痰熱清注射液及藥效成分黃芩苷對(duì)心梗模型小鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

， ， 匡希

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,湖南 衡陽(yáng) 421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

痰熱清注射液及藥效成分黃芩苷對(duì)心梗模型小鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

英姿1*，黃斌2，匡希斌2

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,湖南 衡陽(yáng) 421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科)

目的探討痰熱清及其藥效成分黃芩苷對(duì)小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法將小鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、心梗模型組和痰熱清高、中、低劑量組，以及高劑量組痰熱清對(duì)應(yīng)的黃芩苷含量100 mg/kg作為藥效成分組。分別測(cè)定小鼠24 h心肌病理形態(tài)學(xué)檢查、梗塞面積、心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目比例、HMGB1、TLR4、NF-kB的表達(dá)活性、IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3等指標(biāo)。結(jié)果和心梗模型組相比，痰熱清高劑量組與藥效成分黃芩苷組均能顯著改善心肌病理，降低梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡率和梗死區(qū)面積，下調(diào)心梗小鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路以及IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的表達(dá)。結(jié)論痰熱清與其藥效成分黃芩苷具有類似的心臟保護(hù)藥效，其機(jī)制涉及改善HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路及下游炎性因子，氧化應(yīng)激及凋亡因子的表達(dá)，從而降低小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷。

痰熱清； 黃芩苷； 心肌梗死； 細(xì)胞凋亡

急性心肌梗死是人類健康的重要?dú)⑹?，其病理本質(zhì)為冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，炎性因子、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡均參與了心梗后心肌損害的發(fā)生和發(fā)展[1]。心梗中醫(yī)名為胸痹，古代文獻(xiàn)雖然認(rèn)為胸痹發(fā)病多為陽(yáng)微陰弦，但古代醫(yī)家提出的“熱結(jié)心痛”“毒損心絡(luò)”以及現(xiàn)代醫(yī)家的臨床研究發(fā)現(xiàn)均提示了心梗與痰熱密切相關(guān)。痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成，具有較強(qiáng)的清熱、解毒、化痰之功。近幾年痰熱清在心血管內(nèi)科的療效也不斷得到證實(shí)，既往文獻(xiàn)報(bào)道了其對(duì)冠心病心絞痛，急性心梗，高血壓和高血脂的療效，與本院心內(nèi)科的使用經(jīng)驗(yàn)相吻合，引起了本文作者極大的興趣[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用急性心肌梗死小鼠模型，觀察痰熱清對(duì)小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及信號(hào)通路的影響，探討痰熱清對(duì)心臟保護(hù)的作用機(jī)制及可能的藥效成分。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑8周齡的C57BL/6小鼠80只購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。痰熱清購(gòu)于上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，黃芩苷購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，HMGB1、TLR4、NF-kB抗體購(gòu)于長(zhǎng)沙鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的ELISA試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物模型小鼠被40 mg/kg (腹腔注射)劑量的戊巴比妥鈉麻醉。小鼠在氣管導(dǎo)管插管后予呼吸器，用室內(nèi)空氣輔助通氣，通氣參數(shù)：潮氣量8 mL/100 g，呼吸頻率68 cycles/min，呼吸頻率為2∶1。如果需要，實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)予麻醉藥(一般不再給予)。在消毒條件下，從第四肋骨的位置進(jìn)行胸廓切開手術(shù)?？梢钥匆娦呐K懸浮在心包中。通過錐型針，用1.0號(hào)的絲線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支的起始處，絲線兩端之間，通過，試管用于當(dāng)扎緊線時(shí)使冠狀動(dòng)脈閉塞。通過左心室相應(yīng)階段出現(xiàn)局部蒼白、膨脹，心肌缺血得到確定[4]。將造模成功62只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分六組(每組10只):(1)假手術(shù)組；(2)模型組：于術(shù)后腹腔注射生理鹽水(3 mg/kg)溶液；(3)痰熱清高(H-TRQ)、中(M-TRQ)、低劑量組(L-TRQ)：于術(shù)后30 min立即單次腹腔注射痰熱清高劑量(18 mL/kg)、中劑量(6 mL/kg)和低劑量(2 mL/kg)溶液 ；(4)吸收成分黃芩苷組(BCL)：根據(jù)痰熱清高劑量(18 mL /kg)中大約含黃芩苷100 mg/kg，于術(shù)后30 min立即腹腔注射黃芩苷100 mg/kg，與母方痰熱清進(jìn)行療效對(duì)比。

1.3觀察指標(biāo)分別測(cè)定小鼠24 h心肌病理形態(tài)學(xué)檢查(H&E染色)、梗塞面積、心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目比例(TUNEL測(cè)定方法)、HMGB1、TLR4、NF-kB的表達(dá)活性(Western blot法)、IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3(ELISA法)指標(biāo)。

1.3.1 心梗大小測(cè)定 造模24 h后，于1 mL 2%亞斯蘭染色劑于左心室注入，并將心肌組織用PBS沖洗3次，-20 ℃冰凍，并切成1 mm厚度薄片。用TTC孵育15 min，然后ImagePro-Plus 5.0.1計(jì)算危險(xiǎn)區(qū)及非危險(xiǎn)區(qū)。并統(tǒng)計(jì)分析[4]。

1.3.2 凋亡心肌細(xì)胞的定量使用TUNEL 心肌組織埋入paraffin封閉，每個(gè)組織切成5 μm厚度薄片，后使用蛋白酶K，組織切片用TUNEL反應(yīng)，使用DAPI封固劑進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)，至少每個(gè)封閉的5個(gè)切片計(jì)數(shù)。另外使用單克隆抗a輔肌動(dòng)蛋白染色。每一個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)視野來(lái)計(jì)算凋亡指數(shù)[5]。

1.3.3 Western blot法測(cè)HMGB1、TLR4、NF-Kb表達(dá)

心肌組織一個(gè)加入胞漿提取混合液400 μL，在冰凍下用組織勻漿機(jī)勻漿。得到的漿液離心：700×g 10 min 4 ℃。收集上清液到新的一個(gè)EP管，離心：10 000×g 30 min 4 ℃。再次收集到的上清液作為胞漿提取物。將得到的組織液用BCA法進(jìn)行蛋白定量。在做好的凝膠中上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，待凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，將PVDF膜浸入5%milk封閉。37 ℃ 2 h或者4 ℃過夜。一抗(cyt C 與5%milk按照1∶300比例配置。例如：10 mL/300=33 μL)孵育,37 ℃ 2 h或者4 ℃過夜。沖洗：PBST緩沖液洗3次，10 min/次；加入二抗(抗體 與PBST緩沖液按照1∶20 000比例配置)，孵育,37 ℃ 1 h。沖洗：PBST緩沖液洗3次，10 min/次；PBS緩沖液洗1次，10 min。曝光，然后ImagePro-Plus 5.0.1分析圖像[6]。心肌組織提取液IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的均采用武漢華美ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)結(jié)束后于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取光密度值(波長(zhǎng)450 nm)，繪制濃度曲線，計(jì)算樣本光密度值對(duì)應(yīng)的濃度范圍。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠的心肌組織病理與心肌細(xì)胞凋亡比較如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌纖維呈粉紅色，飽滿整齊；心肌細(xì)胞漿染色均勻，細(xì)胞核分布均勻；心肌間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。小鼠心梗后24 h，梗死邊緣區(qū)心肌纖維排列紊亂、斷裂，肌漿嗜酸性增強(qiáng)；心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，呈凝固性壞死；心肌間質(zhì)可見較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥性充血，高劑量痰熱清(18 mL/kg)組能顯著改善心肌細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)降低梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡率和梗死區(qū)面積，(與鹽水組相比均P<0.05)，同時(shí)高劑量痰熱清中所含約100 mg/kg的黃芩苷也發(fā)揮了類似的心臟保護(hù)的藥效，心肌細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，且心肌細(xì)胞凋亡率與梗死區(qū)面積與鹽水組相比均P<0.05。而痰熱清低、中劑量均無(wú)明顯改善梗死邊緣區(qū)心肌組織病理和心肌細(xì)胞凋亡的作用。

2.2各組小鼠HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路比較心梗模型組小鼠心肌組織的HMGB1/TLR4/NF-kB的表達(dá)顯著升高(模型組與假手術(shù)組，均P<0.05，圖2)，痰熱清與藥效成分黃芩苷均能顯著降低心梗小鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-kB 的表達(dá)，提示藥效成分黃芩苷發(fā)揮了類似與母方痰熱清調(diào)節(jié)心梗小鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路的藥效。

圖1 小鼠心肌病理與梗死形態(tài) *：與模型組相比P<0.05

圖2 小鼠心肌組織Western blot檢測(cè) 與假手術(shù)組相比，#：P<0.05;與模型組相比，*：P<0.05

2.3各組小鼠的炎性因子IL-6、TNF-α、氧化應(yīng)激與凋亡因子MDA、caspase-3的表達(dá)比較心梗模型組小鼠心肌組織的IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的表達(dá)顯著升高(模型組與假手術(shù)組，均P<0.05，圖3)，痰熱清與藥效成分黃芩苷均能顯著降低心梗小鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3 的表達(dá)(兩組與模型組均P<0.05)，提示藥效成分黃芩苷發(fā)揮了類似與母方痰熱清調(diào)節(jié)心梗小鼠心肌組織中炎性因子IL-6、TNF-α、氧化應(yīng)激與凋亡因子MDA、caspase-3的藥效。

圖3.小鼠心肌組織提取液ELISA檢測(cè) 與假手術(shù)組相比，#：P<0.05;與模型組相比，*：P<0.05

3 討 論

痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成,其中黃芩為君藥,具有清熱燥濕,瀉火清毒之功效;熊膽粉、山羊角為臣藥,熊膽粉具有解痙、解毒、抑菌抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用;山羊角具有顯著的解熱、鎮(zhèn)靜及免疫作用;金銀花為佐藥,有廣譜抗菌作用,以助清熱解毒,宣肺化痰;連翹為使藥,具有升浮宣散之力。痰熱清可用具有抗病毒、抑菌、抗炎、解熱、化痰、鎮(zhèn)咳等作用,廣泛應(yīng)用于呼吸、消化、血液等系統(tǒng)疾病 。除此之外,痰熱清在不斷的臨床應(yīng)用中，發(fā)展了許多臨床新用途，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，在治療急性膽囊炎，胰腺炎，川崎病，急性腦出血，開胸術(shù)后痰潴留，癌性發(fā)熱，腎綜合征出血熱，多器官功能衰竭綜合征，肺心病等各科疾病中均報(bào)道有良好療效[7-9]。

近幾年隨著痰熱清在心血管內(nèi)科的療效也不斷得到證實(shí)，本文作者在心內(nèi)科進(jìn)行臨床療效觀察的同時(shí)，也試圖從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)闡釋痰熱清的心臟保護(hù)作用。本文作者的研究參考了已有學(xué)者證實(shí)的痰熱清在急性肺損傷中發(fā)揮的調(diào)節(jié)免疫，抗氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡作用[10-11]，并且冠心病也主要是冠狀動(dòng)脈形成心梗斑塊，致管腔狹窄冠脈血流量減少后心肌缺血所致，其形成機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激和/或炎癥均與心梗相關(guān)，推測(cè)痰熱清在急性心梗中亦可能發(fā)揮類似藥效。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，痰熱清注射液可減少炎癥反應(yīng)及超敏反應(yīng)等損傷性反應(yīng)的發(fā)生，提高抗炎因子的表達(dá)[12]?？纱龠M(jìn)機(jī)體免疫功能發(fā)揮，對(duì)T、B 淋巴細(xì)胞增殖及腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有顯著促進(jìn)作用[13]。同時(shí)還可降低炎性細(xì)胞因子的含量，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能[3]。臨床研究結(jié)果表明，痰熱清注射液能顯著改善心梗的臨床癥狀及動(dòng)態(tài)心電圖，有效地降低其血漿中hs-CRP 水平，對(duì)痰熱型心?；颊呔哂酗@著的治療作用，推測(cè)其作用機(jī)制可能是通過抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)、抗氧自由基作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能等途徑，有效地改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、降低斑塊的破裂及血栓形成而達(dá)到抑止或延緩心梗發(fā)生發(fā)展的效果[2]。

本文的實(shí)驗(yàn)首先從心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變上驗(yàn)證了小鼠梗死邊緣區(qū)心肌纖維排列紊亂、斷裂，肌漿嗜酸性增強(qiáng)；心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，呈凝固性壞死；心肌間質(zhì)可見較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥性充血，痰熱清與黃芩苷改善心肌細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)降低梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡率和梗死區(qū)面積，下調(diào)HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路的表達(dá)。對(duì)于炎癥反應(yīng)的初始觸發(fā)信號(hào)的探索中，人們發(fā)現(xiàn)了“危險(xiǎn)信號(hào)”模式。相對(duì)于病原體基本成分或產(chǎn)物這類外源性的“危險(xiǎn)信號(hào)分子”而言，內(nèi)源性的“危險(xiǎn)信號(hào)分子”來(lái)自損傷或壞死的細(xì)胞，一旦被釋放到胞外，則是一種強(qiáng)大的致炎及趨化細(xì)胞因子。對(duì)這種內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號(hào)分子”如何導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡及免疫反應(yīng)紊亂的研究是目前國(guó)際上的前沿?zé)狳c(diǎn)[14]。HMGB1即是其典型代表，為廣泛存于在有核細(xì)胞胞內(nèi)均高度保守的DNA結(jié)合蛋白，具有穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)等多種功能。長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)于HMGB1核外功能了解甚少。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1是機(jī)體識(shí)別損傷、啟動(dòng)修復(fù)的非常重要的內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號(hào)分子”。在實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死的動(dòng)物腦、肝臟和心臟等缺血模型中的研究顯示，缺血發(fā)生早期，HMGB1即向胞外釋放，應(yīng)用HMGB1抗體可以減輕缺血再灌注損傷的程度[15]。本文推測(cè)在急性心梗的早期，缺血導(dǎo)致HMGB1釋放，HMGB1通過巨噬細(xì)胞表面TLR4受體調(diào)節(jié)的NF-kB分泌，參與了心梗的發(fā)生發(fā)展[16]。圍繞HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)途徑進(jìn)行藥物干預(yù)，能減輕心肌缺血帶來(lái)的心肌細(xì)胞損傷，為急性心梗的治療策略提供新的理論依據(jù)參考。

本文結(jié)果顯示痰熱清可能是通過抗氧化應(yīng)激和抑制炎性因子的機(jī)制減少斑塊發(fā)生，抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮了心臟保護(hù)作用，其主要信號(hào)通路與HMGB1/TLR4/NF-kB相關(guān)。HMGB1與TLR4結(jié)合后受體發(fā)生二聚化，引起MyD88和MyD88依賴性NF-kB的激活，上調(diào)炎性因子TNF-α、IL-6的基因表達(dá)水平并引起大量釋放[17]。報(bào)道亦證實(shí)心肌組織缺血再灌注引起病理?yè)p傷，導(dǎo)致心肌組織MDA含量上升，凋亡增多，caspase-3上升，與HMGB1的上升呈同步相關(guān)性[18]。

綜上所述，痰熱清對(duì)小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，具體機(jī)制涉及對(duì)HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)以及炎性因子，氧化應(yīng)激及凋亡因子等多方面機(jī)制，黃芩苷是痰熱清心臟保護(hù)作用的藥效成分之一。

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ProtectiveeffectsofTan-Re-Qinganditsabsorbedcomponentsbaicalinonmyocardialcellinjuryaftermyocardialinfarctioninmice

YING Zi,HUANG Bin,KUANG XiBin

(DepartmentofPharmacology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Tan-Re-Qing and its main absorption component,baicalin,on myocardial cell injury after myocardial infarction in mice.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into sham operation group,myocardial infarction model group,high,medium and low dose of Tan-Re-Qing group,and baicalin 100 mg/kg contents in high dose group Tan-Re-Qing as absorbed compounds group.24 h myocardial pathology,the number of myocardial infarct size and apoptosis ratio,expression of HMGB1,TLR4 and NF-kB activity,level of IL-6,TNF-α,MDA,caspase-3 were measured and the results were statistically analyzed.ResultsCompared with myocardial infarction model group,Tan-Re-Qing and its absorbed compound baicalin could significantly improve myocardial pathology,reduced infarct marginal zone and cell apoptosis rate of myocardial infarction area,down-regulated the HMGB1/TLR4/NF-kB signaling pathway and the expression of IL-6,TNF-α,MDA,caspase-3.ConclusionTan-Re-Qing and its absorbed compound baicalin has similar heart protection effect,its mechanism relates to the improvement of HMGB1/TLR4/NF-kB signaling pathway and expression of their downstream inflammatory factors,oxidative stress and apoptosis factors,thereby reducing myocardial cell injury after myocardial infarction in mice.

Tan-Re-Qing; baicalin; myocardial infarction; apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.008

2017-07-04；

2017-09-26

湖南省自然科學(xué)基金(院校聯(lián)合基金項(xiàng)目)；痰熱清吸收成分通過抗氧化途徑發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)理研究，基金號(hào)：2015JJ6099.

*通訊作者，E-mail：nanhuayingzi@163.com.

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蔣湘蓮)