蟬翼藤單體提取化合物對乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化損傷保護作用研究

李 辰,黎 瑩,李 麗,楊成芳,鐘毓娟,吳 丹,石 琳,陳 莉,李勇文

·論著·

蟬翼藤單體提取化合物對乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化損傷保護作用研究

李 辰,黎 瑩,李 麗,楊成芳,鐘毓娟,吳 丹,石 琳,陳 莉,李勇文*

目的探討蟬翼藤單體提取化合物——甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化損傷及B淋巴細胞瘤2相關(guān)X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)表達的影響,研究甲基阿魏酸的保護作用。方法2017年3—6月，選取SPF級雄性成年C57BL/6小鼠60只,采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和甲基阿魏酸低劑量組(5 mg/kg)、甲基阿魏酸中劑量組(10 mg/kg)、甲基阿魏酸高劑量組(20 mg/kg)，每組12只。除正常組以外,其余各組每天早上50%乙醇溶液按照0.1 ml/10 g體質(zhì)量灌胃。每天下午,甲基阿魏酸給藥組分別給予相應(yīng)劑量的甲基阿魏酸灌胃,連續(xù)4周。取肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察其病理改變。計算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)，生化分析法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)及肝組織過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和Western blotting法分別檢測肝組織中Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達。結(jié)果與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)增加，血清ALT、AST、TC、TG水平升高，肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平降低，MDA水平升高，肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2升高(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和血清ALT、AST、TC、TG及MDA水平降低，肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平升高，肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2降低(P<0.05)。甲基阿魏酸高劑量組小鼠以上指標改善最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有保護作用,可有效改善肝功能,減輕肝損傷程度,維持Bax、Bcl-2的平衡,其機制可能與抵抗肝臟氧化損傷以及抑制細胞凋亡有關(guān)。

蟬翼藤屬；甲基阿魏酸；乙醇；氧化性應(yīng)激

本研究背景：

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提升，我國飲酒人群也日益增多，酒精性肝病(ALD)發(fā)病率逐年上升，對人類健康和社會發(fā)展構(gòu)成了嚴重威脅。ALD的發(fā)病因素單一，即大量乙醇攝入所致，但其發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前尚不十分清楚。近年來，自由基過量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在ALD中的重要作用已成為共識。本研究從抵抗氧化應(yīng)激角度入手研究蟬翼藤單體提取物——甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝臟氧化損傷保護作用，為將其開發(fā)成一種新的解酒保肝藥物提供必要的理論依據(jù)。

乙醇濫用是世界范圍內(nèi)致病率和死亡率居高不下的主要原因之一,肝臟是人體最大的代謝器官,也是乙醇損傷的主要靶器官之一。酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是一個涵蓋廣泛的醫(yī)學(xué)術(shù)語,范圍包括從簡單脂肪變性到脂肪性肝炎、進行性肝纖維化、肝硬化及肝癌等一系列表型[1]。這些酒精性疾病發(fā)生、發(fā)展機制尚未完全了解。目前研究發(fā)現(xiàn),除乙醇過量攝入外,遺傳因素、營養(yǎng)條件、能量代謝、氧化應(yīng)激、免疫異常等條件在ALD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。目前,ALD的治療措施主要包括戒酒、營養(yǎng)支持和給予皮質(zhì)類固醇藥物,但效果不佳。由于長期過量乙醇攝入導(dǎo)致的ALD已經(jīng)是一個全球性健康問題,中草藥由于可調(diào)控多個靶點及不良反應(yīng)小等特點,在預(yù)防和治療ALD領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[3]。甲基阿魏酸是從廣西特色中草藥蟬翼藤中提取的單體化合物[4],蟬翼藤具有抗炎、增強免疫功能、抗乙型肝炎病毒等活性[5]。本實驗采用乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟亞急性損傷模型,著眼于觀察甲基阿魏酸對乙醇攝入引起肝損傷的保護作用,為開發(fā)解酒保肝產(chǎn)品乃至治療ALD尋找思路,為進一步深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 甲基阿魏酸(美國Sigma公司)，無水乙醇(AR級,汕頭市西隴化工有限公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕，兔抗B淋巴細胞瘤2相關(guān)X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、β-actin抗體、山羊抗兔二抗〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，DYY-6C型雙穩(wěn)定時電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)，Chemi Doc型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，752型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，TGL-16B型高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，5424R臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗動物 2017年3—6月，SPF級雄性成年C57BL/6小鼠60只,體質(zhì)量18～22 g,由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供〔實驗動物使用許可證號：SCXK(桂)2017-0050〕。小鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心內(nèi),房間室溫18～24 ℃,濕度60%,12 h照明,12 h黑暗,清潔籠子隔日1次。使用標準維持飼料和蒸餾水,動物自由飲水和進食。

1.3 動物分組和造模方法 將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,稱體質(zhì)量。采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和甲基阿魏酸低劑量組(5 mg/kg)、甲基阿魏酸中劑量組(10 mg/kg)、甲基阿魏酸高劑量組(20 mg/kg)，每組12只。除正常組以外,其他各組先給予30%乙醇溶液,按照0.1 ml/10 g體質(zhì)量適應(yīng)性灌胃,正常組給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)3 d。第4天開始,除正常組以外,其余各組每天早上50%乙醇溶液按照0.1 ml/10 g體質(zhì)量灌胃。每天下午,甲基阿魏酸給藥組分別給予相應(yīng)劑量的甲基阿魏酸灌胃,連續(xù)4周。實驗期間各組小鼠均給予相同標準的飼料和蒸餾水,并觀察記錄其一般狀況、體質(zhì)量變化等情況。

1.4 樣本收集 末次給藥后,禁食不禁水12 h。脫臼法處死前稱體質(zhì)量,取肝臟和脾臟,在濾紙上輕輕拭干后立即稱質(zhì)量,記錄肝臟質(zhì)量和脾臟質(zhì)量。各組均取肝葉中部用甲醛溶液固定,蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察其病理變化。摘眼球采血1～2 ml待檢測。

1.5 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)及病理變化的檢測 肝臟指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%,脾臟指數(shù)(%)=脾臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。電鏡下觀察各組切片HE染色情況,比較其差異情況。

1.6 生化分析法檢測小鼠血清ALT、AST、TC、TG及肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平 將全血靜置2 h后,以4 000 r/min離心10 min(離心半徑4.8 cm),分離血清。按照試劑盒方法測定血清中ALT、AST、TC和TG水平；取小鼠肝臟相同部位組織制備肝組織勻漿,按照試劑盒方法測定小鼠肝組織中CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平。

1.7 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法檢測肝組織Bax、Bcl-2 mRNA的表達 取各組小鼠肝組織約100 mg,按照總RNA提取試劑盒說明書,采用Trizol法抽提肝組織總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度,OD260/OD280在1.8～2.0。依據(jù)試劑盒說明書,將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。查找基因序列并設(shè)計引物,以β-actin為內(nèi)參。Bax引物序列:上游引物:5′-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3′，下游引物:5′-AATTCGCCGGAGACACTCG-3′；Bcl-2引物序列：上游引物:5′-TCAGAGCGAGAAGGTAGGGA-3′，下游引物:5′-CTGTGGGGTAACAAGAAGGTC-3′；β-actin引物序列：上游引物:5′-GGACTCCTATGTGGGTGACGA-3′，下游引物:5′-ACGGTTGGCCTTAGGGTTCA-3′。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s,45～68 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán)；最終產(chǎn)物72 ℃,10 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取10 μl產(chǎn)物及5 μl DNA marker進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)檢測灰度值,Image Lab軟件進行分析。

1.8 Western blotting法檢測肝組織Bax、Bcl-2的表達 取各組小鼠肝組織約100 mg,剪碎,置于EP管中。加入配好的1 ml RIPA蛋白裂解液〔含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕，用玻璃勻質(zhì)器勻漿,充分裂解后,冰上靜置5 min。冷凍離心，以13 000 r/min離心10 min(離心半徑5.6 cm)。取上清液,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,用Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育,4 ℃搖床過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶10 000),常溫孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,并測定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般狀況及肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)測定結(jié)果 正常組小鼠狀況良好、反應(yīng)敏銳,無死亡。模型組小鼠經(jīng)乙醇灌胃先產(chǎn)生興奮后產(chǎn)生醉意、反應(yīng)遲鈍,部分小鼠腹瀉,死亡1只。甲基阿魏酸給藥組小鼠精神狀態(tài)比模型組有所改善,無腹瀉，無死亡。

5組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of values of liver index and splenic index among 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

組別只數(shù)肝臟指數(shù)脾臟指數(shù)正常組123.36±0.350.28±0.04模型組117.85±0.26a0.71±0.03a甲基阿魏酸低劑量組126.47±0.15ab0.61±0.03ab甲基阿魏酸中劑量組125.27±0.21abc0.59±0.05abc甲基阿魏酸高劑量組124.33±0.15abcd0.49±0.05abcdF值45.62341.742P值<0.001<0.001

注：與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

2.2 5組小鼠肝臟病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示,正常組小鼠肝臟匯管區(qū)及肝小葉架構(gòu)清晰完整,肝索整齊排列,肝細胞無炎癥壞死。模型組小鼠肝臟匯管區(qū)周圍肝細胞腫脹且肝索混亂排列,肝小葉附近肝細胞呈氣球樣病變,部分肝實質(zhì)細胞壞死。甲基阿魏酸給藥組小鼠肝臟損傷程度有所改善,細胞壞死情況減輕(見圖1)。

2.3 5組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較 5組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平兩兩比較(除甲基阿魏酸低劑量組與甲基阿魏酸中劑量組小鼠血清TC水平)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.4 5組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比較 5組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平升高，MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平兩兩比較(除甲基阿魏酸低劑量組與甲基阿魏酸中劑量組小鼠肝組織GSH-Px、MDA水平)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.5 5組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2比較 5組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖2、3)。

圖1 甲基阿魏酸對肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色,×200)

組別只數(shù)ALT(U/L)AST(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常組1235±546±52.94±0.331.53±0.18模型組11251±7a234±6a4.63±0.29a3.22±0.55a甲基阿魏酸低劑量組12151±6ab132±5ab3.54±0.31ab2.51±0.18ab甲基阿魏酸中劑量組12131±5abc123±5abc3.50±0.46ab2.20±0.36abc甲基阿魏酸高劑量組12100±7abcd103±7abcd3.21±0.34abcd1.95±0.37abcdF值523.565492.17310.4339.543P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油；與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

Table3 Comparison of values of CAT,GSH-Px,SOD and MDA in the liver tissues among 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

組別只數(shù)CAT(kU/gprotein)GSH-Px(kU/gprotein)SOD(kU/gprotein)MDA(nmol/mgprotein)正常組12249.48±7.4482.29±4.88115.10±7.992.08±0.72模型組11160.89±6.00a49.12±4.43a59.96±3.23a6.40±0.60a甲基阿魏酸低劑量組12201.65±6.12ab61.04±4.14ab69.89±3.71ab4.98±0.23ab甲基阿魏酸中劑量組12211.19±4.52abc64.92±5.22ab75.22±3.83abc4.47±0.55ab甲基阿魏酸高劑量組12228.96±6.32abcd71.04±4.63abcd84.42±3.46abcd3.39±0.52abcdF值87.09620.62257.97826.570P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：CAT=過氧化氫酶，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶，SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛；與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

Table4 Comparison of expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and protein among 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

組別只數(shù)BaxmRNA/Bcl-2mRNABax/Bcl-2正常組120.34±0.110.59±0.04模型組113.03±0.22a2.56±0.21a甲基阿魏酸低劑量組122.09±0.24ab1.35±0.33ab甲基阿魏酸中劑量組120.83±0.16abc0.91±0.24abc甲基阿魏酸高劑量組120.64±0.14abcd0.75±0.22abcdF值118.42336.711P值<0.001<0.001

注：Bax=B淋巴細胞瘤2相關(guān)X蛋白，Bcl-2=B淋巴細胞瘤2；與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

注：Bax=B淋巴細胞瘤2相關(guān)X蛋白，Bcl-2=B淋巴細胞瘤2

圖2 甲基阿魏酸對肝損傷小鼠肝組織Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

Figure2 Effects of methyl ferulic acid on the expressions of Bax,Bcl-2 mRNA in liver tissues in 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

圖3 甲基阿魏酸對肝損傷小鼠肝組織Bax、Bcl-2表達的影響

Figure3 Effects of methyl ferulic acid on the expressions of Bax,Bcl-2 protein in liver tissues in 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

3 討論

ALD是由于乙醇在體內(nèi)代謝異常導(dǎo)致的肝臟代謝紊亂性疾病,乙醇可以作為毒物直接作用于肝臟導(dǎo)致?lián)p傷。本研究采用乙醇灌胃法建立肝損傷模型,不僅符合人類飲酒習(xí)慣,而且死亡率低于乙醇腹腔注射法。大量攝入的乙醇經(jīng)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶氧化后,最終催化產(chǎn)物是乙醛,乙醛對機體有直接損傷作用。乙醇誘導(dǎo)微粒體乙醇氧化系統(tǒng),增加了肝臟能量的消耗,造成肝內(nèi)能量耗竭,引起肝細胞損傷[6]。

乙醇對機體造成的損傷作用涉及多種病理機制,越來越多的研究認為ALD作為復(fù)雜的病理過程,涉及氧化應(yīng)激、炎癥和過多脂肪酸合成[7]。氧化應(yīng)激是ALD發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一,其可被定義為體內(nèi)氧自由基穩(wěn)態(tài)水平的量度生物系統(tǒng)。長期乙醇攝入會消耗抗氧化防御系統(tǒng)的一些重要酶系,比如CAT、GSH-Px、SOD,還會促進活性氧(ROS)和活性氮物質(zhì)(RNS)的形成,這些物質(zhì)會損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。乙醇及其代謝物使氧化應(yīng)激處于持續(xù)狀態(tài),這是ALD的重要生化表現(xiàn)之一[8]。本研究結(jié)果顯示,甲基阿魏酸可顯著提高CAT、GSH-Px及SOD水平,維持體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,有細胞毒性,是客觀反映機體自由基水平的可靠指標[9],本研究結(jié)果顯示,甲基阿魏酸可顯著降低MDA水平,可抵抗組織脂質(zhì)過氧化損傷。

乙醇可導(dǎo)致脂肪代謝紊亂,從而損害肝臟[10]。脂肪代謝紊亂是ALD最早出現(xiàn)的病理狀況。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肝臟指數(shù)增大，血清TC、TG水平升高,表明肝臟中脂肪集聚。而給予甲基阿魏酸灌胃能顯著抑制肝臟指數(shù)增大，降低血清TC、TG水平，表明甲基阿魏酸能夠有效調(diào)節(jié)肝臟中脂肪代謝紊亂。

前期研究發(fā)現(xiàn)甲基阿魏酸對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn),甲基阿魏酸可降低血清中ALT、AST水平,具有保肝作用。與模型組相比,甲基阿魏酸還可降低脾臟指數(shù),具有抗炎免疫作用。

Bcl-2是細胞凋亡研究中引人注目的關(guān)鍵基因之一，Bax是Bcl-2基因家族中細胞凋亡促進基因,Bax過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應(yīng)而導(dǎo)致細胞凋亡[12]。Bcl-2主要位于細胞核、線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中,但以Bax為代表的促進凋亡的家族主要位于細胞質(zhì)中,Bax含有BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域,并可啟動凋亡信號[13]。作為抑制細胞凋亡蛋白家族的兩種典型蛋白,Bcl-2和Bax在調(diào)節(jié)線粒體的膜透性方面起著關(guān)鍵作用。當(dāng)?shù)蛲鲂盘柎碳r,Bax轉(zhuǎn)運到線粒體,使線粒體膜電位降低,直接或間接增強線粒體膜的通透性。Bcl-2可以穩(wěn)定線粒體膜的屏障功能,并抑制細胞凋亡誘導(dǎo)因子向細胞核轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白降低，甲基阿魏酸可上調(diào)Bcl-2表達,并抑制Bax表達，具有抑制細胞凋亡的作用。

綜上所述,在本實驗劑量范圍內(nèi)，甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)的小鼠亞急性肝損傷具有保護作用,且藥效與劑量呈梯度依賴關(guān)系。這種保護作用機制可能與抵抗肝臟氧化損傷以及抑制細胞凋亡有關(guān)。本研究不足之處是沒有對甲基阿魏酸抗ALD靶點蛋白進行研究。鑒于人們長期酗酒的習(xí)慣[15],今后將在乙醇誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型上進一步驗證甲基阿魏酸的解酒保肝作用。

作者貢獻:李辰、李麗進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理；李辰、黎瑩、吳丹、石琳、陳莉進行研究的實施與可行性分析；李辰進行數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計學(xué)處理，撰寫論文；李辰、楊成芳進行數(shù)據(jù)整理；李辰、鐘毓娟進行結(jié)果的分析與解釋；李勇文負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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EffectsofMonomericCompoundExtractedfromSecuridacaontheProtectionofLiverAgainstOxidativeDamageInducedbyEthanolinMice

LIChen,LIYing,LILi,YANGCheng-fang,ZHONGYu-juan,WUDan,SHILin,CHENLi,LIYong-wen*

GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China

*Correspondingauthor:LIYong-wen,Professor,Mainlyengagedinanti-inflammatoryimmunopharmacologyresearch；

E-mail：liyongwen99@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of methyl ferulic acid,a monomeric compound extracted from securidaca based on analyzing its effect on the oxidative damage in liver and the expressions of Bax and Bcl-2 in mice induced by ethanol.MethodsFrom March to June 2017,60 SPF grade male C57BL/6 mice were selected and randomized into normal group,model group and low-dose(5 mg/kg) methyl ferulic acid group,middle-dose (10 mg/kg) methyl ferulic acid group,high-dose(20 mg/kg) methyl ferulic acid group,12 in each group.Except the normal group,the other groups were given intragastric administration of 50% ethanol solution in a volume of 0.1 ml/10 g body weight every morning,the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups additionally

intragastric administration of methyl ferulic acid solution in a volume of 5 mg/kg,10 mg/kg,20 mg/kg body weight,respectively every evening,for 4 weeks.Hepatic tissues of the mice were taken out and stained with HE,and their pathological changes were observed.The liver index and splenic index were calculated.Biochemical analyses of serum ALT,AST,TC,TG,catalase (CAT),glutathione peroxidase (GSH-Px),superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde(MDA) levels were performed.The expressions of Bax,Bcl-2 mRNA in liver tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The expressions of Bax and Bcl-2 in liver tissues were detected by western blotting.ResultsIncreased values of liver index,splenic index,ALT,AST,TC,TG and MDA,elevated expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and Bax/Bcl-2,and decreased values of CAT,GSH-Px,SOD were found in the model group,low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups rather than the normal group(P<0.05).The model group had higher values of liver index,splenic index,ALT,AST,TC,TG,MDA,increased expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and Bax/Bcl-2 but lower values of CAT,GSH-Px and SOD than the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups(P<0.05).The values of all the above markers differed significantly between the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups(P<0.05).ConclusionMethyl ferulic acid can protect the liver against oxidative damage induced by ethanol in mice manifested as improving liver function and alleviating the degree of hepatic injury,and stable the expressions of Bax and Bcl-2,which may be related to its resistance to oxidative damage of liver and inhibition of cell apoptosis.

Securidaca；Methyl ferulic acid；Ethanol；Oxidative stress

R 965

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.098

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81360497)；廣西高等學(xué)校優(yōu)秀中青年骨干教師培養(yǎng)工程項目；2016年自治區(qū)級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610601046)

541000廣西桂林市，桂林醫(yī)學(xué)院

*通信作者：李勇文，教授,主要研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)；E-mail：liyongwen99@163.com

2017-07-18；

2017-09-07)

陳素芳)