CTB增強(qiáng)PsaA疫苗對肺炎鏈球菌急性中耳炎的保護(hù)作用

戴文佳 梁瓊 劉向 李雯 徐江紅

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科（上海200031）

CTB增強(qiáng)PsaA疫苗對肺炎鏈球菌急性中耳炎的保護(hù)作用

戴文佳 梁瓊 劉向 李雯 徐江紅

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科（上海200031）

目的研究以霍亂毒素B(CTB)作為PsaA蛋白疫苗黏膜佐劑經(jīng)鼻腔黏膜途徑免疫在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答能力以及對肺炎鏈球菌急性中耳炎的保護(hù)作用。方法6～8周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，分別接受PsaA蛋白免疫（PsaA組，15μgPsaA蛋白），PsaA蛋白及CTB免疫(PsaA/CTB組，15μgPsaA/4μgCTB),CTB免疫（CTB組，4μgCTB），經(jīng)鼻腔途徑免疫，相同劑量和方法每周免疫兩次，連續(xù)三周，末次免疫后兩周收集鼻腔灌洗液、中耳灌洗液及支氣管肺泡灌洗液檢測特異性IgA抗體反應(yīng)；收集血清，檢測特異性IgG、IgG1及IgG2a抗體反應(yīng)；末次免疫后2周，小鼠經(jīng)鼓膜注射14型肺炎鏈球菌，攻毒后5天組織病理學(xué)評估中耳炎癥程度。結(jié)果PsaA/CTB組鼻腔黏膜免疫獲得了較高水平的全面免疫應(yīng)答：鼻腔、中耳和支氣管肺泡灌洗液中特異性IgA抗體水平明顯高于PsaA組和CTB組（P＜0.05）；血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平明顯高于PsaA組和CTB組（P＜0.05）；攻毒后5天PsaA/CTB組中耳炎癥細(xì)胞數(shù)少于PsaA和CTB組（P＜0.05）。結(jié)論CTB是肺炎鏈球菌蛋白疫苗PsaA有效的黏膜免疫佐劑，黏膜免疫也是PsaA有效的免疫途徑，該免疫策略研究為新一代肺炎鏈球菌疫苗的設(shè)計提供了實驗基礎(chǔ)。

霍亂毒素B；肺炎鏈球菌；黏膜免疫；PsaA；急性中耳炎

急性中耳炎是耳鼻喉科常見病，多發(fā)病，尤其在兒童中發(fā)病率更高。大約有85%的兒童到三歲時至少患過一次中耳炎，40%的兒童至少患過6次急性中耳炎[1]，急性中耳炎患兒是兒童內(nèi)科醫(yī)師門診和應(yīng)用抗生素處方的主要對象，急性中耳炎不僅可能導(dǎo)致中耳積液的持續(xù)存在，形成慢性分泌性中耳炎，從而引起患兒的聽力下降[2]，也可能引起嚴(yán)重的顱內(nèi)外并發(fā)癥，需要手術(shù)干預(yù)[3]，對患兒的生活質(zhì)量造成較為嚴(yán)重的不良影響?？傊毙灾卸撞粌H影響患兒的生活質(zhì)量，也占用了一定的醫(yī)療衛(wèi)生資源，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)，從衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)和疾病預(yù)防控制角度上考慮，疫苗接種預(yù)防中耳炎可能是最佳的選擇，急性中耳炎的早期預(yù)防也將減少并發(fā)癥的發(fā)生[4]。

肺炎鏈球菌是急性中耳炎最常見病原體，20～35%的急性中耳炎是由肺炎鏈球菌引起[5]。最早的23價肺炎鏈球菌多糖疫苗對于2歲以下的兒童無效[6]。為增強(qiáng)疫苗在幼兒體內(nèi)的免疫應(yīng)答，發(fā)展了多糖蛋白結(jié)合疫苗,多糖蛋白結(jié)合疫苗雖然已經(jīng)顯示能明顯降低侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病率，但是對于黏膜感染疾病急性中耳炎的整體發(fā)病率的影響很小[7]。隨著肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的廣泛應(yīng)用，發(fā)生了越來越多的血清型漂移和急性中耳炎其他病原體感染的增加[8]。另外已經(jīng)上市的多糖蛋白結(jié)合疫苗價格昂貴，并不適合在發(fā)展中國家推廣使用。肺炎鏈球菌有90余種血清型，不斷增加偶聯(lián)的多糖種類顯然不是明智之舉，為預(yù)防各種血清型肺炎鏈球菌引起的急性中耳炎需要發(fā)展無血清型限制的新型肺炎鏈球菌疫苗。近年來，以肺炎球菌表面保守蛋白為基礎(chǔ)的無血清型限制的新型肺炎球菌疫苗成為研究熱點[9]。肺炎鏈球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesion A,PsaA)就是其中之一。PsaA免疫降低肺炎鏈球菌鼻咽部的定植已在多項實驗研究中證實，但對于急性中耳炎的保護(hù)作用研究較少[10]。我們曾以殼聚糖為PsaA蛋白黏膜輸送系統(tǒng)，已證實可以對急性中耳炎產(chǎn)生保護(hù)作用[11]。而霍亂毒素（cholera toxin，CT）是在動物實驗中證實最有效的黏膜佐劑，然而其潛在的毒性限制了其在人類的應(yīng)用，其無毒性亞型霍亂毒素B（CTB）因同樣具有強(qiáng)烈的生物學(xué)作用以及黏膜佐劑特性，已經(jīng)代替CT得到廣泛使用[12]，并且證實在人類可以使用[13]，而CTB是否可以增強(qiáng)PsaA蛋白疫苗對急性中耳炎的保護(hù)作用并無相關(guān)研究報道。因此本研究以霍亂毒素B(CTB)作為PsaA蛋白疫苗黏膜佐劑并經(jīng)鼻腔黏膜途徑免疫，研究其在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答能力以及對肺炎鏈球菌急性中耳炎的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，重16～18g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；攻毒前飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF級實驗室，攻毒后飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部生物安全2級實驗室（ABSL-2級實驗室）。

1.2 菌株及培養(yǎng)基

14型肺炎鏈球菌購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（產(chǎn)品編號：31226）；肺炎鏈球菌液體培養(yǎng)基Todd-Hewitt Broth為Sigma公司產(chǎn)品，固體培養(yǎng)基哥倫比亞血瓊脂平板為上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑

霍亂毒素B（CTB）為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgA抗體為Life Technologies公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為Yeasen公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1、IgG2a為Proteintech公司產(chǎn)品；TMB（3,3',5,5'-Tetramethyl benzidine）底物溶液購自eBioscience公司。

1.4 主要實驗儀器

Thermo Scientific Forma 310 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；Leica生物熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Zesis解剖顯微鏡（德國Zesis公司）。VICTOR3?V多標(biāo)記酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer Life and Analytical Sciences公司）。

1.5 方法

6～8周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組16只，分別接受PsaA蛋白免疫（PsaA組，15μgPsaA蛋白），PsaA蛋白及CTB免疫(PsaA/CTB組，15μgP-saA/4μgCTB)，CTB免疫（CTB組，4μgCTB），經(jīng)鼻腔途徑免疫，相同劑量和方法每周免疫兩次，連續(xù)三周。末次免疫后兩周，每組隨機(jī)取6只小鼠用于采集血清及采集支氣管肺泡灌洗液（BALF）、鼻腔灌洗液(NW)以及中耳灌洗液(MEL)，每組隨機(jī)取10只小鼠用于中耳注射肺炎鏈球菌。

動物末次免疫后兩周采用摘除眼球方法采血，分離血清，即用左手將小鼠固定，壓迫頸部并拉緊頭部皮膚，使眼球突出，將鼠倒置，用彎頭小止血鉗或鑷子迅速摘除眼球并將眼球后包膜捅破，血液極快自眼眶流出或噴出，直至達(dá)到取血量，采血約1ml，靜置，待血細(xì)胞凝固后，4000rpm/min低溫離心10min，分離血清置于-80℃凍存待測。間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中IgG、IgG1及Ig2a抗體水平，具體為以50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)包被96孔酶標(biāo)板，抗原PsaA包被濃度為0.5μg/ml，包被體積為100μl，4℃包被過夜；棄抗原包被液，加入200μl 1×PBS-T20緩沖液(1×PBS，pH7.4，0.05%Tween-20)洗滌2～3遍；加入100μl封閉液(1%BSA，l×PBS-T20)，37℃封閉lhr；棄封閉液，加入200μl 1×PBS-T20緩沖液洗滌1～2遍；血清樣品起始以1:100稀釋于樣品稀釋液(0.5%BSA，l×PBS-T20)，然后2倍倍比稀釋，各取100μl加入抗原包被過的酶標(biāo)板中，每個樣品均復(fù)孔加樣，37℃反應(yīng)2hr；棄樣品液，加入200μl 1×PBS-T20緩沖液洗滌6～7遍；將HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG以l:5000，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1和IgG2a以1：10000稀釋于樣品稀釋液，每孔各加入100μl用以檢測血清的IgG、IgG1和IgG2a抗體滴度，37℃反應(yīng)lhr；棄酶聯(lián)液，加入200μl 1×PBS-T20緩沖液洗滌6～7遍；每孔各加入100μlTMB底物溶液37℃反應(yīng)20min；每孔各加入終止液濃硫酸100μl；將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，于波長450nm測定吸光度值，記錄每只小鼠血清的最大滴度水平，再取以10為底滴度倒數(shù)的對數(shù)代表抗體水平。眼球采血后頸部脫臼處死小鼠，按文獻(xiàn)報道的方法[14]采集支氣管肺泡灌洗液、鼻腔灌洗液以及中耳灌洗液，間接ELISA法檢測灌洗液中特異性IgA抗體水平，方法同前，但BALF、NW、MEL均未稀釋，最終以測得的450nm的吸光度OD值作為特異性IgA抗體水平。

BALB/c小鼠末次免疫后兩周予氯胺酮（80mg/kg）/甲苯噻嗪（6mg/kg）腹腔注射輕度麻醉，在顯微鏡下用微量注射器經(jīng)鼓膜前下方注射14型肺炎鏈球菌，每只耳5μl（1.6×107CFU）肺炎鏈球菌，對側(cè)耳注射相同劑量的PBS，攻毒后小鼠于ABSL-2級實驗室飼養(yǎng)，由專業(yè)人員飼全價配合飼料，自由飲水?dāng)z食，每日觀察小鼠的精神狀態(tài)、顯微鏡下觀察小鼠的鼓膜情況。攻毒后5天完整取下小鼠的中耳聽泡，多聚甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣兩周，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。以Image-Pro Plus 6.0軟件分析單位面積（10000μm2）內(nèi)中耳內(nèi)炎癥細(xì)胞的數(shù)目，每組10只動物，每只動物觀察5張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個視野，取均數(shù)作為該動物的代表值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件分析數(shù)據(jù)并作統(tǒng)計圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)結(jié)果以x±SEM表示，單因素ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析后用Tukey檢驗進(jìn)行組間比較；兩組之間正態(tài)分布計量資料采用t檢驗分析差異；正態(tài)分布數(shù)據(jù)結(jié)果以柱形圖表示；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清IgG、IgG1及Ig2a抗體水平檢測

末次免疫后兩周采集血清間接ELISA法檢測PsaA特異性IgG抗體以及其亞型IgG1和Ig2a抗體水平；實驗結(jié)果表明PsaA蛋白免疫組，PsaA/CTB免疫組在血清中均誘導(dǎo)了PsaA特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體產(chǎn)生,而CTB組無特異性抗體產(chǎn)生。PsaA/CTB組和PsaA組之間的抗體水平采用t檢驗分析差異，對于總IgG抗體水平，PsaA/CTB組明顯高于PsaA蛋白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.484 P=0.032）（表1、圖1A），PsaA/CTB組的IgG1和IgG2a抗體水平也均高于PsaA蛋白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.690 P=0.004、t=2.577 P=0.028）（表1、圖1B、圖1C），本結(jié)果表明PsaA蛋白疫苗經(jīng)鼻腔途徑免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)，在CTB黏膜佐劑的作用下全身免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)。

圖1 血清IgG、IgG1及Ig2a特異性抗體水平分析(血清起始以1:100稀釋，然后倍比稀釋，縱坐標(biāo)代表每組（n=6）平均抗體滴度±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表PsaA/CTB免疫組與PsaA免疫組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05)Fig.1ELISA analysis of anti-PsaA total IgG(A)、IgG1(B)and IgG2a(C)antibody in serum.The serum was detected at 1:100 dilutions,then two-fold proportion dilutions.The data are presented mean antibody titre±standard error of six mice per group.Statistical difference between the group immunized with PsaA/CTB and that immunized with PsaA(P＜0.05)is marked with an asterisk.

2.2 黏膜灌洗液中IgA抗體水平

末次免疫后兩周取支氣管肺泡、鼻腔以及中耳灌洗液，間接ELISA檢測PasA特異性IgA抗體水平,結(jié)果表明PsaA組、PsaA/CTB組BALF、NW及MEL均有較高水平黏膜特異性IgA抗體產(chǎn)生，而CTB組抗體水平較低,單因素ANOVA分析PsaA組、PsaA/CTB組與CTB三組之間抗體水平差異，結(jié)果表明不僅MEL中PasA特異性IgA抗體水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=135.1 P＜0.0001），而且BALF、NW中特異性IgA抗體水平差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（F=165.9 P＜0.0001、F=110.1 P＜0.0001）（表2）。采用Tukey檢驗進(jìn)一步比較PsaA組與PsaA/CTB組之間抗體水平的差異，結(jié)果表明PsaA/CTB組不僅中耳灌洗液中PasA特異性IgA抗體水平明顯高于PsaA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.017）（圖2A），而且鼻腔和支氣管肺泡灌洗液中的IgA抗體水平也明顯高于PsaA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.015、P=0.003）（圖2B、圖2C）。

表1 血清PsaA特異性IgG、IgG1及Ig2a抗體水平Table 1Anti-PsaAtotal IgG、IgG1 and IgG2a antibody levels in serum

表2 黏膜PsaA特異性抗體IgA抗體水平Table 2Anti-PsaAIgAantibody levels in MEL、BALF and NW

圖2 MEL、BALF、NW特異性IgA抗體水平分析(MEL、BALF、NW未稀釋，縱坐標(biāo)代表每組6只小鼠的OD450平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表PsaA/CTB免疫組與PsaA免疫組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05)Fig.2ELISA analysis of anti-PsaA IgA antibody in MEL（A）,BALF(B)and NW(C).The NW,MEL or BALF weredetected for IgA without dilutions.The data from NW,MEL or BALF are presented as mean OD450±standard error of six mice per group.Statistical difference between the group immunized with PsaA/CTB and that immunized with PsaA(P＜0.05)is marked with an asterisk.

2.3 疫苗接種對小鼠中耳炎癥的影響

為觀察CTB作為黏膜佐劑是否可以增強(qiáng)PsaA蛋白對急性中耳炎的免疫保護(hù)作用，末次免疫后兩周經(jīng)鼓膜途徑注射14型肺炎鏈球菌，攻毒后5天進(jìn)行中耳組織病理學(xué)檢查。實驗結(jié)果表明CTB組中耳腔有較多炎性滲出，中耳黏膜明顯增厚，黏膜下炎性細(xì)胞增多，PsaA組中耳腔雖有滲出，但炎癥細(xì)胞少，黏膜增厚程度較CTB組減輕，PsaA/CTB組中耳基本無滲出，黏膜雖有增厚，但炎癥細(xì)胞明顯減少，單因素ANOVA分析三組之間的中耳炎癥細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.53P＜0.0001）。采用Tukey檢驗進(jìn)一步比較PsaA組與PsaA/CTB組之間中耳炎癥細(xì)胞數(shù)，結(jié)果示PsaA/CTB組炎癥程度明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010）（圖3）。

圖3 中耳攻毒后炎癥反應(yīng)分析(HE染色；紅色箭頭示中耳黏膜×200；*代表PsaA免疫組與PsaA/CTB免疫組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05)Fig.3Analysis of inflammatory responses after middle ear challenge with pneumococcus.(H&E staining;red arrow represents middle ear mucosa;original magnification:×200;bar=100μm;Statistical difference between the group immunized with PsaA/CTB and that immunized with PsaA(P＜0.05)is marked with an asterisk.)

3 討論

黏膜是肺炎鏈球菌進(jìn)入機(jī)體的第一道屏障，黏膜免疫不同于全身免疫，黏膜免疫系統(tǒng)可以刺激產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答和全身免疫應(yīng)答，黏膜免疫也是誘導(dǎo)局部產(chǎn)生長時期免疫記憶的最為有效途徑，另外還可避免針劑的疼痛、減少注射局部的炎癥反應(yīng)、易于重復(fù)接種、可模擬病原體感染途徑及可誘導(dǎo)局部IgA的生成和各種系統(tǒng)性B、T細(xì)胞效應(yīng)等,這些優(yōu)點使得黏膜免疫成為臨床免疫研究關(guān)注的重要免疫途徑。但是由于絕大多數(shù)黏膜免疫疫苗是非復(fù)制性抗原只有在大量和反復(fù)接種后才可引起免疫應(yīng)答,而且黏膜吸收少，抗原性差，需要適合的黏膜免疫佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。CTB已經(jīng)被證實是強(qiáng)有力的黏膜免疫佐劑，可以增強(qiáng)黏膜免疫抗原的局部的抗體反應(yīng)和免疫保護(hù)性。CTB發(fā)揮佐劑作用主要通過兩方面，一是可以作為抗原分子的有效載體，促進(jìn)抗原的吸收，更重要的是還可以上調(diào)抗原遞呈細(xì)胞表面共刺激分子，從而增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)。因此，在本研究中采用CTB作為PsaA疫苗的黏膜佐劑。

急性中耳炎是通過黏膜途徑引起的感染，黏膜免疫對急性中耳炎的預(yù)防更有效。目前已有的肺炎鏈球菌疫苗之所以對急性中耳炎的保護(hù)作用有限，原因之一可能是采用了非黏膜免疫途徑，并不能產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答，而局部的分泌性IgA抗體對于黏膜感染有重要的保護(hù)作用[15]。正常中耳黏膜免疫活性細(xì)胞較少[16]，但是在急性或慢性炎癥時可募集大量的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞至中耳黏膜[17]；在一項用血藍(lán)蛋白免疫小鼠檢測中耳黏膜免疫細(xì)胞清況的研究中發(fā)現(xiàn)中耳黏膜中有較多T輔助細(xì)胞、B細(xì)胞等[18]；Suenaga分析了正常小鼠的中耳黏膜，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞是中耳黏膜的主要淋巴細(xì)胞，而且在免疫后中耳黏膜淋巴細(xì)胞具有分泌特異性IgA的能力[19]；Kodama等對小鼠中耳黏膜、鼻黏膜及鼻相關(guān)淋巴組織（NALT）免疫細(xì)胞組成的分析研究發(fā)現(xiàn)：中耳黏膜和鼻黏膜不同于NALT，中耳和鼻腔黏膜就是黏膜免疫的效應(yīng)部位，而NALT是免疫的誘發(fā)部位[20]。這些研究均表明中耳黏膜在適宜的抗原刺激后可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。我們的研究結(jié)果表明PsaA蛋白在CTB佐劑的作用下鼻腔免疫后不僅在鼻腔、支氣管肺泡等常見黏膜部位產(chǎn)生了PsaA特異性IgA抗體，在中耳也產(chǎn)生了特異性IgA抗體，而且抗體水平明顯高于PsaA組（P＜0.05），不僅證實了中耳黏膜在PsaA抗原的刺激下引起了特異性黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，也證實CTB可增強(qiáng)PsaA的局部黏膜免疫反應(yīng)。肺炎鏈球菌不僅是急性中耳炎的重要病原體，也是引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等侵襲性疾病的重要病原體，因此對于肺炎鏈球菌疾病的預(yù)防不僅需要局部的黏膜免疫反應(yīng)，也需要全身免疫應(yīng)答。血清特異性IgG抗體與預(yù)防肺炎鏈球菌的侵襲性感染密切相關(guān)。在本研究中我們采用經(jīng)鼻腔途徑免疫，結(jié)果表明在CTB佐劑作用下血清中PsaA特異性IgG抗體以及其亞型IgG1和IgG2a抗體水平均較PsaA組明顯增高（P＜0.05），證實了全身免疫應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生。

在本研究中我們證實了在CTB佐劑的作用下PsaA抗原通過黏膜途徑免疫誘發(fā)了較高水平的系統(tǒng)和黏膜局部免疫反應(yīng)，CTB增強(qiáng)了PsaA的免疫原性。為進(jìn)一步評估疫苗預(yù)防中耳炎的有效性，本研究在疫苗免疫后兩周，通過中耳鼓膜途徑注射肺炎鏈球菌，因小鼠中耳容積僅5～6l，因此小鼠在麻醉后顯微鏡下注射5l體積的肺炎鏈球菌，實驗中無一只小鼠死于麻醉及操作。肺炎鏈球菌急性中耳炎的誘發(fā)不僅與動物種類有關(guān)，還與細(xì)菌的血清型、數(shù)量及感染途徑有關(guān)。肺炎鏈球菌有91種血清型，不同血清型的細(xì)菌致病力不同，有研究證實目前全球最常見的引起急性中耳炎的血清型是3,6A,6B,9V,14,19A,19F及23F[21]。本項實驗中采用引起急性中耳炎常見的14型肺炎鏈球菌進(jìn)行中耳攻毒，實驗中無一只小鼠死于全身感染，小鼠均無菌血癥發(fā)生。評價炎癥程度最常用的指標(biāo)之一是中耳浸潤炎癥細(xì)胞的數(shù)量。因此我們計算了不同免疫組小鼠中耳炎癥細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明PsaA/CTB組的炎癥細(xì)胞數(shù)明顯少于PsaA組（P＜0.05），PsaA組的炎癥細(xì)胞數(shù)明顯少于CTB組（P＜0.05），提示PsaA/CTB組的炎癥反應(yīng)最輕，證實了PsaA經(jīng)鼻腔途徑免疫可以對急性中耳炎產(chǎn)生保護(hù)作用，CTB明顯增強(qiáng)免疫保護(hù)性。

綜上所述，本研究證實了CTB增強(qiáng)了PsaA蛋白的免疫原性以及對急性中耳炎的保護(hù)作用，是PsaA蛋白有效的黏膜免疫佐劑。鼻腔黏膜免疫可能是預(yù)防肺炎鏈球菌急性中耳炎的最佳免疫策略。

1Rovers MM,Schilder AG,Zielhuis GA,et al.Otitis Media[J].Lancet,2004,363(9407):465-473.

2高帆,蔣子棟.兒童SOM病因?qū)W研究進(jìn)展[J].中華耳科學(xué)雜志.2013,11(4):613-616.Gao F,Jiang ZD.Advances in SOM Etiology in Children[J].Chinese Journal of Otology,2013,11(4):613-616.

3夏忠芳.兒童中耳炎手術(shù)治療的進(jìn)展及策略[J].中華耳科學(xué)雜志.2013,11(4):617-620.Xia ZY.Progress and Strategy of Surgical Treatment for Otitis Media in Children[J].Chinese Journal of Otology,2013,11(4):617-620.

4Dagan R,Pelton S,Bakaletz L,et al.Prevention of Early Episodes of Otitis Media by Pneumococcal Vaccines Might Reduce Progression to Complex Disease[J].Lancet Infect Dis,2016,16:480-492.

5Yamanaka N,Hotomi M,Billal DS.Clinical Bacteriology and Immunology in Acute Otitis Media in Children[J].J Infect Chemother,2008,14(3):180-187.

6Daniels CC,Rogers PD,Shelton CM.A Review of Pneumococcal Vaccines:Current Polysaccharide Vaccine Recommendations and Future Protein Antigens[J].J Pediatr Pharmacol Ther,2016,21(1):27-35.

7Le Saux N.Pneumococcal Conjugate Vaccines for Preventing Otitis Media[J].Paediatr Child Health,2016,21(2):89-90.

8Weinberger DM,Malley R,Lipsitch M.Serotype Replacement in Disease Following Pneumococcal Vaccination[J].The Lancet,2011,378(9807):1962-1973.

9Ginsburg AS,Nahm MH,Khambaty FM,et al.Issues and Challenges in the Development of Pneumococcal Protein Vaccines[J].Expert Review of Vaccines,2014,11(3):279-285.

10Rajam G,Anderton JM,Carlone GM,et al.Pneumococcal Surface Adhesin A(PsaA):A Review[J].Critical Reviews in Microbiology,2008,34(3-4):131-142.

11Xu JH,Dai WJ,Chen B,et al.Mucosal Immunization with PsaA Protein,Using Chitosan as a Delivery System,Increases Protection Against Acute Otitis Media and Invasive Infection by Streptococcus Pneumoniae[J].Scand J Immumol,2015,81(3):177-185.

12Ji X,Ren Z,Xu N,et al.Intranasal Immunization with Influenza Virus-Like Particles Containing Membrane-Anchored Cholera Toxin B or Ricin Toxin B Enhances Adaptive Immune Responses and Protection Against an Antigenically Distinct Virus[J].Viruses,2016,8(4):115.

13Holmgren J,Harandi AM,Czerkinsky C.Mucosal Adjuvants and Anti-infection and Anti-immunopathology Vaccines Based on Cholera Toxin,Cholera Toxin B Subunit and CpG DNA[J].Expert Rev Vaccines,2003,2(2):205-217.

14Xu JH,Dai WJ,Wang ZM,et al.Intranasal Vaccination with Chitosan-DNA Nanoparticles Expressing Pneumococcal Surface Antigen A Protects Mice Against Nasopharyngeal Colonization by Streptococcus Pneumoniae[J].Clin Vaccine Immunol,2011,18(1):75-81.

15Rosch JW,Iverson AR,Humann J,et al.A Live-attenuated Pneumococcal Vaccine Elicits CD4+T-cell Dependent Class Switching and Provides Serotype Independent Protection Against Acute Otitis Media[J].Embo Mol Med,2014,6(1):141-154.

16Ichimiya I,Kawauchi H,Mogi G.Analysis of Immunocompetent Cells in the Middle Ear Mucosa[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1990,116(3):324-330.

17Jecker P,Pabst R,Westermann J.Proliferating Macrophages,Dendritic cells,Natural killer Cells,T and B Lymphocytes in the Middle Ear and Eustachian Tube Mucosa during Experimental Acute Otitis Media in the Rat[J].Clin Exp Immunol,2001,126(3):421-425.

18Takahashi M,Kanai N,Watanabe A,et al.Lymphocyte Subsets in Immune-mediated Otitis Media with Effusion[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1992,249(1):24-27.

19Suenaga S,Kodama S,Ueyama S,et al.Mucosal Immunity of the Middle Ear:Analysis at the Single Cell Level[J].Laryngoscope,2001,111(2):290-296.

20Kodama S,Hirano T,Suenaga S,et al.Eustachian Tube Possesses Immunological Characteristics as a Mucosal Effector Site and Responds to P6 Outer Membrane Protein of Nontypeable Haemophilus Influenzae[J].Vaccine,2006,24(7):1016-1027.

21Rodgers GL,Arguedas A,Cohen R,et al.Global Serotype Distribution among Streptococcus Pneumoniae Isolates Causing Otitis Media in Children:Potential Implications for Pneumococcal Conjugate Vaccines[J].Vaccine,2009,27(29):3802-3810.

Intranasal Immunization with PsaA/CTB Enhances Adaptive Immune Responses and Protection against PneumococcalAcute Otitis Media

Dai Wenjia,Liang Qiong,Liu Xiang,Li Wen,Xu Jianghong
Department of Otolaryngology,Eye Ear Nose&Throat Hospital of Fudan University,Shanghai 200031,China
Corresponding author:Xu JianghongEmail:15921826606@139.com

ObjectiveTo study specific immune responses and protective effects against pneumococcal acute otitis media in BALB/c mice immunized intranasally with PsaA protein vaccine and cholera toxin B(CTB)as a mucosal adjuvant.MethodsBALB/c mice aged 6 to 8 weeks old were randomly divided into 3 groups and were respectively immunized intranasally with PsaA protein(PsaA group,15μg PsaA protein),PsaA protein and CTB immunization(PsaA/CTB group,15μg PsaA/4μg CTB),or CTB(CTB group,4μg CTB)at the same dose two times weekly for three weeks.Two weeks after the last immunization,nasal lavage fluid(NW),middle ear lavage fluid(MEL)and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected for detection of specific IgA antibody.Serum was collected for detection of specific IgG,IgG1 and IgG2a antibodies.Mice were challenged with type 14 streptococcus pneumoniae by the tympanic membrane route.Middle ear inflammation was evaluated by histopathology 5 days after challenging.ResultsCompared to mice immunized with PsaA or CTB,anti-PsaA specific IgA in mucosal lavages were elevated significantly in mice immunized with PsaA/CTB(P＜0.05);and specific IgG,IgG1 and IgG2a antibody levels in serum with PsaA/CTB immunization were also significantly higher(P＜0.05).Significantly more inflammatory cells in the middle ear cavity were found in PsaA or CTB groups than in the PsaA/CTB group on day 5 after pneumococcal challenge(P＜0.05).Conclu-sionsMucosal immunization with PsaA/CTB is efficacious in generating mucosal and systemic immune responses and in protecting against acute otitis media.CTB is an effective mucosal immune adjuvant for PsaA.The study provides an experimental basis for designinh a new generation of pneumococcal vaccine.

Cholera toxin B;Streptocoocus pneumoniae;Mucosal immunity;PsaA;Acute otitis media

Conflicts of Interest:The authors have declared that no conflicts of interest exist.

R764

A

1672-2922（2017）05-561-6

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.012.

戴文佳，研究生，主治醫(yī)師，研究方向:中耳炎黏膜免疫及機(jī)制研究

徐江紅，Email:15921826606@139.com

Funding program:National Natural Science Foundation(No.81200736，No.81000406)

2017-03-14審核人：韓月臣）