不同發(fā)育期菘藍和毛狀根中直鐵線蓮寧B的含量變化規(guī)律研究△

譚宇萍，董宏然，楊健，唐金富*，康傳志，張瑜，黃璐琦*

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣州 510000；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700)

·中藥農業(yè)·

不同發(fā)育期菘藍和毛狀根中直鐵線蓮寧B的含量變化規(guī)律研究△

譚宇萍1，2，董宏然2，楊健2，唐金富2*，康傳志2，張瑜2，黃璐琦1，2*

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣州 510000；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700)

目的測定不同生長時期菘藍及不同懸浮培養(yǎng)時間毛狀根中抗流感病毒活性成分直鐵線蓮寧B的含量，研究其累積變化規(guī)律，為菘藍的采收和菘藍毛狀根體系評價提供參考。方法應用超高效液相色譜測定菘藍葉片、根及毛狀根中直鐵線蓮寧B的含量。結果菘藍葉片中未檢測到直鐵線蓮寧B；在整個生育期內，菘藍根中直鐵線蓮寧B動態(tài)累積變化曲線為“單峰型”，含量在生長100 d左右達到峰值后逐漸降低；毛狀根中直鐵線蓮寧B含量隨懸浮培養(yǎng)時間持續(xù)增加，在20 d達到5.40 mg·g-1，超過根中最大含量。結論整個生長周期內，菘藍和毛狀根中直鐵線蓮寧B累積變化呈一定規(guī)律性，原植物中直鐵線蓮寧 B在九月下旬產量達到最大；毛狀根在10～20 d期間直鐵線蓮寧B含量增長處于生長對數期，20 d后即超過原植物的最大含量，說明菘藍毛狀根體系是研究直鐵線蓮寧B生物合成的理想體系，也可為后續(xù)利用菘藍毛狀根體系大量制備直鐵線蓮寧B提供參考。

菘藍；毛狀根；生長期；直鐵線蓮寧B；含量

菘藍IsatisindigoticaFort.為十字花科菘藍屬兩年生草本植物。根和葉均可入藥，根入藥為板藍根，葉入藥為大青葉，具有清熱解毒，涼血利咽之功效，主治瘟疫時毒、發(fā)熱咽痛、痄腮、丹毒、癰腫，臨床常用于流行性感冒，流行性腮腺炎，急慢性肝炎，流行性乙型肝炎，帶狀皰疹等疾病的治療[1]。鐘南山教授課題組研究發(fā)現，菘藍中木脂素類化合物 7S，8R，8′R-(+)-落葉松樹脂醇-4，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即直鐵線蓮寧B (clemastanin B)，對不同亞型人流感病毒與禽流感病毒均具有顯著抑制作用[2]，可能是菘藍抗病毒活性物質基礎之一。然而，直鐵線蓮寧B在菘藍原植物中含量較低，安益強等測定了河北安國，安徽亳州等8個不同產地板藍根中直鐵線蓮寧B的含量，直鐵線蓮寧B含量最高僅為0.900 mg·g-1[3]。中藥材中活性物質含量受產地、栽培技術等因素影響，采收時間是直接影響中藥材質量的重要因素之一，基于抗病毒活性物質直鐵線蓮寧B含量來優(yōu)化菘藍采收時間，目前尚缺乏相關的研究，因此研究菘藍不同發(fā)育期直鐵線蓮寧B積累規(guī)律將有望為優(yōu)化菘藍藥材采收時間提供有價值的參考。

發(fā)根農桿菌Agrobacteriumrhizogenes中含有使植物產生毛狀根的Ri質粒，Ri質粒內Vir區(qū)基因表達產物作用于T-DNA產生T-DNA片段，并最終整合到宿主細胞基因組中產生大量毛狀根。植物毛狀根培養(yǎng)具有其生長不依賴外源植物激素、合成次生代謝物能力強且穩(wěn)定、生物轉化功能以及繁殖能力強等優(yōu)點，不僅是植物天然產物生物合成研究的理想體系，以其作為生物反應器來生產高價值天然產物的潛力，更是受到研究者廣泛關注，并已有成功的先例[4-5]。參照模式植物擬南芥，菘藍體內木脂素合成途徑已初步闡明[6]，其中香豆酸-3-羥基化酶 (liC3H) 和松脂素還原酶 (liPLR) 參與木脂素成分生物合成，過表達liC3H和過表達liPLR使菘藍毛狀根中直鐵線蓮寧B的前體落葉松脂素的含量均明顯提高[7-8]，但對直鐵線蓮寧B在菘藍毛狀根的積累情況和積累規(guī)律還未見報道。

本研究擬通過超高效液相測定不同生長期菘藍根和葉中直鐵線蓮寧B的含量，探索直鐵線蓮寧B產生規(guī)律，以期為菘藍藥材的采收提供參考依據。同時利用發(fā)根農桿菌C58C1誘導菘藍毛狀根，摸索不同懸浮培養(yǎng)時間毛狀根中直鐵線蓮寧B積累變化規(guī)律，為今后解析其生物合成途徑和合成調控研究提供平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菘藍毛狀根材料為測定生長曲線時干燥至恒重的毛狀根；菘藍自交純系，經中國中醫(yī)科學院中藥資源中心郝近大研究員鑒定為十字花科菘藍屬植物菘藍IsatisindigoticaFort.2013年于北京郊區(qū)春播，在生長至60 d后(8月13日)，每10 d取樣一次，每次取3份菘藍完整植株，記錄各組菘藍樣品的表觀數據后，將其地上與地下部分切斷，分別稱量各部分鮮重，在烘箱 90 ℃殺青 15 min后于陰涼通風處晾干，稱量干重。

1.2 儀器與試劑

超高效液相 ACQUITY UPLC I-Class (美國 Waters 公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、 EmpowerTM3 色譜工作站)，超高效液相色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm)，BAS224S 型分析天平 (Sartorius)，5810R 型冷凍離心機 (Eppendorf)。 甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司，Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins (Phyto Thechnology Laboratories)，Tryptone 、 Yeast extract (OXOID，LP0042)。

1.3 菘藍毛狀根誘導及培養(yǎng)

1.3.1 外植體的制備 挑選飽滿無破損的菘藍種子，用 75% 酒精浸泡 5 min，無菌水沖洗 4～5 次，再用 3% NaClO 溶液浸泡 10 min后無菌水沖洗 5 次，接種至 MS 固體培養(yǎng)基上，(26 ± 2) ℃ 下暗培養(yǎng) 2 d，光培養(yǎng)約 20 d，取無菌苗幼葉作為外植體。

1.3.2 發(fā)根農桿菌活化 取保存在-80 ℃發(fā)根農桿菌C58C1劃線接種在 LB 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落轉接在LB液體培養(yǎng)基中，活化2次，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD值為0.5，即可用于誘導毛狀根。

1.3.3 毛狀根的誘導和固體培養(yǎng) 農桿菌菌液浸泡過的菘藍葉片放入MS固體培養(yǎng)基里，暗培養(yǎng)2 d，轉入含400 mg·L-1Cef 的MS固體培養(yǎng)基，每10 d更換培養(yǎng)基，每次將Cef濃度降低100 mg·L-1直至獲得無菌毛狀根。

1.3.4 毛狀根的鑒定 取新鮮毛狀根 0.1 g，SDS 法提取總 DNA 作為 PCR 擴增模板。根據發(fā)根農桿菌 C58C1 菌株中RolB和RolC基因設計特異性引物：

RolB：RolB-F：CGAGGGGATCCGATTTGCTT;

RolB-R：GACGCCCTCCTCGCCTTCCT；

RolC：Rol C-F：TCGCCATGCCTCACCAACTCAC;

RolC-R：CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA;

擴增體系為 10 μL Takara Premix Ex Taq，1 μL 正向引物(5 μm·μL-1)，1 μL 反向引物 (5 μm·μL-1)，1 μL DNA模板，7 μL dd H2O.PCR 擴增條件為 94 ℃ 預變性 5 min，35 個擴增循環(huán) (94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s)，72 ℃繼續(xù)延伸5 min，1.5%瓊脂糖凝膠(EB 染色)進行電泳 (180 V/30 min)，電泳結果于凝膠成像系統(tǒng)下掃描并保存圖片。

1.3.5 菘藍毛狀根的液體懸浮培養(yǎng) 稱取經PCR鑒定為陽性且多分枝、多根毛、生長迅速的毛狀根 1.0 g至6，7 V液體培養(yǎng)基中懸浮振蕩培養(yǎng)，80 r·mim-1，25 ℃，避光。

1.3.6 毛狀根生長曲線的測定 取在6，7-V液體培養(yǎng)基中生長旺盛的菘藍毛狀根0.5 g鮮重，轉接至新的6，7-V液體培養(yǎng)基中，從繼代培養(yǎng)開始，每5 d取出毛狀根樣品，每次三瓶，取出的樣品置于烘箱中37 ℃干燥24 h至恒重后稱量其干重，并計算3份樣品的平均值，繪制0～60 d毛狀根的生長曲線。

1.4 直鐵線蓮寧B的含量測定

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：0.1% 甲酸-乙腈 (A)-0.1% 甲酸-水 (B) 12∶88；流速：0.4 mL·min-1；檢測波長225 nm，柱溫 40 ℃，進樣量 2 μL.

1.4.2 標準品溶液的制備 精密稱取2.00 mg直鐵線蓮寧B粉末(自制)于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解、定容，濃度為200 μg·mL-1，放置于4 ℃冰箱供 UPLC 分析用。

1.4.3 線性關系考察 將上述對照品溶液進一步稀釋成7個不同質量濃度的對照品溶液，按照1.4.1 項下色譜條件測定峰面積。以進樣濃度X(μg·mL-1)為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標得到回歸方程分別為：Y=3827X+6862.9，(r=0.999 7)，線性范圍1.000～100.0 μg·mL-1。

1.4.4 供試品溶液的制備 稱取菘藍葉片與根的粗粉0.500 g，精密稱定，加入5 mL 50%甲醇超聲提取兩次，每次45 min，并用50% 甲醇補足損失的量；離心取上清，殘渣用少量50% 甲醇沖洗3次，置于10 mL 棕色容量瓶中并用50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得；稱取菘藍毛狀根粉末0.050 g，精密稱定，加入1 mL 50%甲醇，用上述方法提取，并定容至2 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.4.5 精密度試驗 取100 μg·mL-1標準品溶液，進樣2 μL連續(xù)進樣5次，測得直鐵線蓮寧B的峰面積 RSD 值為0.61%，表明該儀器精密度良好。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗 取菘藍和毛狀根的同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h測定直鐵線蓮寧B的峰面積，其峰面積的RSD值分別為0.06%，0.08%，表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批次菘藍和毛狀根樣品，按照1.4.4項下方法各制備 5 份供試品溶液，測定直鐵線蓮寧B的含量，結果為菘藍和毛狀根中直鐵線蓮寧B質量分數的 RSD 值分別為1.23%，1.36%，表明該方法的重復性良好。

1.4.8 加樣回收率 精密稱取已知含量的菘藍和毛狀根樣品各5份，每份約50 mg，加入與所測成分約等量的對照品溶液，按1.4.4項下制備供試品溶液。按上述色譜條件測定，計算加樣回收率。測得菘藍，毛狀根中直鐵線蓮寧B的平均回收率分別為103.2%，100.1%，RSD分別為0.74%，1.44%.

1.4.9 含量測定 按1.4.4項下方法制備供試品溶液，再按1.4.1下相應的測定方法測定峰面積并由標準曲線計算直鐵線蓮寧B含量。

2 分析

2.1 菘藍毛狀根的鑒定

提取菘藍轉化毛狀根的基因組DNA，PCR擴增毛狀根特異RolB和RolC基因片段，結果顯示四個株系毛狀根均能擴增出與轉化菌株大小一致的片段；而以原植物的DNA為模板，擴增后無特異性條帶，說明本實驗誘導了菘藍的毛狀根，C58C1發(fā)根農桿菌中RolB和RolC兩個基因已經穩(wěn)定整合到基因組中，可以用于后續(xù)的研究。

注：M：DNA Maker；P：菌株 C58C1；1～4：不同株系菘藍毛狀根；G：菘藍；N：陰性對照圖1 菘藍毛狀根Rol B，Rol C 基因PCR檢測

2.2 不同生長時期菘藍及毛狀根生物量的變化

不同生長期菘藍根、葉及不同懸浮培養(yǎng)時間毛狀根生物量累積變化，如圖2，北京春播的菘藍，在播種后生長70 d內，菘藍葉及根生物量逐漸增長；生長70 d后，進入9月份，天氣逐漸變冷，光照強度變弱，地上葉的形態(tài)趨于穩(wěn)定，生物量積累呈現穩(wěn)定狀態(tài)，此時葉中有機物向根部轉移，根部進入快速增長期，一直持續(xù)到 10 月，根部生物量積累逐漸穩(wěn)定。懸浮培養(yǎng)毛狀根在生長50 d內，呈現“快～慢”生長模式；10～20 d處于快速增長期，10 d內生物量增長一倍，20 d后生物量呈現緩慢積累趨勢，由于培養(yǎng)基里的水分及營養(yǎng)物質不斷被消耗，50 d后，生物量開始下降，毛狀根出現死亡現象。

圖2 不同生長期菘藍根、葉及毛狀根生物量的累積變化

2.3 不同生長期菘藍根中直鐵線蓮寧B動態(tài)累積變化

不同生長期菘藍中直鐵線蓮寧動態(tài)積累變化，見圖3 (A，B) 在菘藍葉片未檢測出直鐵線蓮寧B；不同生長期根中直鐵線蓮寧B含量及產量總體均呈先升高后降低的變化趨勢，含量介于0.75～ 2.13 mg·g-1，其產量則介于30.9～87.3 mg。從種子萌芽到生長期，在葉的光合作用下，菘藍根部不斷積累直鐵線蓮寧B，在生長90 d后其含量達到峰值，為2.13 mg·g-1；生長100 d，其產量達到最高87.3 mg。生長100 d后，直鐵線蓮寧B含量急劇下降，產量也相應持續(xù)下降。

圖3 不同生長期菘藍根中直鐵線蓮寧B動態(tài)積累變化

2.4 不同懸浮培養(yǎng)時間菘藍毛狀根中直鐵線蓮寧B動態(tài)累積變化

圖4 不同懸浮培養(yǎng)時間菘藍毛狀根中直鐵線蓮寧B動態(tài)積累變化

對不同懸浮培養(yǎng)時間的菘藍毛狀根中直鐵線蓮寧B動態(tài)積累發(fā)現，懸浮培養(yǎng)菘藍毛狀根中直鐵線蓮寧B含量和產量均隨生長期持續(xù)增加，毛狀根在生長10 d內開始積累直鐵線蓮寧B，10～20 d毛狀根處于生長對數期，直鐵線蓮寧含量急速增加，從0.38 mg·g-1迅速上升至3.10 mg·g-1，產量由1.629 mg·L-1迅速增加到20.26 mg·g-1，增長率約為10倍；第60 d達到了5.40 mg·g-1，產量達47.81 mg·L-1。

3 討論

本研究考察了不同生長時期菘藍以及不同培養(yǎng)時間菘藍毛狀根中抗病毒活性物質直鐵線蓮寧B含量變化，結果發(fā)現在葉中未檢測到直鐵線蓮寧B，而根和毛狀根中均含直鐵線蓮寧B，且直鐵線蓮寧B動態(tài)積累差異顯著。氣候條件會影響中藥材質量，隨季節(jié)變換植物體內活性物質含量與生物量呈規(guī)律性變化。春播70 d后，直鐵線蓮寧B進入快速積累期，到90 d左右(9月下旬)達到最高，之后呈下降趨勢。因春播70 d后，進入秋季，晝夜差距變小，氣溫降低，夜間植物蒸騰作用減弱，有利于地上部分營養(yǎng)物質逐漸轉入根部，故根中直鐵線蓮寧B含量逐漸增加；8～9月是菘藍地下部分生長旺盛期，也是直鐵線蓮寧B合成積累關鍵時期，其合成積累在9月下旬達到最高值，之后隨氣溫逐漸降低，地上部分開始枯萎，光合強度減弱，積累呈現下降趨勢，這說明春播板藍根最佳采收期為9月底至10月初[1]。

而在菘藍毛狀根中，直鐵線蓮寧B含量隨懸浮培養(yǎng)增加不斷積累，在生長10 d內明顯增加，10 d后毛狀根進入快速生長期，直鐵線蓮寧B含量迅速增加，培養(yǎng)20 d時，已經超過了板藍根中最高含量，懸浮培養(yǎng)50 d后，毛狀根進入生長停滯期，但直鐵線蓮寧B合成累積幅度大于生物量下降幅度，其含量仍呈增長趨勢。由此可見，菘藍毛狀根能快速合成抗病毒成分直鐵線蓮寧B，生產效率高且穩(wěn)定，并呈現一定的規(guī)律性，是研究菘藍直鐵線蓮寧B生物合成的理想體系。前人研究發(fā)現，毛狀根中次生代謝物含量甚至高于原植物，如通過甘草毛狀根獲得甘草黃酮，達干重的2.042%，是未轉化甘草根的4.3倍[10]。本研究中也發(fā)現，菘藍毛狀根不僅能積累直鐵線蓮寧B，且含量穩(wěn)定，隨培養(yǎng)時間增加逐漸積累，可達板藍根其含量最高值的2.5倍，說明菘藍毛狀根同樣也具有用于生產直鐵線蓮寧B的潛力。

綜上所述，本研究通過測定抗病毒活性物質直鐵線蓮寧B的含量，不僅為菘藍藥材的采收時間提供了參考，而且推斷毛狀根體系是研究直鐵線蓮寧B生物合成的理想體系，同時也具備用于直鐵線蓮寧B生成的潛力。但本研究僅從抗病毒活性物質直鐵線蓮寧B的含量考察菘藍的毛狀根和板藍根藥材之間差異，二者在抗病毒活性上差異如何？其物質基礎是什么？這些問題仍有待于進一步研究。

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DynamicAnalysisofClemastaninBofthePlantatDifferentGrowthStagesandHairyRootsofIsatisindigotica

TAN Yuping1,2, DONG Hongran2, YANG Jian2, TANG Jinfu2*, KANG Chuanzhi2, ZHANG Yu2, HUANG Luqi1,2*

1.CollegeofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs,NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China

Objective：To investigate the changes of clemastanin B of the plant at different growth stages and hairy root ofIsatisindigotica.MethodsUltra Performance Liquid Chromatography was applied to determine the content of clemastanin B from the plant and hairy roots ofI.indigotica.ResultsClemastanin B was undetectable in the leaves ofI.indigotica，and the content of clemastanin B exhibited obvious change across different growing stages and increased with culture time in hairiry roots.The content of clesmastanin B showed a continuous increasing trend in hairy roots，reaching 5.40 mg·g-1in 20 days，which exceeding the maximum content of clemastanin B in roots，while its content was gradually decreased after reaching the peak at 100 days.ConclusionInvestigation of clemastanin B content at t different growth stages and hairy roots inI.indigoticapresent a certain law.The content of clemastanin B in the roots reached the maximum in 100 days after seeding.However，the content of clemastanin B in hairy roots were at the logarithmic phase of growth from 10 days to 20 days，even exceeding the maximum content in the roots at 20 days after seeding.From this angle，the hairy roots may provide us an ideal system to dissect the mechanism of the biosynthesis of clemastanin B and produce clemastanin B.

Isatisindigotica；hairy roots；growth stages；clemastanin B；content

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.014

國家自然科學基金青年科學基金項目(81403090)；中央本級重大增減支項目(2060302)

*

唐金富，副研究員，研究方向：菘藍有效成分的生物合成調控研究；Tel：(010)64014411-2956，E-mail：jinfutang@126.com；黃璐琦，研究員，研究方向：分子生藥學；Tel：(010)64014411-2955，E-mail：huangluqi01@126.com

2017-03-29)