環(huán)境應(yīng)激蛋白PprM研究進(jìn)展

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(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

·小專論·

環(huán)境應(yīng)激蛋白PprM研究進(jìn)展

潘寶平1，馬云2，何淑雅1，2*

(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

耐輻射奇球菌(DR)是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的輻射抗性最強(qiáng)的生命形式之一，具有快速高效的DNA損傷修復(fù)能力。PprM是DR菌特有的抗輻射響應(yīng)蛋白，同時(shí)具有熱休克蛋白(Hsp)和冷休克蛋白(Csp)特性，而且對(duì)電離輻射、氧化、干燥等壓力脅迫都表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗性。本文從PprM結(jié)構(gòu)功能分析與預(yù)測(cè)、應(yīng)激特性、分子伴侶活性與結(jié)合特性對(duì)目前PprM研究的最新進(jìn)展做一綜述，以期推動(dòng)PprM進(jìn)一步研究。

PprM； 熱休克蛋白； 冷休克蛋白； 抗輻射； 抗氧化

耐輻射奇球菌(Deinococcusradiodurans,DR)最出名于它對(duì)γ輻射的極端抗性，但是它也被證明對(duì)紫外輻射，干燥，高壓真空，重離子襲擊和過氧化氫等都具有極強(qiáng)的抗性。DR菌對(duì)這些壓力抗性的分子基礎(chǔ)正在被廣泛研究當(dāng)中，特別受關(guān)注的是它的DNA修復(fù)系統(tǒng)。該細(xì)菌具有強(qiáng)大的DNA修復(fù)能力，一個(gè)5 kGy輻射能導(dǎo)致DR菌基因組200個(gè)雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)，但是這種細(xì)菌卻能在數(shù)小時(shí)內(nèi)精確地從DNA碎片中重新裝配到基因組中，主要原因是它能夠調(diào)動(dòng)機(jī)體約1/3的基因來抵抗致命的輻射損傷而存活。而對(duì)于其他幾乎所有生物而言, 少數(shù)幾個(gè)DNA雙鏈斷裂都是致死性的。但目前這種高效快速的DNA修復(fù)機(jī)制尚不清楚。

已經(jīng)證實(shí)DR菌中很多基因(如pprI、pprA和recA等)在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。2009年Ohba H[1]在比較野生菌株與pprI基因缺陷突變株時(shí)發(fā)現(xiàn)一種新型的調(diào)節(jié)蛋白，經(jīng)鑒定為一種冷休克蛋白(Cold-shock protein,Csp)同源物并命名為PprM，并證實(shí)PprM參與了在DR菌中PprI介導(dǎo)的輻射響應(yīng)，而pprI是DR菌DNA損傷修復(fù)的總開關(guān)基因，在DR的極端抗性機(jī)制中起到非常重要的作用[2]，PprI充當(dāng)一個(gè)總開關(guān)在輻射之后能夠調(diào)節(jié)許多不同通路的蛋白質(zhì)的表達(dá)，至少約210個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了，包括21個(gè)DNA修復(fù)和復(fù)制相關(guān)的基因，而這種潛在的機(jī)制并不清楚。細(xì)菌Csps主要在溫度快速下降后被誘導(dǎo)以調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)冷應(yīng)激的適應(yīng)性，但也存在于正常條件下來調(diào)控其他生物學(xué)功能[3]。

1 PprM結(jié)構(gòu)功能分析與預(yù)測(cè)

運(yùn)用多種在線工具(包括CCD、SSDB和SMART等)對(duì)PprM蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)PprM編碼蛋白是一種含有S1-like RNA結(jié)合域及ssDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白， S1-like RNA結(jié)構(gòu)域是RNA結(jié)合蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，ssDNA結(jié)構(gòu)域是抗轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的pprM基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)pprM是一種冷休克蛋白基因。PprM蛋白與來自D.geothermalis和Thermusthermophilus的冷休克蛋白一樣屬于同一個(gè)亞基家族的不同的進(jìn)化分支。純化的PprM蛋白在生理?xiàng)l件下以二聚體的形式存在，類似于大腸桿菌的冷休克蛋白D[1]。S1-like superfamily即核糖體蛋白S1-like RNA結(jié)合域，在各種RNA結(jié)合蛋白中均有發(fā)現(xiàn)。最初被定義為S1核糖體蛋白，這個(gè)超家族還包含與S1結(jié)構(gòu)域同源的冷休克域(CSD)?？罐D(zhuǎn)錄終止因子結(jié)合域的抗終止作用主要見于某些噬菌體的時(shí)序控制。早期基因與其后基因之間以終止子相隔開，抗終止因子可以使RNA聚合酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，同時(shí)打開其后基因的表達(dá)，此過程稱為通讀。

圖1 PprM蛋白結(jié)構(gòu)域分析

2 PprM應(yīng)激特性

所有生物必須具備能力去適應(yīng)環(huán)境變化包括營養(yǎng)素和一般物理參數(shù)，如滲透壓和溫度的變化。關(guān)于冷休克，有學(xué)者定義了特定的實(shí)際條件，例如對(duì)于嗜溫細(xì)菌，將冷休克定義為溫度在幾分鐘內(nèi)從37 ℃降到15 ℃，即從最佳生長溫度到接近最低極限的溫度下生長。在已知的耐熱性和低溫耐受性的基礎(chǔ)上，已經(jīng)確認(rèn)了DR菌最佳的熱休克和冷休克溫度，在52 ℃的致死溫度下42 ℃的熱休克和在反復(fù)凍融下20 ℃的冷休克能夠出現(xiàn)最大化存活，并證實(shí)DR菌在熱休克和冷休克處理下分別有67種蛋白和42種蛋白的表達(dá)量增加。Csps一般在較低溫度下的表達(dá)量會(huì)大量增加，以保證菌體在較低溫度下的生存，但除低溫外，紫外線照射、H2O2和缺氧等應(yīng)激也可激發(fā)其表達(dá)，PprM就是在42 ℃的熱應(yīng)激下被誘導(dǎo)的大量蛋白之一，為熱休克誘導(dǎo)蛋白。但同時(shí)pprM又具有冷休克蛋白結(jié)構(gòu)域，具有冷休克蛋白特性，所以被大量學(xué)者將其歸屬于冷休克蛋白的同源物。

PprM蛋白在輻射誘導(dǎo)下能高表達(dá)，其pprM缺失突變株對(duì)于 γ 輻射的敏感性顯著增加，同時(shí)pprM與pprA雙缺失突變株比pprM與pprA基因單缺失突變株具有更高的輻射敏感度[1, 4]，可見PprM對(duì)DR菌的輻射抗性起到重要作用。同時(shí)PprM在氧化應(yīng)激下也發(fā)揮重要作用，pprM突變菌種顯示出過氧化氫酶活性降低，同時(shí)在相同環(huán)境下相比野生型DR菌對(duì)H2O2的抗性下降，主要原因是pprM的敲除降低了KatE1的mRNA和蛋白的水平，它是DR菌中主要的過氧化氫酶，表明PprM蛋白在氧化應(yīng)激中也發(fā)揮重要作用[5]。同時(shí)將pprM基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌能提高它的抗鹽堿、耐干旱能力[6]。這些研究表明pprM基因是非常重要的抗逆基因，未來可能在農(nóng)業(yè)、輻射防護(hù)和環(huán)境治理等方面有極好的應(yīng)用前。

3 PprM分子伴侶活性與結(jié)合特性

許多研究表明細(xì)菌中的Csps可以作為分子伴侶，能夠結(jié)合RNA 和DNA，促進(jìn)一系列的細(xì)胞過程，比如轉(zhuǎn)錄和翻譯等。說明Csps很可能為一全局性的轉(zhuǎn)錄性的調(diào)節(jié)分子，能夠調(diào)節(jié)正常生長，冷適應(yīng)和各種應(yīng)激反應(yīng)和滲透脅迫反應(yīng)。當(dāng)某些環(huán)境改變后，細(xì)胞生理上會(huì)發(fā)生一些重要的變化，例如膜流動(dòng)性和核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，最終會(huì)導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄，翻譯和降解的效率降低[7]。而冷休克反應(yīng)使細(xì)胞來抵消這些不利的變化，主要是通過選擇性產(chǎn)生一組特定的蛋白質(zhì)，即Csps。大多數(shù)Csps都參與了RNA代謝，例如RNA解旋酶DeaD和核酸外切酶RNase R和PNPase，其中RNase R是大腸桿菌中唯一的3～5′核酸外切酶，能有效降解雙鏈RNA。冷休克蛋白主要功能之一作為RNA分子伴侶(RNA chaperone)與mRNA結(jié)合，參與RNA新陳代謝，防止二級(jí)結(jié)構(gòu)形成或促進(jìn)結(jié)構(gòu)化RNA的降解，RNA 伴侶分子可以幫助 RNA正確折疊或抑制 RNA 錯(cuò)誤折疊 ,可以使錯(cuò)誤折疊的RNA構(gòu)象解鏈并形成正確的空間折疊[8-10]。這表明調(diào)節(jié)RNA代謝是適應(yīng)的關(guān)鍵過程。PprM蛋白能結(jié)合RNA，是一種RNA分子伴侶蛋白。李偉等[11]利用RNA pull down等技術(shù)初步篩選到了與PprM蛋白相結(jié)合的4個(gè)mRNA，其中包括DR_A0355，它是雙組分調(diào)控系統(tǒng)(two-component system,TCS)重要成分之一，編碼產(chǎn)物為組氨酸蛋白激酶(histidinekinase,HK)CheA相關(guān)蛋白，該系統(tǒng)有助于細(xì)菌感知環(huán)境變化，并作出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)生物體適應(yīng)不斷變化甚至極端的環(huán)境起到非常重要的調(diào)節(jié)作用[12]。已經(jīng)證明DR菌中存在23個(gè)組氨酸蛋白激酶和29個(gè)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response regulator,RR)[13]，它們共同組成了DR的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，對(duì)于DR菌感知和響應(yīng)溫度、氧化、干燥等壓力脅迫起著至關(guān)重要的作用。

PprM蛋白也能結(jié)合DNA，Lu等[14]對(duì)pprI進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)PprI蛋白能特異性結(jié)合pprA和recA等DNA修復(fù)基因的啟動(dòng)子，它們已被證明在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[15-18]，而且在電離輻射誘導(dǎo)下，結(jié)合活性加強(qiáng)。已經(jīng)證實(shí)PprM是一種PprI依賴性DNA損傷應(yīng)答的一個(gè)調(diào)節(jié)器，但是PprM以何種方式參與了PprI介導(dǎo)的輻射損傷響應(yīng)并不清楚，有學(xué)者認(rèn)為它可能像大多數(shù)DNA損傷修復(fù)基因一樣也受到PprI的表達(dá)調(diào)控，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)PprI蛋白并不結(jié)合pprM的啟動(dòng)子[19]。然而最近有人發(fā)現(xiàn)PprM蛋白可能能夠結(jié)合一些參與DNA修復(fù)的基因的啟動(dòng)子，比如recA和pprA[20]。那么PprM是不是對(duì)pprI也有結(jié)合作用，促進(jìn)或抑制PprI的表達(dá)？PprM的結(jié)合特性，尤其對(duì)DNA的結(jié)合，可能在整個(gè)PprM作用機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。雖然目前對(duì)PprM蛋白的分子伴侶活性和結(jié)合特性研究數(shù)據(jù)甚少，但是該蛋白所擁有的極端抗性可能與它的分子伴侶活性和結(jié)合特性是密不可分的。

縱觀PprM蛋白的輻射應(yīng)激響應(yīng)，該蛋白含RNA特異性或者非特異性結(jié)合域及抗轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)合域，可使RNA聚合酶越過終止子通讀，其前后基因同時(shí)快速轉(zhuǎn)錄生成mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)，符合輻射應(yīng)激時(shí)細(xì)胞RNA需庇護(hù)及需大量快速生成的要求，故有理由認(rèn)為PprM可能就是被進(jìn)化成能非特異性結(jié)合眾RNA或特異性結(jié)合抗輻射相關(guān)蛋白的靶mRNA及ssDNA，呈現(xiàn)RNA的保護(hù)、穩(wěn)定與大量生成效應(yīng)的RNA輻射應(yīng)激開關(guān)。

終上所述，根據(jù)PprM結(jié)構(gòu)功能分析與預(yù)測(cè)及目前取得的研究成果進(jìn)行總結(jié)，見圖2。

圖2 預(yù)測(cè)耐輻射奇球菌PprM調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

4 展 望

本文回顧了近年來對(duì)PprM功能研究領(lǐng)域取得的成果，主要從結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測(cè)、應(yīng)激特性、分子伴侶活性與結(jié)合特性闡明了PprM在DR菌中的重要作用?？偠灾?，因PprM蛋白在熱休克下被大量誘導(dǎo)而稱為熱休克蛋白(Heat-shock protein,Hsp)，或因其具有冷休克特性而命名為Csp，或因其含有抗轉(zhuǎn)錄終止因子具有抗終止作用，輻射應(yīng)急時(shí)保護(hù)RNA，而稱之為輻射應(yīng)激蛋白，這些都只體現(xiàn)了PprM蛋白某個(gè)方面的特點(diǎn)，基于以上數(shù)據(jù)可以看出PprM蛋白不僅可以響應(yīng)高低溫壓力脅迫，而且對(duì)電離輻射、氧化、干燥等都發(fā)揮著重要的抵抗性，故將PprM命名為環(huán)境應(yīng)激蛋白，它可能充當(dāng)一個(gè)全方位的救火員，響應(yīng)各種極端環(huán)境變化。

目前，PprM在DR菌中具體的作用機(jī)制并不完全清楚，但是它在DNA損傷修復(fù)中的角色是無可代替的。眾所周知，DR菌極強(qiáng)的抗性主要在于它具有強(qiáng)大的修復(fù)系統(tǒng)，而這個(gè)系統(tǒng)是由千千萬萬的基因構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)基因都不可能單獨(dú)發(fā)揮作用。PprM既結(jié)合RNA又結(jié)合DNA，同時(shí)還有抗轉(zhuǎn)錄終止因子等特性，它可能構(gòu)成一個(gè)龐大的信號(hào)通路運(yùn)用到DR的多個(gè)修復(fù)途徑中。PprM作為環(huán)境應(yīng)激蛋白，也正在被一步步轉(zhuǎn)入到真核細(xì)胞甚至動(dòng)物體內(nèi)，觀察其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，環(huán)境應(yīng)激蛋白PprM的作用機(jī)制乃至DR菌強(qiáng)大的極端抗性網(wǎng)絡(luò)必將被人們所熟知，并能為人類抵抗?jié)撛诘妮椛湮ｋU(xiǎn)提供重要的新思路。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.026

2016-10-24；

2016-12-30

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)81272993)、南華大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(標(biāo)號(hào)2016XCX39).

*通訊作者，E-mail:heshuya8502@163.com.

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蔣湘蓮)