虎杖白藜蘆醇對人結(jié)腸癌HCT-15細胞增殖及凋亡的影響

胡旻 桑雅清

虎杖白藜蘆醇對人結(jié)腸癌HCT-15細胞增殖及凋亡的影響

胡旻 桑雅清

目的觀察虎杖白藜蘆醇對人結(jié)腸癌HCT-15細胞增殖及凋亡的影響。方法以0、25、50、100、200μmol/L白藜蘆醇作用人結(jié)腸癌HCT-15細胞24h以及50μmol/L白藜蘆醇處理HCT-15細胞0、12、24、48、72h。采用噻唑藍（MTT）法檢測白藜蘆醇對HCT-15細胞增殖的影響，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布以及細胞凋亡率，免疫印跡方法以及聚合酶鏈反應(yīng)法觀察主要的細胞周期蛋白以及基因的表達情況。結(jié)果虎杖白藜蘆醇能顯著抑制HCT-15細胞生長，并呈現(xiàn)時間-濃度依賴性。細胞形態(tài)學(xué)檢測顯示隨著藥物濃度升高，細胞明顯皺縮。流式細胞檢測顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加以及作用時間的延長，G0/G1期細胞比例明顯增加，其中0、50、100、200μmol/L白藜蘆醇處理24h后分別為（42.81±1.21）%、（49.25±0.92）%、（54.67±1.03）%、（64.24±1.17）%，50μmol/L白藜蘆醇作用0、24、48、72h后分別為（32.41±1.09）%，（48.35±1.03）%，（55.61±1.33）%，（70.24±1.43）%，各組數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。0、50、100、200μmol/L白藜蘆醇組S期細胞比例隨著濃度增大而減小，分別為（34.89±0.66）%、（31.07±1.75）%，（28.66±1.71）%，（23.65±0.62）%，各組數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫印跡法檢測顯示，白藜蘆醇以時間依賴方式下調(diào)周期蛋白cyclin D1表達，上調(diào)p21cip1蛋白以及細胞凋亡相關(guān)蛋白剪切行Caspase-3和PRAP表達。結(jié)論白藜蘆醇能明顯抑制HCT-15細胞增殖，并誘導(dǎo)其細胞凋亡，可引起HCT-15細胞的S期阻滯。

人結(jié)腸癌；HCT-15細胞；虎杖；白藜蘆醇；細胞周期；凋亡

目前臨床治療結(jié)腸癌主要通過手術(shù)切除[1]。中藥虎杖為蓼科（polygonaceae）植物虎杖（polygonum cuspidatum sieb.et zucc.）的干燥根莖，性味微苦寒，歸肝、膽、肺經(jīng)?；⒄鹊膫鹘y(tǒng)用途主要治療關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸、癓瘕、咳嗽痰多、跌打損傷、癰腫瘡毒[2]。國內(nèi)外研究者對虎杖的保肝護肝、心血管保護、降血糖、血脂以及抑制腫瘤生長作用做了廣泛研究[3]，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮主要藥效作用的成分為白藜蘆醇[2]。白藜蘆醇（resveratrol）是一種多元酚類化合物，在體內(nèi)外具有良好的抗腫瘤活性[4]。本實驗采用分子生物學(xué)技術(shù)研究白藜蘆醇抗結(jié)直腸腺癌作用機制，為臨床使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)HCT-15細胞(購自上海中科院細胞庫)用含10%胎牛血清、青-鏈霉素（各100U/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥品白藜蘆醇購自美國sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，儲存濃度為100mmol/L。細胞周期試劑盒以及MTT試劑盒購自合肥博美。實驗用抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察處于對數(shù)期生長的細胞接種到6cm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞長到80%左右時，分別用不同濃度的白藜蘆醇（0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）處理細胞24h以及50μmol/L白藜蘆醇處理0、12、24、48、72h后，將細胞培養(yǎng)皿放置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.4 細胞增殖檢測將對數(shù)期生長的細胞按照7×103個接種于96孔板的每孔中，每組設(shè)置6個平行孔。分別用不同濃度的白藜蘆醇（0、25、50、100、200μmol/L）處理24h以及50μmol/L白藜蘆醇處理0、12、24、48、72h后，每孔加入20μL MTT試劑孵育4h后，用150μL DMSO溶解，用酶標儀讀出OD值并計算細胞增殖情況。

1.5 免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)指標取不同濃度的白藜蘆醇處理的細胞加入細胞裂解液研磨15min，用BCA法測量蛋白濃度。各組不同處理的樣品分別取30μg用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別室溫孵育一抗2h后，PBST洗脫30min，孵育二抗。用ECL發(fā)光法顯色曝光，膠片用掃描儀掃描分析。

1.6 流式細胞法檢測細胞周期和凋亡用0、50、100、200μmol/L白藜蘆醇處理細胞24h后，或50μmol/L白藜蘆醇處理0、24、48、72h后收集HCT-15細胞，用70%乙醇固定4℃過夜，按通用型細胞周期試劑盒上的說明，用PI/RNase A混合液37℃孵育20min。上機分析細胞周期的分布情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s） 表示，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同濃度RSV對HCT-15細胞增殖的影響MTT檢測細胞增殖情況顯示，細胞存活率與RSV的濃度呈現(xiàn)劑量的負相關(guān)性。0、25、50、100、200μmol/L的RSV處理24h后，HCT-15細胞的存活率分別為100%、81%、58%、36%和19%；50μmol/L白藜蘆醇作用不同時間后細胞存活率分別為100%、75%、52%、40%和22%（見封二圖1）。進一步計算顯示RSV對HCT-15細胞在24h的半數(shù)抑制濃度（IC50）大約為60μmol/L。

2.2 不同濃度白藜蘆醇對HCT-15細胞形態(tài)學(xué)的影響普通光學(xué)顯微鏡觀察顯示，HCT-15細胞生長狀態(tài)發(fā)生明顯改變，隨著RSV的濃度增加，細胞數(shù)量減少且逐漸變得扁平皺縮，細胞外形變得狹長且細胞間隙增大（見封二圖2）。

2.3 不同濃度白藜蘆醇對HCT-15細胞周期的影響

流式細胞檢測顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加以及作用時間的延長，G0/G1期細胞比例明顯增加，S期和G2/M期細胞顯著減少，各組結(jié)果之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖3（封二）。

2.4 白藜蘆醇處理后對HCT-15細胞相關(guān)周期蛋白凋亡的影響免疫印跡法檢測表明，不同濃度的白藜蘆醇作用24h以及50μmol/L的白藜蘆醇處理細胞不同時間后，白藜蘆醇以濃度以及時間依賴方式下調(diào)cyclin D1表達，上調(diào)p21cip1表達。同時觀察到凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)以及BCL-2下調(diào)，剪切型PARP和Caspase-3明顯增強（見封二圖4）。

3 討論

白藜蘆醇廣泛存在于多種天然食物或藥物中，例如紅酒或者虎杖等。研究[5-8]表明，白藜蘆醇以劑量或者時間依賴性抑制多種不同類型的腫瘤細胞增殖，但其確切的抗腫瘤機制尚不清楚?？赡芘c誘導(dǎo)細胞周期阻滯[7]，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[6]、抑制細胞DNA合成[5]、影響相關(guān)細胞信號通路活性[4，8]等有關(guān)。

表1 不同濃度白藜蘆醇處理24h及50μmol/L白藜蘆醇作用不同時間的細胞周期統(tǒng)計（%±s）

表1 不同濃度白藜蘆醇處理24h及50μmol/L白藜蘆醇作用不同時間的細胞周期統(tǒng)計（%±s）

注：與0μmol/L或0h比較，*P＜0.05；與50μmol/L或24h比較，△P＜0.05；與100μmol/L或48h比較，▲P＜0.05

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本研究顯示，不同濃度的白藜蘆醇處理不同的時間對HCT-15細胞的增殖均有抑制作用，且白藜蘆醇對HCT-15細胞體外增殖抑制表現(xiàn)為時效和量效關(guān)系，白藜蘆醇可以阻滯細胞周期停留在G0/G1期。結(jié)果說明白藜蘆醇將HCT-15細胞的周期停留在G0/G1期而減少細胞進入S期轉(zhuǎn)換，這進一步解釋白藜蘆醇能夠體外抑制細胞增殖。已有實驗表明白藜蘆醇抑制食管癌細胞周期從而阻止細胞由G0/G1向S期轉(zhuǎn)化[7，9]，然而也有實驗表明，白藜蘆醇直接誘導(dǎo)細胞進入S期從而抑制DNA的合成[10]，這些不同的研究結(jié)論可能與白藜蘆醇作用的條件以及細胞環(huán)境有關(guān)。因此關(guān)于白藜蘆醇作用于細胞周期將有待于進一步確認。

白藜蘆醇對腫瘤的抑制作用除了與細胞周期阻滯有關(guān)外，還與Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)因子有關(guān)[11-12]。研究表明，Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax為促凋亡基因，二者相互作用對細胞凋亡的調(diào)控作用更依賴于Bax/Bcl-2比值[12]。Caspase-3被認為是參與細胞凋亡過程中各個環(huán)節(jié)的最終因子，Caspase-3酶活性的增強代表凋亡的增加。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇能夠顯著下調(diào)HCT-15細胞Bcl-2蛋白的表達并且上調(diào)Bax表達，從而促進Bax/Bcl-2比值升高，最終促進剪切行Caspase-3蛋白表達。該過程代表了白藜蘆醇誘導(dǎo)HCT-15細胞凋亡重要的分子機制之一。

綜上所述，本研究表明，白藜蘆醇作用于HCT-15細胞后，導(dǎo)致p21CIP表達上調(diào)，cyclin D1表達下調(diào)，細胞將被阻滯于G0/G1期。同時白藜蘆醇誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比值的升高并且促進剪切行Caspase-3升高最終促進細胞凋亡，從而抑制癌細胞的生長。

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Effect of Resveratrol on the Cell Proliferation and Apoptosis of Human Colon Cancer HCT-15 Cells

HU Min,SANG Yaqing.
Division of Chinese Medicine,the Central Hospital of Lishui,Lishui(323000),China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on the cellproliferation and apoptosis of human colon cancer HCT-15 cells.MethodsDifferent concentrations of resveratrol（25,50,100,200μmol/L）were used to treat human colon cancer HCT-15 cells,non-treatment cells served as control group.MTT assay was used to detect the effect of resveratrol on the HCT-15 cell proliferation.Morphological changes were observed under inverted phase contrast microscope.Flow cytometry was used to detect the cell cycle distribution and the percentage of apoptosis.Western blotting and polymerase chain reaction were used to observe the expression of major cell cycle proteins and genes expression.ResultsResveratrol treatment significantly inhibited the growth of HCT-15 cells in a time-and concentration-dependent manner.Cell morphology presented a shrinkage manner with the drug concentration increased.Flow cytometry showed that the percentage of G0/G1 phase in human colon cancer HCT-15 cells increased with the increasing of drug concentration for 24h（0μmol/L:42.81%±1.21%,50μmol/L:49.25%±0.92%,100μmol/L:54.67%±1.03%,200μmol/L:64.24%±1.17%）and that it also increased at the concentration of 50μmol/L resveratrol with the treatment time（0h:32.41%±1.09%,24h:48.35%±1.03%,48h:64.24%±1.17%,72h:70.24%±1.43%）,with statistically significant differences between control group and observation groups（allP＜0.05）.Resveratrol blocked the HCT-15 cells in the S phase also in a dose-dependent manner（0μmol/L:34.89%±0.66%,50μmol/L:31.07%±1.75%,100μmol/L:28.66%±1.71%,200μmol/L:23.65%±0.62%）,all with significant difference（P＜0.05）.The expression of cyclin D1 was down-regulated by resveratrol in a time-dependent manner,but the expression of cleaved caspase-3,PARP and p21cip1 proteins and genes were up-regulated.ConclusionResveratrol can inhibit the proliferation of HCT-15 cells and induce the cells to apoptosis by arresting the cells into S phase.

human colon cancer;HCT-15 cells;Polygonum cuspidatum;Resveratrol;cell cycle;apoptosis

浙江省麗水市中心醫(yī)院中藥房（麗水323000）

桑雅清，Tel：13567098114；E-mail：992436881@qq.com

（收稿：2017-04-20修回：2017-07-20）