定量核磁共振磷譜同時測定濃維磷糖漿中甘油磷酸鈉和磷酸的含量

關鍵詞定量核磁共振磷譜法；濃維磷糖漿；甘油磷酸鈉；磷酸

濃維磷糖漿（曾用名為維磷補汁）為復方制劑，臨床適用于植物神經(jīng)功能紊亂引起的頭暈目眩、精神疲倦以及低磷血癥。處方中每1000 mL 含有液狀甘油磷酸鈉21.0 g（相當于甘油磷酸鈉10.5 g）、咖啡因3.0 g、維生素B1 0.6 g、煙酸0.06 g 和磷酸0.54 g 等多種成分。其中，液狀甘油磷酸鈉（50%甘油磷酸鈉水溶液）是該制劑中磷的主要來源，磷酸為磷的次要來源，其它原輔料均不含有磷元素[1]。甘油磷酸鈉是α-甘油磷酸鈉和β-甘油磷酸鈉的混合物，其中， β 型是藥效部分，而α 型并不具備藥物活性[2]。濃維磷糖漿現(xiàn)行質量標準[3]通過熾灼、溶解、添加磷顯色劑顯色后采用分光光度法測定總磷量來控制甘油磷酸鈉的含量，對液狀甘油磷酸鈉采用添加指示液滴定法測定甘油磷酸鈉的含量[4]，這兩種方法專屬性較差，無法分析磷的具體歸屬是磷酸還是甘油磷酸鈉，或是其它未知含磷化合物[1]，也不能準確測出其中α 型與β 型甘油磷酸鈉的具體含量。有文獻報道過采用離子色譜法測定濃維磷糖漿的相關研究[1]，但離子色譜法易受基質干擾影響，需多步驟提取及凈化，耗費大量時間及試劑，也會受其它陰離子影響[5]。

定量核磁共振技術（qNMR）在藥物定量分析領域的應用越來越廣泛，多國藥典收錄了qNMR技術[6-8]。核磁共振氫譜（1H-NMR）應用實例最多，其次是核磁共振碳譜（13C-NMR），但是藥品基質中通常含31P 原子的比例遠小于1H 和13C，并且其它元素對31P 的測定無干擾，基本不存在基質效應，所以定量核磁共振磷譜（31P-qNMR）法被廣泛應用于含磷物質的定性和定量分析[9-12]。本研究建立了31P-NMR 定量測定濃維磷糖漿中甘油磷酸鈉和磷酸的方法，考察了實驗條件的影響，對所建立的方法進行了方法學驗證，并對市售的7 個不同廠家的濃維磷糖漿實際樣品進行了檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE NEO 400 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；BT25S 天平（精度萬分之一，德國賽多利斯公司）；BSA224S 天平（精度十萬分之一，德國賽多利斯公司）。

α-甘油磷酸鈉（純度67.3%，廣州佳途科技股份有限公司，批號0516-RD-0023）；β-甘油磷酸鈉（純度98%，美國Thermo Science 公司，批號A0432640）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4，純度99%，上海麥克林生化科技有限公司，批號C13983460）；六甲基磷酰三胺（HMPA，純度98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號C12590113）；重水（純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司，批號K2110675）。實驗用水為蒸餾水。

濃維磷糖漿分別購于國內6 家制藥公司（FY 公司，批號220102；ZH 公司，批號210302；MY 公司，批號211001；ST 公司，批號20211127；OTK 公司，批號210606；DF 公司，批號220404；TL 公司，批號211204）；液狀甘油磷酸鈉購于國內2 家公司（TR 公司，批號5210916、5210915、5210919、5220220；TL 公司，批號210305、210307、210106、210110、210302）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

內標溶液 準確稱取HMPA適量，加重水溶解并稀釋，配制成每1 mL中約含100mgHMPA的內標溶液。

供試品溶液 用內容量移液管移取2 mL 樣品于15 mL 離心管中，以20%（V/V）重水溶液沖洗移液管內部（1 mL， ×3），沖洗液合并至離心管中，準確移取內標溶液0.1 mL，渦旋搖勻，調至pH≈4.8（通過加入適量NaOH 溶液或HCl 溶液），即得供試品溶液。移取0.6 mL 供試品溶液轉置核磁管中，待測。

1.2.2 qNMR 測定

反門控去耦脈沖序列zgig 的脈沖時序圖和相循環(huán)圖如圖1 所示。譜寬（SW）為50 ppm（×10–6），中心頻率（O1P）10 ppm，采樣點數(shù)（TD）64 K，采樣時間（AQ）4 s，延遲時間（ D1） 30 s， 脈沖寬度（ P1） 8 μ s， 去耦功率（pl12）0.1 W，采樣次數(shù)（NS）64 次，線寬因子（LB）0.3 Hz，溫度298 K。積分前先對NMR 譜圖進行相位校正并調平基線，再選擇對應峰的積分區(qū)間，每個峰積分3～5 次，相對標準偏差（RSD）小于1%時取平均值[13]。依據(jù)中國藥典的絕對定量公式計算待測組分的含量（Ws）[14]：

其中， Wr 為內標物的質量， As 和Ar 分別為供試品特征峰和內標物定量峰的峰面積， Es 和Er 分別為待測組分和內標物的當量重量（分子量/該共振峰處的磷核數(shù)目），最后根據(jù)取樣量計算目標組分在樣品中的含量。

2 結果與討論

2.1 31P-qNMR 實驗條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 內標物的選擇

理想的內標物應具備以下特點：較高的純度，內標的定量峰與樣品的定量峰分離良好，易溶于測試溶劑，不與樣品相互作用。常見的31P-qNMR 內標物有HMPA、磷酸氫二鉀、三苯基膦和磷酸三苯酯等[5]。本研究中甘油磷酸鈉、磷酸及未知含磷雜質的化學位移在?4～1 ppm 之間，根據(jù)上述常見含磷內標物的理化性質、31P-qNMR 特征及實驗驗證，綜合考慮，選擇HMPA 作為本研究的內標物。

2.1.2 供試品溶液pH 值與磷共振峰歸屬

在實際樣品檢測過程中，研究對象P 核的化學位移會隨供試品溶液pH 值的變化而變化[15]。當供試品溶液pH 值增大時，其信號峰會向低場偏移；反之則向高場偏移。不同磷酸鹽信號峰的偏移程度不同，出現(xiàn)譜峰重疊，從而造成譜峰歸屬錯誤，影響積分準確性。在檢測多批次樣品（pH=4.1～5.1）過程中發(fā)現(xiàn)，當調節(jié)供試品溶液的pH≈4.8 時，各個磷共振峰能較好地分離，互不干擾；室溫下甘油磷酸鈉在此pH 值范圍內穩(wěn)定，未發(fā)生降解，不影響定量峰面積。通過添加已知對照品，觀察峰面積變化，對各磷共振峰進行了指認歸屬（圖2）。

2.1.3 延遲時間（D1）

通過標準序列t1irpg 測定供試品溶液中各研究對象P 核的弛豫時間T1，結果如表1 所示。根據(jù)ENFSI 定量核磁分析指導原則[16]，需設置弛豫延遲時間D1≥7T1，此時，定量分析結果準確。按照ENFSI標準，此次實驗需設置D1=64 s，但是過大的D1 會導致單次掃描時間增加，顯著延長樣品的分析檢測時間，影響分析效率。在相同NS 條件下，本研究分別考察了D1 為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50 和55 s 時各化合物的響應強度，結果見圖3。當D1 在0.1～30 s 時，各研究對象特征峰與內標物特征峰的峰面積比值（As/Ar）漸趨于平緩，在30 s 后信號無明顯差異，因此，本研究設置D1 為30 s。

2.2 方法驗證

2.2.1 精密度

按1.2.1 節(jié)方法平行配制6 份供試品溶液，在優(yōu)化的31P-qNMR 條件下進行測定，取其中1 份連續(xù)測定6 次以驗證儀器精密度，其余依次測定。α-甘油磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉和PO4 3–的定量峰面積與內標物峰面積比值（As/Ar）的RSD 為0.3%～1.1%，表明儀器精密度和方法重復性良好。

2.2.2 線性關系考察

準確稱取適量3 種對照品α-甘油磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉和Na2HPO4，配制線性考察溶液，其中， α-甘油磷酸鈉和β-甘油磷酸鈉（按C3H7PO6 2–計）濃度均分別為2.25、3.60、4.50、5.40 和6.75 mg/mL， H3PO4（按PO43?計）的濃度為0.625、1.000、1.250、1.500 和1.875 mg/mL，內標物濃度為10.134 mg/mL。采用31P-qNMR 進樣測定，以NMR 定量峰面積比（As/Ar）為橫坐標，濃度比（樣品/內標）為縱坐標，進行線性回歸。甘油磷酸根和PO43?分別在2.25～6.75 mg/mL和0.625～1.875 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，線性方程分別為：y=0.9665x?0.0118（α-甘油磷酸根）、y=0.9491x?0.0012（β-甘油磷酸根）和y=0.5293x?0.0005（PO43–），相關系數(shù)（R）均為0.9999。

2.2.3 檢出限和定量限

依照中國藥典四部通則（2020 版）規(guī)定[15]，基于顯示基線噪聲的分析方法，本研究以信噪比S/N≥3確定檢出限，以S/N≥10 確定定量限，將對照品溶液逐級稀釋，進樣檢測，結果見表2。

2.2.4 回收率

采用內容量移液管移取2 mL 樣品置于15 mL 離心管中，使用20%重水溶液沖洗移液管內部（1 mL×3），沖洗液合并至離心管中，加入0.2 mL 內標物（100 mg/mL HMPA 溶液），再精密加入高、中、低水平的對照品儲備液適量，加20%重水溶液至總體積為10 mL，渦旋混勻，使各研究組分的最終含量為80%、100%和120%。每個加標濃度平行制備3 份，依次測定，計算回收率，結果見表3。采用HMPA 內標法測定濃維磷糖漿中目標組分的平均回收率為99.8%～103.2%， RSD 為0.41%～1.98%，說明本方法精確度較好。

2.3 實際樣品含量測定

按1.2.1 節(jié)供試品溶液制備方法和1.2.2 節(jié)31P-qNMR 條件對7 個不同廠家的濃維磷糖漿樣品進行測定，計算α-甘油磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉和磷酸的含量，結果見表4。7 批樣品中甘油磷酸鈉（均以C3H7Na2O6P·5.5H2O 計）的平均含量約為0.8571% （g/mL），僅為理論含量（1.0500% （g/mL））的82%，而7 批樣品磷酸的平均含量為0.0660% （g/mL），高于處方標示量（0.0540% （g/mL））。

2.4 討論與分析

首先，采用31P-qNMR 法對7 批次濃維磷糖漿樣品涉及的其中2 家企業(yè)生產(chǎn)的液狀甘油磷酸鈉進行了分析，結果見表5。31P-qNMR 法測得原料中甘油磷酸鈉的平均含量僅為43.6%，低于48.0%～52.0%的限量標準[4]，而通過添加指示液滴定法測得的甘油磷酸鈉平均含量為49.9%。指示液滴定法通過滴加HCl 觀察溶液顏色的變化判斷滴定終點，實際上并不能區(qū)分甘油磷酸鈉和其它含磷雜質；31P-qNMR 法是對不同化學環(huán)境中的P 原子核進行分析測定，將甘油磷酸鈉與其它含磷雜質有效區(qū)分。本方法測得的甘油磷酸鈉含量僅為指示劑方法的87.4%，說明濃維磷糖漿中甘油磷酸鈉含量低的主要原因是所使用的液狀甘油磷酸鈉中甘油磷酸鈉的含量過低。

其次，由圖2 濃維磷糖漿樣品的磷譜圖可見，除了α-甘油磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉和磷酸的特征峰之外，還存在其它未知成分的含磷雜質譜峰，并且在7 批樣品中均有檢出。通過NMR 絕對定量公式對這些含磷雜質成分的含量進行計算，由于無法明確雜質具體成分，因而結果以P 元素計，結果見表6。31P-qNMR 法測得樣品的總磷量與現(xiàn)行標準采用的鉬酸鹽分光光度法測得的結果基本一致。采用本方法檢出7 批次濃維磷糖漿樣品中雜質總量占總磷量的比例約為16%。

結合文獻[17-18]及企業(yè)提供的相關工藝流程信息進行分析可知，液狀甘油磷酸鈉原料的生產(chǎn)工藝過程較簡單，各步驟反應條件寬松溫和，容易生成其它含磷化合物，如甘油二磷酸酯、二甘油三磷酸酯和二甘油磷酸酯等酯類化合物雜質。除雜提純步驟不能有效去除與甘油磷酸鈉性質相近的含磷雜質，導致產(chǎn)品的純度偏低。此外，根據(jù)濃維磷糖漿工藝流程涉及的條件，本研究進行了降解實驗，結果表明，室溫下α-甘油磷酸鈉和β-甘油磷酸鈉在酸溶液和堿溶液中均較穩(wěn)定，未降解產(chǎn)生磷酸和含磷雜質；但是，在氧化條件（1% H2O2 溶液中）下易降解成磷酸，并且隨著溫度升高，降解程度增大。

綜上，濃維磷糖漿樣品中甘油磷酸鈉實際含量偏低、磷酸含量偏高的主要原因為：（1）所使用的液狀甘油磷酸鈉原料本身純度偏低，原料生產(chǎn)過程不能有效去除含磷雜質；（2）濃維磷糖漿的生產(chǎn)工藝不當造成甘油磷酸鈉降解產(chǎn)生磷酸；（3）相關現(xiàn)行質量標準的檢測方法專屬性差，不能區(qū)分甘油磷酸鈉、磷酸及含磷雜質，導致不能有效控制甘油磷酸鈉的含量。

3 結論

基于31P-qNMR 法建立了一種可以同時分析濃維磷糖漿中α-甘油磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉和磷酸含量的方法，將本方法應用于實際濃維磷糖漿樣品和液狀甘油磷酸鈉原料的測定，發(fā)現(xiàn)存在甘油磷酸鈉含量偏低、磷酸含量偏高和原料純度低等問題。現(xiàn)行的相關質量標準存在較大的局限性，電位（酸堿）滴定法不能準確測定甘油磷酸鈉的含量，總磷量檢測不能真實評價該類含磷制劑的品質，存在較大藥品質量監(jiān)管風險。建議優(yōu)化工藝流程，改進現(xiàn)行質量標準，更有效地控制和監(jiān)管各組分含量，保障藥品質量與安全。隨著NMR 技術不斷發(fā)展進步、高靈敏度探頭的開發(fā)及核磁設備的普及， qNMR 技術顯示出廣闊的應用前景。本研究為其它含磷藥物的檢測及標準制定提供了新思路。