紫五加根莖中總黃酮含量的測(cè)定

胡棟寶+黃太聚+李瀟雨

摘要：以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算紫五加（Acanthopanacis senticosi Radix）根莖中總黃酮的含量。結(jié)果表明，在4～28 μg/mL的范圍內(nèi)，蘆丁含量與吸光度有良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率為100.25%（n=4，RSD=0.92%），紫五加根莖提取液中總黃酮平均含量29.62 μg/mL。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可作為紫五加根莖中總黃酮含量的測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：紫五加（Acanthopanacis senticosi Radix）；紫外分光光度法；總黃酮；含量

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.32；O949.763.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）22-4341-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.033

Abstract： Rutin was used as control， the absorbance was determined at the wavelength of 420 nm by UV spectrophotometry， and the content of total flavonoids in roots of Acanthopanacis senticosi Radix was calculated. The results showed that at 4～28 μg/mL，there was a good linear relationship between rutin content and absorbance，the recovery rate was 100.25%（n=4，RSD=0.92%），the average content of total flavonoids in stems of Acanthopanacis senticosi Radix is 29.62 μg/mL. This method is simple，rapid，accurate and can be used as a method for the determination of total flavonoids in roots of Acanthopanacis senticosi Radix.

Key words： Acanthopanacis senticosi Radix； UV spectrophotometry； total flavonoids； content

紫五加（Acanthopanax senticosi Radix），隸屬五加科，生長(zhǎng)于灌木叢中，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)人工栽培，莖桿為淺紫色，果實(shí)呈球狀，有特異香氣[1]。紫五加在云南省墨江縣成為了特有的特色生態(tài)蔬菜。紫五加具有生津止渴、提高睡眠質(zhì)量、消除精神疲勞等功效，被譽(yù)為“睡眠專(zhuān)家”和“血管清道夫”。

黃酮類(lèi)化合物是具有酮式結(jié)構(gòu)的一類(lèi)化合物，主要有抗氧化、抗腫瘤、抗微生物和除味等功能，對(duì)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。黃酮類(lèi)化合物大多不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，其分子中大多含有酚羥基而使該化合物呈酸性，因此易溶于稀堿性水溶液、吡啶及二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑[2]。黃酮類(lèi)化合物可發(fā)生氫氧化鈉反應(yīng)、鋁鹽反應(yīng)、濃硫酸反應(yīng)、濃氨水反應(yīng)、鐵離子反應(yīng)、鹽酸-鋅粉反應(yīng)，因此，可將該類(lèi)反應(yīng)用于鑒定黃酮類(lèi)化合物[3]。目前國(guó)內(nèi)提取黃酮的方法主要有索氏提取法、超聲波浸提法、微波提取法、加熱回流法、溶劑萃取等方法。

本研究以墨江縣紫五加為研究對(duì)象，采用紫外分光光度法測(cè)定紫五加根莖中總黃酮含量，將為該種生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 所用樣品采自云南省普洱市墨江縣，經(jīng)墨江縣農(nóng)經(jīng)站農(nóng)藝師許忠鑒定為紫五加，樣品保存于玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院植化室。

1.1.2 儀器和試劑

1）儀器。索氏提取器、可調(diào)控溫電熱套、電子分析天平、UV-2550型紫外分光光度計(jì)。

2）試劑。116 μg/mL蘆丁試劑，精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品5.8 mg（已于105 ℃恒重），用40%乙醇溶解，并定容至50 mL[4]；0.1 moL/L三氯化鋁溶液，取結(jié)晶三氯化鋁2.46 g于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，備用；1.0 moL/L醋酸鈉溶液，取無(wú)水醋酸鈉8.20 g于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，備用。

1.2 方法

1.2.1 紫五加根莖中總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理后的紫五加根莖粉末1 g，用濾紙包裹后放入索氏提取器中，加入100 mL 40%的乙醇溶液回流提取，直到顏色變得較淺為止，用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中（反復(fù)洗滌圓底燒瓶及濾紙包）備用。

1.2.2 最大波長(zhǎng)的選取 準(zhǔn)確移取116 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于25 mL比色管中，分別加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL、1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻放置40 min，在200～800 nm處測(cè)定吸光度，以試劑空白做參比，將最大吸收峰作為最佳測(cè)定波長(zhǎng)，以該波長(zhǎng)作為試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL比色管中，按表1加試劑，用40%乙醇溶液定容、混勻，靜置40 min，于420 mm處測(cè)定吸光度，用試劑空白做參比在最大波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定其吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1）提取濃度的選擇。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g經(jīng)預(yù)處理后的紫五加莖粉末，用濾紙包好后放入索氏提取器的提取筒中，用濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液100 mL回流提取2 h，將提取液移至100 mL的容量瓶中定容，移取同一的樣品液15.00 mL于25 mL的3支比色管中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL；加入1.0 mol/L醋酸鈉溶液5 mL， 用不同濃度的乙醇定容、搖勻，放置40 min。以試劑空白作參比，在420 nm處測(cè)定其吸光度。

2）提取時(shí)間的選擇。稱(chēng)取1 g經(jīng)預(yù)處理后的紫五加莖粉末，在索氏提取器中放入已經(jīng)用濾紙包裹好的紫五加莖粉末，加入40%乙醇溶液100 mL分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 6組樣品，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶并定容，準(zhǔn)確移取1 mL樣品溶液于3支25 mL比色管中，分別加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL；加入1.0 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，定容并混勻，放置40 min。測(cè)定吸光度并用試劑空白作參比。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大波長(zhǎng)的選取

由圖1所示，在400～460 nm范圍內(nèi)，吸光度先隨波長(zhǎng)的增加而增加，到420 nm后開(kāi)始下降，而在420 nm處的吸收峰為最大值，因此選用420 nm為最大吸收波長(zhǎng)[6]。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖2可知，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線方程為y=0.022 4x-0.003 4，R2=0.999 7，（y為吸光度，x為蘆丁濃度）。蘆丁濃度在4～28 μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取濃度的選擇 由圖3可以看出，在其他條件保持不變的情況下，紫五加根莖中的總黃酮含量隨著乙醇濃度的升高而升高，而當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值，隨后總黃酮的含量逐漸降低，可能是隨著乙醇濃度的增大，有些醇溶性雜質(zhì)也會(huì)隨之增加，從而影響了總黃酮的析出，因此，乙醇濃度選擇40%較好。

2.3.2 提取時(shí)間的選擇 由圖4可以看出，在其他條件保持不變的情況下，紫五加根莖中總黃酮含量隨著時(shí)間的增大而增大，2 h時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值，隨后總黃酮含量逐漸降低，時(shí)間越長(zhǎng)越不利于總黃酮提取，因此，提取時(shí)間選擇為2 h較好。

2.4 樣品中總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g經(jīng)預(yù)處理后的紫五加根莖粉末，用濾紙包好后放入索氏提取器中，用濃度為 40%乙醇溶液提取2 h，將提取液定容至100 mL，分別移取15.00 mL于4支25 mL比色管中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL、1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容，搖勻放置40 min。以試劑空白作參比，在420 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品中的總黃酮含量[7]，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取已提取好的樣品溶液10 mL于25 mL比色管中，并加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL、 1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容，搖勻放置40 min。以試劑空白作參比，在420 nm處測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)5次[8]，測(cè)得吸光度并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知總黃酮含量的紫五加根莖粉末約1 g，置于磨口錐形瓶中分別加入1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，按前面樣品處理法提取，計(jì)算總黃酮含量和回收率，平均回收率為100.25%，RSD=0.92%，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 小結(jié)

紫五加根莖中總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度為40%、提取時(shí)間2 h，并通過(guò)以蘆丁為基準(zhǔn)物，用氯化鋁-醋酸鈉為顯色劑在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸線方程y=0.022 4x-0.003 4，R2=0.999 7，計(jì)算出紫五加根莖提取液中總黃酮的平均含量為29.62 μg/mL。

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