木犀草素在花期含量較高。不同生長期樣品含量測定結果見表3。

表3 一枝蒿在不同生長期中3種化合物含量變化

注：-表示未檢測出

3 討論

3.1 單波長的選擇

本實驗采用單波長多通道檢測方法，避免單一波長檢測不同類物質帶來靈敏度差異大的問題[15]，在250 nm和338 nm波長下檢測，可得到清晰圖譜，三種物質在0.200～4.9 μg范圍內，線性關系良好。相關系數(shù)高于0.999，加樣回收率在95.7%～103.2%，RSD均小于3 %，本方法具有結果準確度可靠，快速，簡便等優(yōu)點，可用于一枝蒿中3種化合物的檢測。

3.2 不同生長期比較

本文采用HPLC法進行了一枝蒿在不同生長期中3種化合物的含量測定，結果表明，在不同生長期中3種化合物含量變化明顯，生長初期一枝蒿酮酸和綠原酸含量較高，盛花期木犀草素和一枝蒿酮酸含量較高，結合一枝蒿中各類化學成分的藥理研究[2],可用于指導一枝蒿確定最佳的采收時節(jié)，從而有效控制藥材質量和保障臨床療效。

3.3 不同采收茬次比較

根據(jù)采收記錄，采收第一茬和第二茬的一枝蒿的植株形態(tài)特征在相同月份差異明顯。實驗結果表明，不同茬次一枝蒿樣品所含一枝蒿酮酸和綠原酸的平均含量存在較大差異，這兩種差異的成因可能與采收茬數(shù)，溫度，氣候，光照等有關。

[1] 王燕,吐爾洪·阿西木,堵年生,等.新疆一枝蒿化學成分的研究[J].新疆醫(yī)科大學學報,2004,27(4):361-363.

[2] 梁永紅,譚英,孫穎.一枝蒿的藥理研究進展[J].新疆中醫(yī)藥，2005,23(2):67-68.

[3] 衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所.中國民族藥志[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1984:1-5.

[4] 阿麗艷,古麗米熱.維吾爾藥一枝蒿的應用簡介[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2004,10(4):19.

[5] 田紅林,馬英,軒轅歡,等.HPLC測定巖蒿莖、花、葉中一枝蒿酮酸、蒙花苷、木犀草素的含量[J].中藥材,2016,39(11):2566-2568.

[6] 楊衛(wèi)星.新疆常見藥用植物實用圖譜[M].烏魯木齊：新疆科學技術出版社,2006:148.

[7] 汪豪,杜慧斌,朱峰妍等.新疆一枝蒿化學成分的研究[J].中國藥科大學學報,2011,42(4):310-313.

[8] 秦子茹.一枝蒿黃酮類成分抗病毒作用的譜效關系研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學,2015.

[9] 郭姍姍,高英杰,時寧靜,等.一枝蒿總黃酮體外抗乙肝病毒作用機理的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(10):72-74.

[10] 劉勇民,于德泉．新疆一枝蒿化學成分的研究[J]．藥學學報,1985,20(7):514-518.

[11] 崔鳳俠,章宸,姜勇,等.新疆一枝蒿乙酸乙酯部位化學成分研究[J].中國中藥雜志,2013,38(11):1757-1759.

[12] 張潔,顧政一,何承輝,等.HPLC法同時測定新疆一枝蒿中木犀草素和一枝蒿酮酸的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(4):1-4.

[13] 熱依木古麗·阿布都拉,仲婕,佐艾熱·艾孜江,等.新疆一枝蒿的質量標準研究[J].醫(yī)藥導報,2011,30(9):1200-1202.

[14] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：31．

[15] 王海澍.高效液相-多通道可變波長檢測法測定雞尾酒中合成著色劑[J].中國食品添加劑,2016,27(6):190-194.

ContentsDeterminationofThreeChemicalConstituentsinArtemisiaRupestrisL.atDifferentGrowthStages

LAN Dong-dong1, ZHU Guo-qiang2, GUO Xiong-fei2, TIAN Shu-ge3

(1.SchoolofTCM,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China; 2.XinjiangChineseMedicineandEthnomedicineResearchInstitute,Urumqi830002,China; 3.CentralLaboratoryofXinjiangMedicalUnitersity,Urumqi830011,China)

Objective: To establish the HPLC-DAD method to determinate the content of Rupestonic acid, Chlorogenic acid, and Luteolin inArtemisiaRupestrisL. at different growth stages. Methods: The chromatographic column was Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) with 0.5% glacial acetic acid(A)-acetonitrile(B), gradient elution(0～10 min, 10.5%～14.5% B; 12～23 min, 22%～26%; 29～46 min, 27.5%～28.5% B). The detection wave of Rupestonic acid was about 250 nm, and Chlorogenic acid and Luteolin was about 338nm. The column temperature was 35 ℃, and the flow rate was 1 mL/min. Results: The linearity ranges of Rupestonic acid, Chlorogenic acid and Luteolin were 0.306 3～4.90 μg(r=0.999 9), 0.1338～2.14 μg(r=0.999 4), 0.023 9～0.143 μg(r=0.999 1), which showed that there was a good linear relationship. The average recoveries were 95.7%(RSD=0.75%), 103.2% (RSD=1.77%), and 100.7% (RSD=2.64%) respectively. Conclusion: This method is simple, reliable and accurate. It can effectively monitor the changes of the three chemical components inArtemisiaRupestrisL. at different growth stages, and provide the theoretical basis for determining the reasonable harvest time.

ArtemisiaRupestrisL.; Rupestonic acid; Chlorogenic acid; Luteolin

R284.1

A

1002-2392(2017)06-0024-04

2017-09-21

2017-10-15

第四次全國中藥資源普查(試點)新疆中藥民族藥資源普查專項資助(2015-2016)

蘭冬冬(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：中藥化學。

*通訊作者：田樹革(1968-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向: 中藥分析學、中藥化學。