Foxp3基因在肺癌并胸腔積液患者胸水中的表達(dá)及臨床意義

李京有，姜乃德，卜小琨

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院心胸外科，山東 煙臺(tái) 264006）

Foxp3基因在肺癌并胸腔積液患者胸水中的表達(dá)及臨床意義

李京有，姜乃德，卜小琨

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院心胸外科，山東 煙臺(tái) 264006）

目的研究Foxp3基因在評(píng)估肺癌并胸腔積液患者胸膜轉(zhuǎn)移的臨床意義。方法分別檢測肺癌并胸膜轉(zhuǎn)移患者胸水中脫落細(xì)胞陽性率，通過RT-PCR法對(duì)肺癌并胸腔積液患者外周血、胸水Foxp3 mRNA水平進(jìn)行檢測。結(jié)果肺癌外周血及胸腔積液中Foxp3基因表達(dá)量明顯升高；無論胸水脫落細(xì)胞是否陽性，胸膜轉(zhuǎn)移患者胸腔積液中Foxp3 基因 表達(dá)量無明顯差異，但較正常人外周血Foxp3表達(dá)量明顯升高。結(jié)論肺癌并胸腔積液患者胸水中Foxp3基因表達(dá)水平有助于胸膜轉(zhuǎn)移的評(píng)估，而且較胸水中脫落細(xì)胞檢查更為敏感。

非小細(xì)胞肺癌；胸腔積液；Foxp3基因；胸膜轉(zhuǎn)移；脫落細(xì)胞

胸腔積液是中晚期肺癌，尤其是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）最易合并表現(xiàn)之一，根據(jù)第八版國際肺癌TNM分期，腫瘤胸膜播散為M1a，提示腫瘤已進(jìn)展至局部晚期，不適宜手術(shù)治療；研究[1]發(fā)現(xiàn)，肺癌胸腔積液超過一半為惡性，少數(shù)胸水并不是腫瘤對(duì)胸膜造成直接侵犯形成，這種被稱為反應(yīng)性積液。臨床通常采用胸腔穿刺胸水脫落細(xì)胞檢查來鑒別積液的良惡性，但其陽性率受多種因素影響，胸液癌細(xì)胞總陽性率40%-87%。還有研究表明，肺癌患者體內(nèi)Foxp3+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平增高，介導(dǎo)了腫瘤患者的免疫抑制。本研究嘗試通過檢測肺癌并胸腔積液患者胸水中Foxp3基因的表達(dá)水平，評(píng)估和指導(dǎo)胸腔積液良惡性的鑒別，從而為術(shù)前腫瘤分期提供依據(jù)，將有助于治療策略的正確選擇。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集我院（煙臺(tái)開發(fā)區(qū)業(yè)達(dá)醫(yī)院）2010年-2016年肺癌合并胸腔積液患者102例，男性64例，女性48例；年齡43歲-78歲。研究對(duì)象102例，經(jīng)手術(shù)、胸腔鏡活檢及胸水脫落細(xì)胞檢查證實(shí)為肺癌并胸膜轉(zhuǎn)移患者。除外伴有免疫相關(guān)性疾病的患者，全部患者標(biāo)本選取之前都沒有接受抗癌、免疫治療，沒有糖皮質(zhì)激素使用史。胸部CT掃描發(fā)現(xiàn)伴有胸腔積液，胸水脫落細(xì)胞檢查陽性79例；陰性23例，經(jīng)手術(shù)或胸腔鏡活檢證實(shí)為胸膜轉(zhuǎn)移。另選42例健康查體者為對(duì)照組，男性19例，女性23例；年齡22歲-73歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 方法 分別抽取肺癌患者和健康對(duì)照組外周新鮮靜脈血液3 mL，用肝素抗凝。肺癌并胸腔積液患者經(jīng)胸腔穿刺抽取胸水100 mL；分別檢測Foxp3基因表達(dá)水平。

1.2.2 流程 將外周血、胸腔積液中單個(gè)核淋巴細(xì)胞分別通過淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）完成分離，選擇PBS液進(jìn)行2次洗滌。選取1 mL Trizol加入，提取總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度。 取樣品RNA 1 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增（PCR），將GAPDH當(dāng)作內(nèi)參照，如下詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)需要用到的引物序列、反應(yīng)條件、片段長度：Foxp3上、下游引物分別為5'-AGCAGCGGACACTCAATGAGAT-3’、5'-T T G C G G A A C T C C A G C T C A T C-3’，1 7 9 b p。G A P D H上、下游引物分別為5'-C T T A G C A C C C C T G G C C A A G-3'、5'-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3'，150 bp。具體反應(yīng)條件如下：94oC下持續(xù)2 min，94oC下變性30 s， 60oC下退火30 s，72oC下進(jìn)行1 min延長，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在120 mV 2%瓊脂糖凝膠中加入PCR產(chǎn)物5 μL，進(jìn)行大約30 min的電泳處理。電泳后將凝膠放在紫外光可見分析裝置中實(shí)施掃描，結(jié)果圖像通過軟件分析，記錄吸光度值，半定量Foxp3/GAPDH吸光度比值，每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行2次重復(fù)，結(jié)果以平均值記錄。

表1 各種患者的Foxp3+表達(dá)水平與對(duì)照組比較分析

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

胸腔穿刺胸水脫落細(xì)胞檢查陽性為79例，陽性率為77%；肺癌患者外周血及胸腔積液中Foxp3+表達(dá)量分別為（1.38±0.15）、（1.41±0.21），P＞0.05；對(duì)照組為（1.04±0.22），兩兩比較，P均＜0.05。說明肺癌患者外周血及胸膜轉(zhuǎn)移患者胸腔積液中Foxp3的表達(dá)量較對(duì)照組外周血中Foxp3的表達(dá)明顯升高；胸水脫落細(xì)胞陽性及陰性肺癌患者胸水中Foxp3+表達(dá)量分別為（1.41±0.36）、（1.42±0.32），P＞0.05；與對(duì)照組比較，P＜0.05。說明無論胸水脫落細(xì)胞是否陽性，胸膜轉(zhuǎn)移患者胸）腔積液中Foxp3基因表達(dá)量無明顯差異，但較正常人外周血Foxp3表達(dá)量明顯升高，說明比胸水脫落細(xì)胞檢查陽性率更高。

肺癌患者外周血及胸水中Foxp3+表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組；胸水脫落細(xì)胞陽性肺癌患者外周血Foxp3+表達(dá)水平與胸水脫落細(xì)胞陰性肺癌患者相比無差別。

3 討論

肺癌導(dǎo)致的胸腔積液，并非全都是腫瘤直接侵犯胸膜（腔）所致，其形成可能有以下原因：腫瘤對(duì)胸膜造成直接侵犯，使得增加了胸膜表面通透性，導(dǎo)致阻礙了淋巴回流；腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫塊對(duì)淋巴管、血管形成侵犯或者壓迫使得回流不暢，發(fā)生管腔滲漏造成；腫塊對(duì)近端支氣管造成阻塞形成肺不張、阻塞性肺炎進(jìn)而出現(xiàn)胸腔積液；低蛋白血癥、重度營養(yǎng)不良都可能導(dǎo)致出現(xiàn)漏出性胸腔積液等[2]。研究資料[3]表明，肺癌并胸腔積液患者有22%在胸膜上找不到肺癌轉(zhuǎn)移的證據(jù)。臨床上鑒別積液的良惡性，將有助于治療策略的正確選擇。

肺癌患者胸腔積液中Foxp3基因表達(dá)顯著增高，表明Foxp3+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞容易被趨化到胸腔積液，這與腫瘤組織中Foxp3+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加的結(jié)果[4]一致。有報(bào)道稱，大部分腫瘤細(xì)胞否可以進(jìn)行CCL22趨化因子的分泌，另外，F(xiàn)oxp3+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面高表達(dá)CCL22的受體CCR4[5]?？紤]是腫瘤細(xì)胞經(jīng)對(duì)CCL22分泌趨化CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞一直到腫瘤局部，這也是Foxp3+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞易趨化到肺癌胸腔積液的機(jī)制之一。

積液性質(zhì)確定的方法可以選擇電視胸腔鏡探查、胸腔穿刺胸水檢驗(yàn)、胸膜活檢、經(jīng)皮胸膜活檢等。常用的是胸水脫落細(xì)胞檢查，胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢測確定癌細(xì)胞是診斷癌性胸腔積液的標(biāo)準(zhǔn)。不過多種因素都會(huì)對(duì)陽性率形成影響：（1）廣泛的胸膜腔腫瘤侵犯使得出現(xiàn)惡性胸液，癌細(xì)胞確定更簡單；（2）病理類型不同的惡性胸液癌細(xì)胞陽性率存在明顯差異，肺鱗癌為4%-25%，肺腺癌為85%-100%；（3）復(fù)查次數(shù)、檢驗(yàn)技術(shù)、取標(biāo)本方法都可能影響陽性率，占40%-87%[6]。

我們的研究表明肺癌并胸膜轉(zhuǎn)移患者胸水中的Foxp3+表達(dá)明顯升高，較胸腔穿刺胸水脫落細(xì)胞檢查更為敏感。 脫落細(xì)胞檢查陰性且Foxp3+表達(dá)明顯升高的患者慎重手術(shù)治療，可反復(fù)送檢胸水，查脫落細(xì)胞。必要時(shí)胸腔鏡胸膜活檢，提高胸膜轉(zhuǎn)移的檢出率。脫落細(xì)胞檢查陰性且Foxp3+表達(dá)偏低的患者建議接受手術(shù)治療。

聯(lián)合胸水脫落細(xì)胞檢查及檢測肺癌患者外周靜脈血及胸腔積液中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3+基因表達(dá)水平，用以評(píng)估胸水患者胸膜轉(zhuǎn)移診斷，提高診斷陽性率。為臨床分期、制定治療方案提供參考。減少不必要的開胸手術(shù)治療。

[1] 李寶珠, 盧春玲, 禹彩霞, 等. 非小細(xì)胞肺癌患者外周血Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Foxp3基因的表達(dá)及意義[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2016, 37(22): 3410-3412.

[2] 郭凈, 劉忠達(dá), 張尊敬, 等. 非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究[J]. 中國基層醫(yī)藥,2015, 22(4): 510-513.

[3] 曾慶哲, 張浩清, 楊瑞青, 等. Dickkopf-1在肺癌相關(guān)惡性胸腔積液中的表達(dá)和臨床意義[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2016, 13(8):108-111.

[4] 唐中豪, 李敏靜, 陸運(yùn)濤, 等. 老年患者肺癌惡性胸腔積液和肺炎旁胸腔積液中FoxM1基因表達(dá)差異分析[J]. 老年醫(yī)學(xué)與保健, 2015, 21(1): 18-19, 45.

[5] 馬秦榕, 鄭錦花, 鐘玲玲, 等. 肺腺癌患者胸水中腫瘤耐藥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2016,36(13): 3193-3195.

[6] 韓娟, 顏浩, 張凌, 等. Twist蛋白、VEGF、CEA、CYFRA21-1、NSE在肺癌患者惡性胸水中的表達(dá)和應(yīng)用[J].國際呼吸雜志, 2016, 36(8): 563-567.

Expression and clinical significance of Foxp3 gene in plural effusion of the lung cancer patients with plural effusion

Jingyou LI, Naide JIANG, Xiaokun BU
Department of Cardiothoracic Surgery, Yantai YEDA Hospital Affiliated to Binzhou Medical School,Yantai 264006, China

ObjectiveTo study the clinical significance of Foxp3 gene on evaluation of plural metastasis of the lung cancer patients with plural effusion.MethodsTo respectively detect the positive percentage of exfoliated cell in plural effusion of the lung cancer with plural metastasis, Foxp3 and mRNA levels in the peripheral blood and pleural fluid of patients with lung cancer and pleural effusion were detected by RT-PCR.ResultsThe expression of Foxp3 mRNA was higher significantly in preipheral blood and plural effusion in the lung cancer patients with plural effusion.Regardless of the positive exfoliated cell in plural effusion, the expression of Foxp3 mRNA had no significant difference in plural effusion of the patients with plural metastasis, but were higher significantly than that in peripheral blood of the normal control.ConclusionThe expression of Foxp3 gene in plural effusion contributes to evaluation of plural metastasis of the lung cancer patients with plural effusion, and was more sensitive than the detection of exfoliated cell in plural effusion.

Non-small cell lung cancer; Plural effusion; Foxp3 gene; Plural metastasis; Exfoliated cell