松樹皮提取物對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

姚期，余資江，孫寶飛

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，貴陽 550025； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，貴陽 550003)

研究報(bào)告

松樹皮提取物對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

姚期1,2，余資江1*，孫寶飛1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，貴陽 550025； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，貴陽 550003)

目的探討IL-6/STAT3/miR-21在松樹皮提取物對腦缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)治療作用和機(jī)制。方法將120只KM小鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、14 d及28 d模型組、14 d及28 d治療組，每組20只，采取雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉法制作腦缺血再灌注損傷模型；治療組在處死前7 d給予松樹皮提取物原花青素灌胃治療，對照組和假手術(shù)組采用等量生理鹽水灌胃。檢測各組小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的差異及海馬組織病理學(xué)改變、白介素6、STAT3、p-STAT3蛋白、miR-21的表達(dá)水平。結(jié)果同時(shí)間節(jié)點(diǎn)治療組小鼠比模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)；治療組尼氏體排列紊亂，其中一部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)著色相對較淺，但比模型組好；28 d模型組IL-6表達(dá)水平低于14 d模型組，同時(shí)間點(diǎn)治療組海馬組織中的IL-6較模型組明顯減少；海馬組織中STAT3總蛋白含量各組間差異無顯著性(P>0.05)，同時(shí)間點(diǎn)治療組p-STAT3含量低于模型組；海馬組織中miR-21在14、28 d治療組的表達(dá)低于同時(shí)間點(diǎn)模型組，且隨時(shí)間的延長而降低。結(jié)論松樹皮提取物原花青素能通過有效抑制IL-6，顯著降低STAT3磷酸化水平，最終降低miR-21表達(dá)，從而發(fā)揮減輕小鼠腦缺血再灌注腦損傷的作用。

松樹皮提取物；原花青素；缺血再灌注損傷；學(xué)習(xí)記憶；小鼠

腦血管病作為導(dǎo)致人類死亡或生活質(zhì)量下降的三大高發(fā)疾病之一，在眾多的腦血管病中又以缺血性腦血管病最為常見[1]。目前其主要治療方案主要是爭取在最短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，其目的是盡可能的減輕缺血區(qū)域相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)缺血區(qū)域血液供應(yīng)后缺血區(qū)域神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)損傷反而較缺血時(shí)嚴(yán)重，這一病理現(xiàn)象即腦缺血再灌注損傷(CIRI)。目前發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子、STAT3、miR在CIRI這一病理生理過程中有著重要的調(diào)控作用[2-4]。松樹皮提取物中含大量原花青素(oligomeric procyanidins,OPCs)，目前研究表明原花青素對CIRI有治療作用[5]，但其作用機(jī)制尚不十分明確。本研究通過觀察松樹皮提取物原花青素治療CIRI模型小鼠，在學(xué)習(xí)記憶能力、細(xì)胞學(xué)上的差別，不同時(shí)間點(diǎn)檢測大腦海馬區(qū)組織中miR-21、STAT3、p-STAT3、IL-6表達(dá)的差別，探討松樹皮提取物中原花青素治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡清潔級成年KM小鼠120只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(黔)2012-0004】，體重20～22 g。置于室溫為(20±2)℃，濕度49%～62%環(huán)境中飼養(yǎng)，并正常飲食。

1.2 分組及動(dòng)物模型的制作[6]

將120只小鼠按隨機(jī)分組原則分為6組，即正常對照組、假手術(shù)組、14 d模型組及治療組、28 d模型組及治療組，每組20只。假手術(shù)組、14 d模型組及治療組、28 d模型組及治療組小鼠術(shù)前12 h予以禁食，術(shù)前6 h予以禁飲，以避免手術(shù)過程中誤吸導(dǎo)致死亡影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用小動(dòng)脈夾夾閉雙頸總動(dòng)脈法制作小鼠腦缺血再灌注損傷模型。當(dāng)小鼠出現(xiàn)抽搐、呼吸深慢、心跳加速提示腦缺血再灌注損傷模型制作成功。假手術(shù)組小鼠操作同上，除外雙頸動(dòng)脈夾閉過程。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]

本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，即定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，測試各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程水溫恒定在25℃左右。

1.4 標(biāo)本的收集

小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉成功后，碘伏消毒3次后，迅速斷頭并置于預(yù)先準(zhǔn)備好的冰塊上取腦，將取出的腦組織海馬CA3區(qū)分為四部分。

1.5 HE染色

常規(guī)脫水、浸泡、包埋，使用切片機(jī)將組織蠟塊做成6 μm的切片，并將切片小心貼在多聚賴氨酸玻片上，HE染色后顯微鏡觀察并照相。

1.6 miR-21的檢測[8]

取一部分標(biāo)本，以離心柱法提取總RNA，電泳得到RNA條帶，電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶，逆轉(zhuǎn)錄過程按照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer說明書方法進(jìn)行(42℃，60 min；70℃，10 min)，PCR反應(yīng)條件①預(yù)變性(95℃，30 s)；②變性(95℃，10 s)；③退火(58℃，20 s)；④延伸(70℃，1 s)；第②～④步驟循環(huán)40次，讀板。保存圖像及數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果由熒光定量分析儀自動(dòng)采集給出目的基因和參比基因的CT值，基因表達(dá)量采用實(shí)驗(yàn)組/對照組=2-△△CT進(jìn)行計(jì)算，其中△△CT=(CT目的- CT內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)-(CT目的-CT內(nèi)參)對照，通過2-△△CT計(jì)算miR-21與內(nèi)參相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)多次取其平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 IL-6的檢測

ELISA法檢測IL-6的表達(dá)。

1.8 STAT3、p-STAT3

Western Blot測定STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般行為觀察

對各組小鼠觀察發(fā)現(xiàn)：正常對照組和假手術(shù)組小鼠行為活躍、給予刺激后的反應(yīng)靈敏迅速；模型組的小鼠行為活動(dòng)明顯減少，給予刺激后明顯較正常對照組和假手術(shù)組反應(yīng)遲鈍，甚至無反應(yīng)；給予松樹皮提取物治療后28 d組小鼠行為活動(dòng)較正常對照組和假手術(shù)組差，但較模型組活潑，對外界刺激反應(yīng)較為迅速活躍，趨近于正常水平。

2.2 Morris水迷宮檢測

Morris水迷宮檢測數(shù)據(jù)見(表1)，結(jié)果顯示：(1)從小鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)來看：假手術(shù)組與正常對照組相比數(shù)據(jù)差異無顯著性(P>0.05)，對照組、假手術(shù)組小鼠的逃避潛伏期耗費(fèi)明顯比14、28 d模型組少，差異有顯著性(P<0.05)。28 d模型組小鼠逃避潛伏期成績少于14 d模型組小鼠耗時(shí)(35.54±4.29、42.46±6.21)s，差異有顯著性(P<0.05)；14、28 d給予OPCS治療后小鼠逃避潛伏期耗費(fèi)時(shí)間比同期模型組明顯減少，但數(shù)據(jù)顯示低于同期模型組(P<0.05)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：假手術(shù)組與正常對照組小鼠耗費(fèi)時(shí)間結(jié)果差異無顯著性(35.98±5.11、37.01±6.42)s(P>0.05)，與假手術(shù)組相比14 d和28 d缺血再灌注模型組小鼠穿越原平臺所在象限時(shí)間明顯降低(18.31±2.91、26.91±4.23)s，差異有顯著性(P< 0.05)，說明經(jīng)歷腦缺血再灌注損傷后小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能明顯降低，這其中以14 d模型組小鼠成績降低最為明顯；實(shí)驗(yàn)小鼠給予松樹皮提取物原花青素治療后比同期模型組小鼠記憶能力有所好轉(zhuǎn)，差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 HE染色

小鼠腦缺血再灌注損傷后海馬CA3區(qū)HE染色顯示假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，并可見散在的、淺染的突起，表明其兩組神經(jīng)細(xì)胞無凋亡。而14 d模型組不但在數(shù)量上明顯減少、排列紊亂，而且出現(xiàn)胞質(zhì)淺著色，甚至出現(xiàn)胞核移位現(xiàn)象；14 d治療組鏡下也可見排列紊亂、胞質(zhì)淺著色及胞核移位現(xiàn)象，但在數(shù)量上要比14 d模型組少(圖1)。

2.4 小鼠海馬組織中IL-6的測定

各組海馬組織中IL-6結(jié)果顯示如(表2)，假手術(shù)組與正常對照組檢測結(jié)果差異無顯著性(P>0.05)，模型組小鼠海馬組織中IL-6表達(dá)同假手術(shù)組、正常對照組小鼠相比，14、28 d模型組海馬組織中IL-6明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)，表明缺血再灌注損傷后炎性因子表達(dá)增強(qiáng)，其中14 d模型組IL-6升高更為明顯，結(jié)果顯示模型組與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05)；經(jīng)給予7 d松樹皮提取物原花青素治療后發(fā)現(xiàn)治療組小鼠海馬組織中IL-6 水平均低于同期模型組，差異有顯著性(P<0.05)。

表1 各組小鼠Morris水迷宮檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Tab.1 Learning-memory abilities determined by Morris water maze test

注：▲P<0.05，vs正常組；■P<0.05，vs 14 d模型組；★P<0.05，vs 28 d模型組。
Note.▲P<0.05,vs the normal control group;■P<0.05,vs the 14 d model group;★P<0.05,vs the 28 d model group.

表2 各組小鼠海馬組織勻漿中IL-6的比較Tab.2 Comparison of the total IL-6 in hypocampal tissue homogenates of different mouse groups

注：▲P<0.05 vs正常組；■P<0.05 vs 14 d模型組；★P<0.05 vs 28 d模型組。
Note.▲P<0.05 vs the normal control group;■P<0.05 vs the 14 d model group;★P<0.05 vs the 28 d model group.

注：A.假手術(shù)組; B.14 d模型組; C.14 d治療組。圖1 三組海馬區(qū)CA3區(qū)HE染色結(jié)果比較(×200)Note.A.Sham group; B.14 d model group; C.14 d treatment group.HE staining.Fig.1 Comparison of the pathological changes of CA3 region in the hippocampus of the three mouse groups

2.5 STAT3蛋白的表達(dá)

STAT3、p-STAT3目的蛋白表達(dá)的灰度值與β-actin灰度值比對結(jié)果可見(圖2、圖3)。各組間總STAT3蛋白含量差異無顯著性(P>0.05)。假手術(shù)組海馬組織中的p-STAT3蛋白含量與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，14、28 d模型組小鼠海馬組織p-STAT3的蛋白含量明顯高于假手術(shù)組，差異具有顯著性(P<0.05)，14 d模型組小鼠海馬組織p-STAT3蛋白含量高于28 d模型組；14、28 d治療組海馬組織p-STAT3蛋白含量與同時(shí)期模型組比較均降低，各實(shí)驗(yàn)組間差異均具有顯著性(P<0.05)。

注：A.正常組；B.假手術(shù)組；C.14 d模型組；D.14 d治療組；E.28 d模型組；F.28 d治療組。(下圖同)圖2 各組蛋白印跡檢測總STAT3表達(dá)比較Note.A.Normal control group; B.Sham group; C.14 d model group; D.14 d treatment group; E.28 d model group; F.28 d treatment group.(The same in the following Figures)Fig.2 Comparison of total STAT3 expression determined by Western blot

圖3 各組蛋白印跡檢測p-STAT3表達(dá)比較Fig.3 Comparison of p-STAT3 expression detected by Western blot

2.6 各組小鼠海馬組織中miR-21的相對定量表達(dá)水平

假手術(shù)組海馬組織miR-21含量與正常對照組比較差異無顯著性(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，14、28 d模型組小鼠海馬組織miR-21的含量顯著高于假手術(shù)組，差異均有顯著性(P<0.05)，14 d模型組小鼠海馬組織miR-21含量高于28 d模型組；14、28 d治療組海馬組織miR-21含量與同時(shí)期模型組比較均降低，各實(shí)驗(yàn)組間差異均具有顯著性(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組小鼠海馬CA3區(qū)組織勻漿中miR-21的比較Fig.4 Comparison of the total miR-21 in the hypocampal CA3 region tissue homogrnates of different mouse groups

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理性變化，其涉及到的細(xì)胞因子及相互機(jī)制較為復(fù)雜，探尋一種能有效減輕或預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥物或方法，是改善缺血性腦血管病患者預(yù)后的關(guān)鍵問題之一。

腦缺血早期TNF-α分泌量會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)呈上升趨勢[9]，TNF-α又能參與和誘導(dǎo)IL-6的合成。細(xì)胞中IL-6不但能夠通過激活STAT3信號通路而發(fā)揮對miRNA-21表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[10]，IL-6還對神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞有著不可忽視的損傷[11]。Yamashita等[12]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：使用IL-6受體單克隆抗體阻斷劑后發(fā)現(xiàn)：小鼠大腦缺血區(qū)組織中的p-STAT3含量明顯減少，缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡大為減少、梗塞面積明顯縮小、相應(yīng)區(qū)域的功能損傷明顯減輕，這說明阻斷STAT3的活化在CIRI過程中可能具有神經(jīng)保護(hù)作用，考慮抑制p-STAT3的表達(dá)與減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

JAK-STAT通路是1992年由Sehindle在研究干擾素時(shí)發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT通路是由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族組成，是以激活STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，它參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、增殖、分化等過程，并在一些疾病(如腫瘤、缺血性腦病、腦缺血再灌注損傷等)的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。羅云波[13]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：腦缺血再灌注損傷后IL-6與IL-6R結(jié)合，使JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路激活，從而促使STAT3磷酸化，最后p-STAT3的表達(dá)增高。目前有研究表明JAK/STAT通路的激活還會(huì)使星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的，嚴(yán)重影響了神經(jīng)功能的恢復(fù)[14]。

MicroRNA(miRNA)是一種廣泛存在于從各種生物中的、長度為22個(gè)核苷酸長度的、高度保守的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，其不具有開放閱讀框、不編碼蛋白質(zhì)，但卻有高度的穩(wěn)定性，廣泛的參與細(xì)胞的生長、凋亡等過程，具有一定的原癌基因活性，與炎癥這一病理過程密切相關(guān)。一直以來miR-21表達(dá)增加被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但根據(jù)最近虞莉娜等[15]通過檢測64名急性腦梗死患者血清中miR-21-5p、IL-6發(fā)現(xiàn)：IL-6與miR-21-5p的表達(dá)呈正比關(guān)系，miR-21-5p的高表達(dá)組的患者人群預(yù)后遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于低表達(dá)組，顯然在缺血性腦病這一疾病中miR-21的抑制細(xì)胞凋亡功能并未發(fā)揮主要作用。我們通過回顧miR-21與一些疾病(如：炎性腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性腦脊髓膜炎)的關(guān)系，我們不難發(fā)現(xiàn)在miR-21在這些疾病的病變部位和外周血中表達(dá)明顯升高。其作用機(jī)制可能為：過表達(dá)的miR-21可以促進(jìn)炎性因子(如：IL-6、TNF-α等)的分泌，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[16]。

松樹皮提取物原花青素屬于生物類黃酮，具有廉價(jià)、天然、易獲得、無明顯致癌性和副作用的特點(diǎn)，目前普遍認(rèn)為OPCs具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基功能，對炎癥因子的表達(dá)也有抑制功能。已有研究表明松樹皮提取物原花青素可能通過多種途徑減輕腦缺血再灌注損傷。細(xì)胞凋亡是CIRI的關(guān)鍵，通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡是改善缺血性腦血管病預(yù)后的途徑之一。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們推測松樹皮提取物原花青素治療小鼠腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制最終與miR-21的表達(dá)有關(guān)，目前尚未見OPSc治療腦缺血再灌注損傷中IL-6、STAT3、miR-21之間相互作用途徑的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷能夠引起炎癥因子IL-6表達(dá)增高，從而刺激小鼠腦內(nèi)海馬結(jié)構(gòu)炎癥反應(yīng)，且腦缺血再灌注損傷所引起的細(xì)胞炎性因子IL-6水平升高又可促進(jìn)STAT3激活，進(jìn)而上調(diào)miR-21表達(dá)水平，其可能是導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶能力損傷的原因之一。松樹皮提取物能抑制IL-6水平，進(jìn)而抑制STAT3激活，致miR-21表達(dá)降低，減輕炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。相信隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展、miRNA研究的深入，OPCs治療CIRI的作用機(jī)制將能得到更進(jìn)一步的明確，這也為對腦缺血再灌注損傷的治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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Protectiveeffectsandmechanismofpinebarkextractoncerebralischemiareperfusioninjuryinmice

YAO Qi1,2,YU Zi-jiang1*,SUN Bao-fei1

(1.Department of Anatomy,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China； 2.Department of ENT,The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550003)

ObjectiveTo investigate the role of IL-6/STAT3/miR-21 in the treatment of cerebral ischemia reperfusion injury in mice by pine bark extract.Methods120 KM mice were randomly divided into normal control group,sham operation group,14 d and 28 d model groups,14 d and 28 d treatment groups,each group with 20 mice.The model of cerebral ischemia-reperfusion injury model was made by bilateral common carotid artery occlusion.The mice in the treatment group were treated with pine bark extract procyanidins by intragastric administration for 7 days before the execution.The control group and sham operation group were treated with normal saline.The differences in learning and memory abilities and histopathological changes in the hippocampus of mice in each group were examined.The levels of interleukin 6,STAT3,p-STAT3 and miR-21 were measured.ResultsThe learning and memory abilities of the mice in the treatment group were higher than that in the model group at the same time points.The treatment group had less irregularity in the arrangement of Nissl body,irregular shape of the cells,with relatively lighter cytoplasmic staining,but was better than the model group.The expression level of IL-6 in the 28 d model group was lower than that in the 14 d model group,The IL-6 in the hippocampus of the treatment group was significantly lower than that in the model group at the same time point.There were no significant differences in the contents of total STAT3 protein in the hippocampus between the groups (P>0.05).The expression of p-STAT3 in the treatment group was lower than model group at the same time point.The expression of miR-21 in the hippocampus of 14 d,28 d treatment groups was lower than that in the model group at the same time point,and decreased with time.ConclusionsThe procyanidins extracted from pine bark may effectively inhibit IL-6,then the phosphorylation level of STAT3 is significantly decreased and finally decreases the expression of miR-21,so as to alleviate the cerebral ischemia reperfusion injury in mice.

Pine bark extract; Procyanidins; Ischemia reperfusion injury; Learning and memory; Mice

Yu Zi-jiang.E-mail: yzj0112@126.com

姚期(1982-)，男，本科，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉方面的研究。Email: yaoqi578@163.com

余資江(1968-)，男，博士，教授，主要從事神經(jīng)損傷與修復(fù)方面的研究。Email: yzj0112@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0632-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.008

2017-07-31