L-異亮氨酸高效液相色譜檢測(cè)方法的研究

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(1.梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 廊坊 065001；2.廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，河北 廊坊 065001)

L-異亮氨酸高效液相色譜檢測(cè)方法的研究

唐艷1，李晶1，吳濤2

(1.梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 廊坊 065001；2.廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，河北 廊坊 065001)

L-異亮氨酸在紫外光區(qū)無(wú)吸收峰，需將其進(jìn)行衍生后才能測(cè)定.通過(guò)對(duì)比兩種柱前衍生方法，建立高效液相色譜法柱前衍生檢測(cè)L-異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法.OPA自動(dòng)衍生法檢測(cè)耗時(shí)15 min，R=1，加標(biāo)回收率99%～100.1%，RSD<1.0%；PITC手動(dòng)衍生法檢測(cè)耗時(shí)30 min，加標(biāo)回收率96%～98%，RSD<1%.OPA自動(dòng)衍生法在檢測(cè)的時(shí)效性和準(zhǔn)確性方面均具有明顯優(yōu)勢(shì)，可用來(lái)高效地檢測(cè)L-異亮氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在生物發(fā)酵、飼料添加劑、食品添加劑和制藥等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值.

異亮氨酸；高效液相色譜；OPA；自動(dòng)衍生；手動(dòng)衍生

L-異亮氨酸(L-isoleucine)是人體必需氨基酸，是支鏈氨基酸的重要一員，具有促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶和肽類激素合成等功能，在肌肉蛋白代謝中尤為重要[1]，主要用于治療神經(jīng)障礙、食欲減退和貧血等，有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能，是氨基酸輸液、氨基酸口服劑不可缺少的組分[2].此外，L-異亮氨酸被廣泛運(yùn)用于食品工業(yè)、化妝品、光化學(xué)和電化學(xué)等領(lǐng)域[3-4].L-異亮氨酸主要通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)[5]，在生產(chǎn)中準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)L-異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯得至關(guān)重要.目前，介紹L-異亮氨酸測(cè)定方法的文獻(xiàn)較少，采用紙層析法[6]、化學(xué)比色法[7]測(cè)定L-異亮氨酸準(zhǔn)確度低，使用氨基酸分析儀測(cè)定成本較高[8]，不適用于生產(chǎn)測(cè)定.筆者對(duì)比了兩種柱前衍生方法，建立了一種高效液相色譜法柱前衍生檢測(cè)L-異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

高效液相色譜儀(Agilent technologies 1200)，Mili-Q超純水機(jī)(元原科貿(mào))，電子天平(精度±0.000 1 g)(梅特勒-托利多)，真空泵磁力攪拌器、pH計(jì)FE20(梅特勒-托利多).

1.1.2 主要試劑

二水合磷酸二氫鈉(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，鄰苯二甲醛試劑(OPA)，硼酸緩沖液(安捷倫公司)，L-異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Sigma公司)，三乙胺、異硫氰酸苯酯(PITC)，蛋氨酸(生化試劑)，乙酸鈉(色譜純).

1.2 溶液的配制

1.2.1 OPA自動(dòng)衍生法

流動(dòng)相A：稱取6.24 g二水合磷酸二氫鈉，轉(zhuǎn)移到1 000 mL玻璃燒杯中，加入1 000 mL超純水，攪拌，直到所有晶體完全溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至7.80.

流動(dòng)相B：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10.

1.2.2 PITC手動(dòng)衍生法

三乙胺乙腈溶液(1 mol/L)：取三乙胺695 μL，加乙腈4.30 mL.

異硫氰酸苯酯乙腈溶液(1 mol/L)：取60 μL PITC，加乙腈4.94 mL.

流動(dòng)相A：V(乙腈)∶V(水)=80∶20.

流動(dòng)相B：乙酸鈉水溶液50 mmol/L.

1.3 樣品處理

1.3.1 OPA自動(dòng)衍生法

準(zhǔn)確稱取樣品0.100 0 g，用蒸餾水定容至200 mL，備用.

準(zhǔn)確稱取L-異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.100 0 g，用蒸餾水定容至100 mL，稀釋成不同質(zhì)量濃度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L).

1.3.2 PITC手動(dòng)衍生法

內(nèi)標(biāo)物溶液制備：準(zhǔn)確稱取蛋氨酸0.400 0 g于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容，備用.

對(duì)照品溶液制備：稱取L-異亮氨酸適量，加水溶解，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液.移取5 mL L-異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和2 mL內(nèi)標(biāo)物溶液，加水20 mL，混勻，備用.

樣品溶液制備：稱取1 g異亮氨酸成品于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容.移取5 mL樣品溶液和2 mL內(nèi)標(biāo)物溶液，加水20 mL，混勻，備用.

1.4 色譜條件

1.4.1 OPA自動(dòng)衍生色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，進(jìn)樣量0.5 μL，流動(dòng)相A為磷酸二氫鈉溶液，流動(dòng)相B為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10，流速為2 mL/min；梯度洗脫：0～1 min，0% B；1～9.8 min，57% B；9.8～10 min，100% B；10～12 min，100% B.

1.4.2 PITC手動(dòng)衍生色譜條件:

色譜柱：Hypersil 5 AA-ODS 200 mm×2.1 mm，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量3 μL.梯度洗脫條件：φ(流動(dòng)相A)∶φ(流動(dòng)相B)=24%∶76%，保持20 min；φ(流動(dòng)相A)∶φ(流動(dòng)相B)=10%∶90%，保持10 min.

1.5 操作步驟

1.5.1 OPA自動(dòng)衍生法

將樣品和標(biāo)品稀釋液過(guò)膜上機(jī)，自動(dòng)衍生化反應(yīng)，吸取硼酸緩沖液2.5 μL，樣品0.5 μL，OPA 0.5 μL，混合空氣3 μL，最大速度混合5 次，再吸取水32 μL，混合空氣18 μL，最大速度混合2 次，注入色譜柱，進(jìn)行色譜分析.

1.5.2 PITC手動(dòng)衍生法

吸取對(duì)照品溶液及樣品溶液各300 μL，分別置于1.5 mL離心管中，向每個(gè)離心管中加入三乙胺乙腈溶液150 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液150 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷600 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，用0.22 μm水相針式過(guò)濾器過(guò)濾.

待液相色譜穩(wěn)定后，取上述溶液進(jìn)行色譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 OPA自動(dòng)衍生法

2.1.1 進(jìn)樣量的選擇

采用0.2，0.5，1.0，1.5 μL進(jìn)樣量進(jìn)行衍生化反應(yīng)，其中0.5 μL反應(yīng)完全，平行測(cè)定樣品RSD<1%，其他三種RSD>2%.綜合考慮反應(yīng)程度、結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度，確定進(jìn)樣量為0.5 μL.

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用紫外檢測(cè)器測(cè)定異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在波長(zhǎng)338 nm有最大吸收峰，基線穩(wěn)定，靈敏度高，在<262 nm處無(wú)峰.綜合考慮待測(cè)組分最大吸收波長(zhǎng)、靈敏度、分離度、基線穩(wěn)定性，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm.

利用自動(dòng)衍生方法，對(duì)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)品(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L)進(jìn)行色譜分析，出峰譜圖見(jiàn)圖1，X軸為標(biāo)品濃度，Y軸為峰面積，出峰時(shí)間為7.5 min.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，線性方程為Y=1 445.024 4X-2.090 2，相關(guān)系數(shù)R2=1.

圖1 樣品出峰譜圖Fig.1 Chromatogram of the sample

圖2 自動(dòng)衍生法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Automatic derivation of L-isoleucine standard curve

按本測(cè)定方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)L-異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品作質(zhì)量分?jǐn)?shù)驗(yàn)證，測(cè)定樣品加標(biāo)回收率，確保檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)影響，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果為99.2%，樣品檢測(cè)RSD<2%，加標(biāo)回收率>99%，此方法準(zhǔn)確度高、結(jié)果可靠.具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 樣品檢測(cè)結(jié)果和回收率Table 1 Determination results and recovery of samples

2.2 PITC手動(dòng)衍生法

采用手動(dòng)衍生方法測(cè)定L-異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蛋氨酸與異亮氨酸分離度高且穩(wěn)定.選用蛋氨酸作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)計(jì)算樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，排除系統(tǒng)進(jìn)樣量不精確導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確.蛋氨酸出峰時(shí)間為10.5 min，L-異亮氨酸出峰時(shí)間為14.8 min，具體譜圖見(jiàn)圖3.

圖3 L-異亮氨酸樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of L-isoleucine sample

采用加內(nèi)標(biāo)物蛋氨酸來(lái)計(jì)算結(jié)果：加標(biāo)回收率為96%～98%，RSD<2%，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果和回收率Table 2 Determination results and recovery of the samples

3 結(jié) 論

通過(guò)上述結(jié)果可以得出：與PITC手動(dòng)衍生法相比，采用OPA自動(dòng)衍生法操作簡(jiǎn)單，引入人為誤差小，檢測(cè)耗時(shí)短，加標(biāo)回收率高，檢測(cè)結(jié)果更可靠.筆者建立的OPA自動(dòng)衍生高效液相色譜法可準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)L-異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù).

[1] 王小生.必需氨基酸對(duì)人體健康的影響[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2005(7):48-49.

[2] 姜大勇,伊廷存.氨基酸生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)果蔬,2014(10):55-58.

[3] SUZUKI M, OWA S, KIMURA M, et al. Supramolecular hydrogels and organogels based on novel, L-valine and L-isoleucine amphiphiles[J]. Tetrahedron letters, 2005,46(2):303-306.

[4] SUZUKI M, SATO T, KUROSE A, et al. New low molecular weight gelators based on L-valine and L-isoleucine with various terminal groups[J]. Tetrahedron letters, 2005,46(2):2741-2745.

[5] 龍輝.發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸的優(yōu)化與控制策略研究[D].天津:天津科技大學(xué),2014.

[6] 陳吉寶,劍振.紙層析法分離氨基酸實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化[J].南陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào),2014,13(12):28-31.

[7] 張邦建,宋文軍,張克旭.化學(xué)比色法測(cè)定發(fā)酵液中L-異亮氨酸的研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,25(2):29-32.

[8] 齊建雙,鐵雙貴,韓小花,等.氨基酸分析儀法快速測(cè)定玉米籽粒中賴氨酸含量[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014(30):199-202.

StudyonL-isoleucineanalysisbyhighperformanceliquidchromatography

TANG Yan1, LI Jing1, WU Tao2

(1.Meihua Holdings Group, Langfang 065001, China; 2.Meihua Biotech (Langfang) Co., Ltd., Langfang 065001, China)

L-Isoleucine has no absorption in the ultraviolet (UV) region and needs to be derivatized before determination by UV detector. The aim of this work is to compare the two pre-column derivatization methods: OPA automatic derivatization and PITC manual derivatization, and establish an efficient method for the determination of L-isoleucine content by high performance liquid chromatography. The total detection time with OPA automatic derivatization method took 15 minutes withR-value of 1, and the recoveries were from 99% to 100.1% with RSD<1%. The PITC manual derivatization took 30 min, with the recovery rate of 96% to 98% (RSD<1%). OPA automatic derivatization exhibited obvious advantages in the detection timeliness and accuracy, which can be used to efficiently detect L-isoleucine content. It has high application value in microbial fermentation, feed additives, food additives and pharmaceuticals.

L-isoleucine; HPLC; OPA; automatic derivatization; manual derivatization

2017-08-10

河北省氨基酸工程技術(shù)研究中心創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)資助項(xiàng)目(131000021)

唐 艷(1987—)，女，內(nèi)蒙古通遼人，助理工程師，研究方向?yàn)榘被岱治鰴z測(cè)，E-mail：1041647978@qq.com.

O657.72

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1674-2214(2017)04-0220-04

朱小惠)