MiR-195對BEL-7402/5-FU細胞5-氟尿嘧啶耐藥性的影響

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(南華大學藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

MiR-195對BEL-7402/5-FU細胞5-氟尿嘧啶耐藥性的影響

楊曉燕，向瓊，殷杰，虞佳，甘潤良，雷小勇*

(南華大學藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

目的探討miR-195對BEL-7402/5-FU細胞5-氟尿嘧啶藥物敏感性的影響。方法采用qRT-PCR檢測BEL-7402細胞與BEL-7402/5-FU細胞中miR-195的表達水平。將miR-195質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染至BEL-7402/5-FU細胞；MTT檢測細胞藥物敏感性的改變。結(jié)果相比于BEL-7402細胞，miR-195在BEL-7402/5-FU細胞中表達水平下調(diào)；miR-195轉(zhuǎn)染組的細胞增殖抑制率較miRNA陰性對照組及未轉(zhuǎn)染組明顯增高。結(jié)論MiR-195能夠增加BEL-7402/5-FU細胞對5-氟尿嘧啶的藥物敏感性，抑制細胞增殖。

MiR-195； BEL-7402/5-FU細胞； 5-氟尿嘧啶； 耐藥性

原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率高且最為常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居全球惡性腫瘤的第二位[1]。目前，化療是原發(fā)性肝癌綜合治療中常用的一種方法。5-氟尿嘧啶對增殖性細胞具有殺傷性作用而作為一線藥物。它通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，進而阻斷DNA的生物合成而抑制腫瘤細胞增殖[2]。因此，在肝癌的化療方面如何提高腫瘤對化療藥物的敏感性及增強藥物療效，具有重要意義。miRNA是一類小的非編碼調(diào)節(jié)RNA分子，長度為18～25個核苷酸[3]。最近的研究證實，miRNA參與作用腫瘤細胞耐藥的過程[4]。MiR-195是miR-15/16/195家族成員之一，作為抑癌基因在腫瘤發(fā)生中起著重要作用，它可能是腫瘤治療的潛在靶點[5]。本研究利用miR-195質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染至肝癌耐藥細胞株BEL-7402/5-FU細胞中，探討miR-195在肝癌細胞化療耐藥過程中所發(fā)揮的作用，從而為逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥提供新途徑。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人肝癌耐藥細胞株BEL-7402/5-FU 細胞購自南京凱基生物有限公司，1640粉末培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清為杭州四季青生物公司，質(zhì)粒提取試劑盒為日本TAKARA 公司產(chǎn)品，脂質(zhì)體Lipofectamin2000 為美國Invitrogen產(chǎn)品，RT-PCR 試劑盒購自Promega公司，PCR 擴增體系購于上海生物工程公司。5-氟尿嘧啶為天津金耀氨基酸有限公司，MTT為Sigma 公司(將5 mg的MTT溶于0.5 mL)。

1.2 BEL-7402/5-FU細胞培養(yǎng)BEL-7402/5-FU細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640溶液中，置于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱，在培養(yǎng)液中加入0.15 mmol/L 5-FU維持耐藥性培養(yǎng)。細胞經(jīng)傳代和收集，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 qRT-PCR檢測BEL-7402/5-FU細胞miR-195表達水平qRT-PCR檢測BEL-7402/5-FU細胞與BEL-7402細胞中miR-195表達水平。采用RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄實驗流程參照RT-PCR 試劑盒的說明書進行，PCR 反應體系按照說明書要求分別加入引物：U6 和hsa-miR-195，反應條件均為：95 ℃，10 min；40個PCR 循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，60 s 收集熒光)。為了建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結(jié)束后95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；99 ℃，10 s，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(8 min) 。BEL-7402/5-FU細胞與BEL-7402細胞樣品中的miR-195 和內(nèi)參(U6) 分別進行實時定量RT-PCR 反應。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.4真核質(zhì)粒表達載體構(gòu)建與BEL-7402/5-FU細胞轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒表達載體構(gòu)建：線性化PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表達載體含有綠色熒光蛋白(GFP)從上海吉瑪公司購得?；诰€蟲miR-67(與人源的miRNA無同源性)設(shè)計陰性對照組。

質(zhì)粒提?。簩?gòu)建好的miR-195質(zhì)粒表達載體和陰性對照組表達載體(載體上含Streptomyces spectabilis耐藥篩選基因)，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌表達菌株(JM109)進行擴增，利用質(zhì)粒提取試劑盒(去內(nèi)毒素)提取質(zhì)粒，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BEL-7402/5-FU細胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000產(chǎn)品說明書進行，取對數(shù)期細胞接種于6孔板，6 000個細胞/每孔，待細胞生長至占孔面積為80%左右進行轉(zhuǎn)染。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細胞3次。制備miRNA質(zhì)粒/脂質(zhì)體復合物，6孔板每孔試劑用量如下：取10 μL脂質(zhì)體至100 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)中充分混勻，室溫靜置5 min；同時4 μg質(zhì)粒載體至100 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)中混勻，室溫靜置5 min；用移液槍將兩種混合物輕輕混合至均勻，室溫靜置20 min，此即為miRNA/脂質(zhì)體復合物。用移液槍將miRNA/脂質(zhì)體復合物輕滴入到孔中，37 ℃培養(yǎng)箱培育6 h后，每孔補加1 000 μL完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)培養(yǎng)細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，利用倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染率。

1.5 MTT檢測BEL-7402/5-FU細胞增殖變化待細胞呈指數(shù)式生長，取細胞接種于96孔板，6.0×103個細胞/孔，接種12 h后，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，96孔板每孔試劑加入量如下：取1 μL脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)至10 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)中，混勻充分，室溫靜置5 min；同時取0.4 μg 質(zhì)粒 (miR-195或miRNA陰性對照質(zhì)粒)至10 μL優(yōu)化培養(yǎng)基(OPTI_MEM)，混勻充分，室溫放置5 min；然后，將兩種混合物均勻混合，室溫靜置20 min即得到miRNA/脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)復合物。37 ℃培養(yǎng)箱培育24 h后，每孔分別加入0、0.1、1、10、100 mmol/L 5-氟尿嘧啶的完全培養(yǎng)基150 μL，再培養(yǎng)24 h后加MTT(5 g/L)20 μL/孔，再培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加DMSO 150 μL/孔，微量振蕩器振搖10 min后，在酶標儀570 nm波長下測OD值。根據(jù)公式計算：增殖抑制率=1-(試驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)，并計算各實驗組細胞的IC50值。

1.6統(tǒng)計分析所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計，單因素方差分析、方差齊性檢驗，并經(jīng)LSD 檢驗，P<0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測細胞miR-195表達水平在BEL-7402/5-FU細胞中miR-195表達較BEL-7402細胞顯著下調(diào)(比值<0.5)(見圖1)。

圖1 BEL-7402/5-FU細胞與BEL-7402細胞中miR-195的表達 與BEL-7402細胞比較，*p<0.05(n=3)

2.2倒置熒光顯微鏡檢測miR-195轉(zhuǎn)染BEL-7402/5-FU細胞的轉(zhuǎn)染率質(zhì)粒表達載體測序結(jié)果表明miR-195序列位于載體122-140 bp間，確定載體構(gòu)建成功(圖2)。miR-195轉(zhuǎn)染BEL-7402/5-FU細胞后48 h，通過倒置熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染細胞的熒光情況，miR-195轉(zhuǎn)染組及陰性對照組轉(zhuǎn)染率均大于35%(圖3)。

圖2 miR-195重組PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體測序圖

圖3 倒置熒光顯微鏡檢測miR-195 轉(zhuǎn)染BEL-7402/5-FU細胞的轉(zhuǎn)染情況(×100) A:未轉(zhuǎn)染組;B:miRNA陰性對照組;C:miR-195轉(zhuǎn)染組

2.3 MiR-195聯(lián)合5-FU對BEL-7402/5-FU細胞增殖的影響MTT法觀察細胞生長的變化(見圖4)；miR-195轉(zhuǎn)染組5-氟尿嘧啶的IC50值7.5±1.43 mmol/L；未轉(zhuǎn)染組的IC5072.67±9.87 mmol/L及陰性對照組IC5068.84±8.56 mmol/L。與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較，miR-195轉(zhuǎn)染組的IC50值顯著降低。

圖4 miR-195聯(lián)合5-FU 處理對BEL-7402/5-FU細胞增殖的影響 與未轉(zhuǎn)染組&陰性對照組，*P<0.05(n=3)

3 討 論

5-氟尿嘧啶(5-FU)是肝癌及其他腫瘤化療中使用最為廣泛的藥物，然而，由于腫瘤細胞原發(fā)或繼發(fā)的耐藥性，化療的效果差強人意。其耐藥性涉及細胞的多種生化改變，包括耐藥相關(guān)基因表達升高、藥物的蓄積降低、谷胱甘肽(GSH) 或與其代謝有關(guān)酶活性增高、細胞內(nèi)金屬硫蛋白水平升高以及DNA 修復能力增強等。因此，臨床上單用5-FU對耐藥的腫瘤細胞療效很差。為逆轉(zhuǎn)5-FU的耐藥性，人們進行過廣泛的探討，但至今尚未發(fā)現(xiàn)一種在體內(nèi)有良好逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥性的藥物。

越來越多的研究證實miRNA突變或者異常表達與多種人類癌癥發(fā)生相關(guān)，有關(guān)于miRNA的研究工作也成為近年來生命科學領(lǐng)域一個熱門的研究聚焦點。miRNA的表征有望成為腫瘤診斷和預后的生物學標記。此外，miRNA特異性調(diào)控靶基因的作用方式，可能為抗腫瘤治療提供新的方法[6]。本研究探討miRNA在化療耐藥過程中所發(fā)揮的作用，有望發(fā)現(xiàn)一個行而有效的化療策略。

本研究發(fā)現(xiàn)BEL-7402/5-FU細胞系與BEL-7402細胞系之間miRNA存在表達差異。其中某些miRNA變異與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，如miR-195[7]、miR-122[8]、miR-372[9]、miR-16等[10]miRNAs在腫瘤的生物學特性中發(fā)揮的重要作用也可能參與腫瘤耐藥。本文以BEL-7402/5-FU 為研究對象，qRT-PCR結(jié)果顯示，BEL-7402/5-FU 細胞中miR-195表達較BEL-7402 細胞顯著降低，提示miR-195與肝癌的耐藥性密切相關(guān)。本研究利用構(gòu)建的miR-195真核表達載體，調(diào)整修復了BEL-7402/5-FU細胞系中miR-195的表達水平。結(jié)果表明經(jīng)轉(zhuǎn)染后，miR-195均能增加化療藥物的敏感性，進而逆轉(zhuǎn)BEL-7402/5-FU細胞對5-FU耐藥。

這一研究提示，miR-195很可能成為抗腫瘤治療的一個有效靶點，尤其在抗腫瘤治療及腫瘤耐藥方面占據(jù)重要地位，并能夠增強BEL-7402/5-FU對5-FU化療藥物的敏感性，促進肝癌細胞凋亡，為肝癌的基因治療提供了新的途徑；為了進一步明確其逆轉(zhuǎn)耐藥的具體機制，還需要驗證miR-195對其它多種化療藥物敏感性的影響以及進行體內(nèi)成瘤動物實驗，為miR-195用于臨床打下實驗基礎(chǔ)。如果能夠成功應用miRNA作為抗腫瘤治療制劑于臨床上，雖然能夠帶來巨大的經(jīng)濟與社會效益，但是將面臨miRNA在體內(nèi)的給藥方式等障礙，因此，將基礎(chǔ)研究工作應用到臨床的生物治療有待深入探討。

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EffectsofMicroRNA-195on5-FUResistanceinBEL-7402/5-FUCells

YANG Xiaoyan,XIANG Qiong,YIN Jie,et al

(InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveThis study investigated the effect of miR-195 on 5-FU resistance in BEL-7402/5-FU Cells.MethodsqRT-PCR analyzed expression of miR-195 between BEL-7402 and BEL-7402/5-FU cells.MiR-195 was transiently transfected into BEL-7402/5-FU cells.Drug sensitivity of the cells to 5-FU was analyzed by MTT.ResultsThe expression of miR-195 was downregulated in BEL-7402/5-FU cells compared to parental BEL-7402 cells．MTT results showed that miR-195 transfected cells had a higher cell inhibition rate than untreated cells or negative control.ConclusionsMiR-195 could sensitize BEL-7402/5-FU cells to 5-FU and inhibited cell proliferation.

MiRNA-195; BEL-7402/5-FU cells; 5-FU; drug resistance

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.008

2016-04-10；

2016-09-21

國家自然科學基金資助(81372579);湖南省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生資助科研項目(B2014-048);湖南省教育廳一般課題(13C832).

*通訊作者，E-mai:1622214323@qq.com.

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蔣湘蓮)