松材線蟲和擬松材線蟲繁殖能力差異研究

徐紅梅+王義勛+王勇

摘要：松材線蟲作為外來入侵種，逐步取代擬松材線蟲占據(jù)生態(tài)位。初步研究表明這可能與兩種線蟲的繁殖能力差異關(guān)系密切。本研究采取了兩種方法，即離體條件競爭試驗(yàn)和體內(nèi)競爭試驗(yàn)比較二者繁殖力。結(jié)果表明，松材線蟲的繁殖水平明顯高于擬松材線蟲。松材線蟲和擬松材線蟲混合物長時(shí)間培養(yǎng)后，松材線蟲逐步競爭淘汰擬松材線蟲。除此以外，離體培養(yǎng)和體內(nèi)競爭結(jié)果均表明，競爭條件下松材線蟲的繁殖力高于非競爭條件。

關(guān)鍵詞：松材線蟲；擬松材線蟲；繁殖能力

中圖分類號(hào)：S732文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2017）05-0027-04Study on the Difference of Offspring Fecundity Between

Bursaphelenchus xylophilus and B.mucronatus Xu Hongmei（1）Wang Yixun（1）Wang Yong（2）

（1.Hubei Forestry AcademyWuhan430075；2.Yingshan County the stataowned forest form WujiashianHuanggang438700）

Abstract： As an alian species Bursaphelenchus xylophilus replaced B.mucronatus gradually.Prelimemary study suggested their fecundity difference was the reason behind. The fecundity of their offspring under competitive and noncompetitive condition was compared. B. xylophilus showed stronger fecundity than B.mucronatus. The mixture of B. xylophilus and B.mucronatus was cultured for a long time， B.xylophilus replaced B.mucronatus gradully.The fecundity of B. xylophilus under competitive condition was stronger than under noncompetitive condition.

Key words：Bursaphelenchus xylophilus；B.mucronatus；fecundity

外來入侵種對(duì)當(dāng)?shù)厣锒鄻有杂袊?yán)重的不良影響，尤其是對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)相同生態(tài)位的當(dāng)?shù)胤N。松材線蟲病在原產(chǎn)地北美地區(qū)并未對(duì)當(dāng)?shù)厮闪仲Y源造成嚴(yán)重危害，但傳入日本、中國等亞洲國家后擴(kuò)展蔓延迅速且形成了嚴(yán)重破壞[13]。擬松材線蟲原產(chǎn)地為歐亞地區(qū)，在北半球分布極其廣泛，包括：中國、芬蘭、法國、德國、日本、韓國、俄羅斯和瑞典。擬松材線蟲在許多地區(qū)并未對(duì)松林造成嚴(yán)重危害[4]。

黑松體內(nèi)同時(shí)接種無致病力擬松材線蟲和致病性松材線蟲與單獨(dú)接種致病性松材線蟲相比，黑松枯萎速度和死亡率都降低，這表明土著種擬松材線蟲對(duì)外來種松材線蟲入侵有一定程度的抑制作用。但是隨著松材線蟲病不斷擴(kuò)展，外來種松材線蟲逐步取代擬松材線蟲占據(jù)生態(tài)位優(yōu)勢[5]。目前關(guān)于外來入侵種松材線蟲競爭取代本地土著種擬松材線蟲的機(jī)制仍然不清楚，初步研究表明可能與兩種線蟲的繁殖能力差異關(guān)系密切。

為了研究外來入侵種松材線蟲競爭取代本地姊妹種擬松材線蟲機(jī)制，本研究采取了兩種方法研究二者繁殖能力差異：離體條件競爭試驗(yàn)，即在真菌培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2種線蟲和單獨(dú)培養(yǎng)2種線蟲，然后比較二者繁殖能力；體內(nèi)競爭試驗(yàn)，2種線蟲共同接種到感病寄主上和單獨(dú)接種到感病寄主上比較二者繁殖能力。

1供試材料與方法

1.1供試線蟲來源

蟲株來源及編號(hào)見表1。各蟲株都經(jīng)過形態(tài)學(xué)和特異引物擴(kuò)增詳細(xì)鑒定，在分類上確認(rèn)無誤。

1.3供試線蟲培養(yǎng)

超凈工作臺(tái)上用無菌鑷子將保存在冰箱的線蟲轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA平板-灰葡萄孢上培養(yǎng)，3～5 d后待菌絲被線蟲取食完畢放置冰箱備用。將培養(yǎng)好的線蟲用無菌水洗出，在10×體視鏡下用移液槍挑取線蟲。

湖北林業(yè)科技第46卷第5期徐紅梅，等：松材線蟲和擬松材線蟲繁殖能力差異研究1.4線蟲數(shù)量檢測

無菌水洗出線蟲后，將線蟲液稀釋至10 mL，充分搖勻后用微量移液器吸取025 mL放置在凹玻片上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)液滴中的線蟲數(shù)量，重復(fù)4次，根據(jù)平均值計(jì)算10 mL分離液線蟲的數(shù)量。

1.5離體條件競爭試驗(yàn)

為了確定松材線蟲和擬松材線蟲在離體條件下的競爭力，在真菌培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2種線蟲和單獨(dú)培養(yǎng)2種線蟲，然后比較二者繁殖能力。本研究采用中國馬鞍山松材線蟲（MASBx）和法國擬松材線蟲（FrBm）兩個(gè)蟲株開展試驗(yàn)，每個(gè)培養(yǎng)組合重復(fù)5次。

1.5.1兩種線蟲混合培養(yǎng)

從培養(yǎng)好的線蟲液中挑取50頭松材線蟲與50頭擬松材線蟲（雌雄比為1∶1）放置在長滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)。10 d后，無菌水洗出各培養(yǎng)皿的線蟲，顯微鏡下檢查并計(jì)算出線蟲總數(shù)、雌蟲數(shù)量、雄蟲數(shù)量和幼蟲數(shù)量。

為了觀察松材線蟲和擬松材線蟲的種間競爭長期效果，對(duì)混合培養(yǎng)組合進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，用50 mL無菌水洗出每個(gè)培養(yǎng)皿中的線蟲得到線蟲懸浮液。懸浮液充分混勻后，用100 μL移液槍吸取50 μL線蟲懸浮液至新的灰葡萄孢平板上。10 d后重復(fù)以上步驟2次直至培養(yǎng)至4代（總共約40 d）。繼代培養(yǎng)過程中在顯微鏡下檢查并計(jì)算每一代線蟲總數(shù)、雌蟲數(shù)量、雄蟲數(shù)量和幼蟲數(shù)量。endprint

1.5.2兩種線蟲單獨(dú)培養(yǎng)

從培養(yǎng)好的線蟲液中挑取100頭松材線蟲與擬松材線蟲（雌雄比為1∶1）分別放置在長滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)。10 d后，無菌水洗出各培養(yǎng)皿的線蟲，顯微鏡下檢查并計(jì)算出線蟲總數(shù)、雌蟲數(shù)量、雄蟲數(shù)量和幼蟲數(shù)量。

1.6寄主體內(nèi)競爭試驗(yàn)

為了確定松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物體內(nèi)的競爭力，將兩種線蟲單獨(dú)和混合接種到感病寄主植物體內(nèi)觀察二者之間的競爭情況。本研究采用中國浙江松材線蟲（ZJBx）和中國擬松材線蟲（CBm）兩個(gè)蟲株開展試驗(yàn)。感病寄主植物選用2年生馬尾松幼苗體。接種采用皮接法：用無菌解剖刀片在2 a生馬尾松苗莖中部一側(cè)切開長約05 cm的傷口，傷口深達(dá)木質(zhì)部，在傷口處夾入一小團(tuán)無菌脫脂棉球，用封口膜將馬尾松苗與脫脂棉包扎起來，封口膜外再用透明膠帶包成一個(gè)小漏斗，將線蟲懸浮液0.5 mL滴入脫脂棉，線蟲接種量約為3 000條·mL-1，每個(gè)處理接種5株，同時(shí)以蒸餾水為對(duì)照。在接種后的24 h內(nèi)每隔3 h給脫脂棉滴加適量蒸餾水保濕。接種后，室內(nèi)溫度保持25～30 ℃。觀察馬尾松幼苗的變化，大約20 d后，接種幼苗產(chǎn)生萎蔫癥狀后，將馬尾松苗從土中拔出，洗凈根部后將整株剪碎，用無菌水浸泡洗出線蟲，離心收集線蟲，顯微鏡下檢查線蟲分離情況，計(jì)數(shù)分離線蟲數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1離體條件下線蟲繁殖力

松材線蟲和擬松材線蟲在真菌培養(yǎng)基上的繁殖數(shù)量見表1。總體來說，無論是單獨(dú)培養(yǎng)還是混合培養(yǎng)條件下，松材線蟲的繁殖數(shù)量都顯著大于擬松材線蟲。混合培養(yǎng)條件下，松材線蟲競爭優(yōu)勢十分顯著，繁殖數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于擬松材線蟲。隨著繁殖代數(shù)的增加，松材線蟲的競爭優(yōu)勢逐步增強(qiáng)，混合培養(yǎng)物中，松材線蟲數(shù)量逐步增多，而擬松材線蟲數(shù)量逐步減少。

圖5為連續(xù)混合培養(yǎng)松材線蟲和擬松材線蟲40 d時(shí)，兩種線蟲繁殖總數(shù)對(duì)比圖。從中可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，松材線蟲的繁殖數(shù)量逐步增加，而擬松材線蟲則相反，繁殖數(shù)量隨著混合培養(yǎng)時(shí)間的增長逐步遞減。從種群競爭角度來看，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，占據(jù)競爭優(yōu)勢地位的松材線蟲數(shù)量逐步增加，而占據(jù)劣勢地位的擬松材線蟲數(shù)量逐步減少，直到松材線蟲占據(jù)了整個(gè)生態(tài)位。

2.2寄主植物中線蟲繁殖力

松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物中的繁殖數(shù)量（見表2）?？傮w說來，松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物中的繁殖數(shù)量都小于在真菌培養(yǎng)基上。對(duì)比松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物中的繁殖數(shù)量可以看出，單獨(dú)接種條件下擬松材線蟲繁殖數(shù)量稍微高于松材線蟲；混合接種條件下，松材線蟲繁殖數(shù)量遠(yuǎn)大于擬松材線蟲。由此可以看出，擬松材線蟲作為土著種，在松樹寄主植物中的繁殖能力并不比外來種松材線蟲差；但是隨著外來種松材線蟲的入侵，擬松材線蟲的繁殖數(shù)量逐步減少，而松材線蟲的繁殖數(shù)量逐步增多。

3討論

本研究通過離體條件競爭試驗(yàn)和體內(nèi)競爭試驗(yàn)比較競爭和非競爭條件下兩種線蟲的繁殖能力差異，結(jié)果表明，松材線蟲的繁殖水平高于擬松材線蟲。松材線蟲和擬松材線蟲混合物長時(shí)間培養(yǎng)后，松材線蟲逐步競爭淘汰擬松材線蟲。除此之外，室內(nèi)培養(yǎng)和寄主接種結(jié)果均表明，競爭條件下松材線蟲的繁殖力高于非競爭條件。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：夏劍萍）第46卷第5期endprint