新疆阿勒泰冷水魚屎腸球菌耐藥性及耐藥機(jī)理研究

肖何 張艷 王永瑞 倪永清

（新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

魚類含有很多促進(jìn)人類健康的化合物，如優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，維生素（A、D、E和B12），硒和碘以及對(duì)心臟有益的多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸對(duì)心律失常，癌癥和高血壓患者非常有益，并且在維持神經(jīng)功能和預(yù)防某些精神疾病方面發(fā)揮重要作用［1］。其中，生活在水溫常年低于20℃的額爾齊斯河流域的新疆冷水魚類，因其肉質(zhì)鮮美和獨(dú)特的口感廣受消費(fèi)者青睞。因此，野生冷水魚類已經(jīng)不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的消費(fèi)需求，人們開始對(duì)冷水魚進(jìn)行人工養(yǎng)殖。然而，為了預(yù)防和治療在漁業(yè)養(yǎng)殖中發(fā)生的疾病，抗生素被廣泛應(yīng)用于漁業(yè)產(chǎn)品。研究顯示發(fā)展中國(guó)家90%的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)存在抗生素使用監(jiān)督不完善，這導(dǎo)致抗生素污染水體，此外，水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)通常位于河口，來自人類和動(dòng)物糞便中的抗生素耐藥菌株便也會(huì)污染水體［2-3］。水中抗生素殘留的選擇性壓力會(huì)誘導(dǎo)抗生素耐藥菌的形成，因此，水生環(huán)境中的抗生素殘留是一個(gè)潛在的危害。水中生活的魚類是較容易受到生存水體污染的漁業(yè)產(chǎn)品，如棲息于水中的耐藥細(xì)菌等，而食源性耐藥細(xì)菌可以通過食物鏈在人類腸道定殖，這使得漁業(yè)產(chǎn)品中抗生素耐藥性的問題很令人關(guān)注。

Enterococcus是一種能夠耐受許多極端環(huán)境［4］，且自然界廣泛分布的細(xì)菌，如植物、動(dòng)物（包括人類）胃腸道、土壤、海水、淡水及其他廢水等［5-7］。不僅如此，腸球菌通過質(zhì)粒、染色體或攜帶抗性基因的轉(zhuǎn)座子，能夠快速高效的獲得對(duì)幾乎所有臨床用抗生素的耐藥性［8］。如臨床開始使用氯霉素，紅霉素和四環(huán)素后，腸球菌很快就出現(xiàn)了對(duì)它們的耐藥性，在某些案例中甚至達(dá)到了阻止了它們?cè)谂R床上基于經(jīng)驗(yàn)主義治療的使用。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署將腸球菌作為水體污染程度的指示菌［9］，因此，腸球菌是一種較為理想的用來評(píng)估漁業(yè)產(chǎn)品抗生素耐藥性的指示菌。本研究以E. faecium為代表性菌株對(duì)新疆阿勒泰的冷水魚進(jìn)行抗生素耐藥及毒力因子的檢測(cè)，評(píng)估其食品安全性，以期為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的抗生素耐藥性擴(kuò)散問題的評(píng)估提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌株 39條新疆冷水魚類購(gòu)買于阿勒泰水產(chǎn)品零售商店（全部為當(dāng)天捕獲），包括1條細(xì)鱗鮭；1條高白鮭；3條溪紅點(diǎn)鮭；2條歐洲丁鱥；1條大麻哈魚；1條長(zhǎng)頜白鮭；1條東方歐鳊；5條貝爾加雅羅魚；2條赤眼鱒；1條黑斑狗魚；1條白斑狗魚；2條河鱸；3條梭鱸；2條異育銀鯽；3條江鱈；1條紅尾魚；1條哲羅鮭；3條鯽魚和3條草魚。標(biāo)記后于4℃車載冰箱內(nèi)冷藏，12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。藥敏實(shí)驗(yàn)用質(zhì)控菌株Enterococcus faecium（CGMCC 1.2136）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良MRS培養(yǎng)基主要成分為葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏 10 g、酵母浸提物5 g、檸檬酸二胺 2 g、磷酸氫二胺2 g、乙酸鈉5 g、MgSO4.7H2O 0.58 g、MnSO4.4H2O 0.25 g、 吐 溫 -80 1 mL、蒸餾水1 000 mL（調(diào)pH 6.2-6.4）；腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（BAA）培養(yǎng)基購(gòu)自于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 12種藥敏紙片購(gòu)自于英國(guó)OXOID；PCR 反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自于上海生工生物工程有限公司；擴(kuò)增引物均購(gòu)自于上海捷瑞生物工程有限公司；DNA 分子量 maker 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機(jī)為Fresco21型（德國(guó)Thermo公司）；PCR儀為德國(guó)Biometra公司Tprofessional；凝膠成像系統(tǒng)為法國(guó)Vilber多功能成像系統(tǒng)；水平電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司PowerPac Universal。

1.2 方法

1.2.1 腸球菌分離純化 75%（V/V）酒精擦拭整個(gè)冷水魚體，超凈工作臺(tái)中解刨冷水魚，移出整個(gè)腸道；75%（V/V）酒精擦拭整個(gè)腸道的外表面，滅菌解剖剪剖開腸道，收集腸道內(nèi)溶物和粘液。稱取1 g內(nèi)溶物和粘液與99 mL無菌生理鹽水混勻，后取0.1mL勻漿進(jìn)行梯度稀釋后，涂布在MRS，M17，BAA 3種固體培養(yǎng)基上，置于16℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 d后，連續(xù)轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3次后得到單菌落。

1.2.2 菌株 DNA 的提取 采用urea-SDS-NaOH方法提取菌株DNA［10］，保存至-20℃即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 屎腸球菌種、屬鑒定 將革蘭氏染色陽性，接觸酶試驗(yàn)陰性且鏡檢下細(xì)胞形態(tài)為球狀的細(xì)菌用Enterococcus sp引物擴(kuò)增［11］，確定其為Enterococci屬，以模式菌E. faeciumCGMCC 1.2136為陽性對(duì)照，再采用E. faecium的種引物擴(kuò)增［10］，確定到具體種（表 1）。

表1 種屬鑒定特異性引物

1.2.4 16S rRNA基因測(cè)序及數(shù)據(jù)處理 采用通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（25 μL）：2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L 27F 0.5 μL，10 μmol/L 1492R 0.5 μL，100 ng/μL DNA 模板 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35 次循環(huán) ；72℃ 10min。取 3 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的片段的電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列的搜索，與GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的近緣菌株序列比較，序列的同源性大于等于99%，則可認(rèn)為菌株為該種。

1.2.5 藥敏性測(cè)定 利用K-B紙片法進(jìn)行藥敏性測(cè)定，藥敏紙片：氨芐青霉素（AMP，10 μg）、青霉素（P，10 IU）、慶大霉素（CN，120 μg）、鏈霉素（S，300 μg）、萬古霉素（VA，30 μg）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg）、 四 環(huán)素（TE，30 μg）、紅 霉 素（E，15 μg）、呋喃妥因（F，300 μg）、利奈唑胺（LZD，30 μg）、氯霉素（C，30 μg）、奎奴普?。≦D，15 μg）。結(jié)果參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)將供試菌判讀為敏感、中介和耐藥3種。

1.2.6 PCR檢測(cè)紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素和萬古霉素耐藥基因［11-14］耐藥基因引物序列及退火溫度如表2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系 25 μL，2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L 引物各 0.5 μL，100 ng/μL DNA 模板 1 μL，ddH2O 10.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，合適溫度1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

表2 耐藥基因引物序列及相應(yīng)退火溫度

1.2.7 PCR檢測(cè)毒力基因 毒力基因引物序列［15］及相應(yīng)退火溫度見表3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系 25 μL，2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引 物 各 0.5 μL，100 ng/μL DNA 模 板 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，合適溫度1 min，7℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

表3 毒力基因引物信息及相應(yīng)退火溫度

2 結(jié)果

2.1 腸球菌分離與鑒定

經(jīng)鏡檢、革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)及種屬特異性引物PCR擴(kuò)增，從39條冷水魚的腸道中分離到13株屎腸球菌（表4）。16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過比對(duì)確定為屎腸球菌。13株屎腸球菌中有5株菌來自3條溪紅點(diǎn)鮭，4株菌來自1條高白鮭，3株菌來自2條異育銀鯽，最后1株來自1條歐洲丁鱥；其余冷水魚腸道未分離到屎腸球菌。

2.2 屎腸球菌對(duì)12種常見抗生素的敏感性

13株屎腸球菌對(duì)12種抗生素的敏感性如表5所示。13株屎腸球菌都對(duì)氨芐青霉素、青霉素G、慶大霉素、萬古霉素、四環(huán)素、紅霉素、呋喃妥因、利奈唑胺和奎奴普丁/達(dá)福普敏感。除屎腸球菌YEY1-1和YMY1-1外，其余11株屎腸球菌均對(duì)環(huán)丙沙星中介（即中度敏感）。此外，屎腸球菌MQ-1和EQ1-1對(duì)鏈霉素中介（即中度敏感）。

表4 13株屎腸球菌的具體來源信息

2.3 13株屎腸球菌中相關(guān)耐藥基因的分布

四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、紅霉素和萬古霉素耐藥基因在屎腸球菌中的分布如表6所示。屎腸球菌都不攜帶氨芐青霉素耐藥基因Bla、紅霉素耐藥基因ermB、ermC及萬古霉素耐藥基因vanA、vanB、vanC1和vanC2-C3。所有屎腸球菌都攜帶環(huán)丙沙星耐藥基因gyrA，甚至有2株屎腸球菌同時(shí)攜帶另一個(gè)環(huán)丙沙星耐藥基因parC。在5個(gè)四環(huán)素耐藥基因中，屎腸球菌都對(duì)tetS和tetO的PCR結(jié)果呈陰性，此外僅有1株屎腸球菌攜帶tetK基因，4株屎腸球菌同時(shí)攜帶tetM和tetL基因，還有1株屎腸球菌僅攜帶tetL基因。

表5 十三株屎腸球菌對(duì)十二種抗生素的敏感性

表6 十三株屎腸球中耐藥基因的分布

2.4 13株屎腸球菌中毒力因子的分布

13株屎腸球菌對(duì)8種毒力因子的PCR擴(kuò)增結(jié)果（表7）顯示，全部屎腸球菌不攜帶任何一種毒力因子。

3 討論

抗生素是一類主要用于治療各種細(xì)菌感染或致病微生物感染類疾病的藥物，它具有成本低、使用方便、療效顯著等特點(diǎn)，因而被廣泛使用。中國(guó)作為世界第一的水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家，每年的養(yǎng)殖產(chǎn)量為世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%左右［16］。這與其養(yǎng)殖模式有很大關(guān)系，尤其是密集型漁業(yè)養(yǎng)殖模式，但這種養(yǎng)殖模式為致病菌迅速生長(zhǎng)提供了很好的契機(jī)，導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的發(fā)病率極高［16-17］。因此，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛的應(yīng)用來控制這些疾病，使得漁業(yè)產(chǎn)品存在抗生素殘留的問題［17］?？股貧埩魰?huì)誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，因此許多關(guān)于養(yǎng)殖魚類的研究都報(bào)道了耐藥菌株［18-19］，不僅如此，臨床常用抗生素的耐藥性也在養(yǎng)殖魚類中有報(bào)道。如Broughton和Walker對(duì)廣東100條淡水養(yǎng)殖魚的研究，發(fā)現(xiàn)分離的菌株全部對(duì)紅霉素和氨芐青霉素耐藥［20］，然而本研究的冷水魚腸道屎腸球菌對(duì)所測(cè)試的抗生素均未表現(xiàn)出耐藥性。研究表明水產(chǎn)品（魚、蝦等）中的抗生素含量與其生活習(xí)性，食物鏈等級(jí)和產(chǎn)品特征有關(guān)，因此本研究中13株屎腸球菌的敏感性很可能與冷水魚生活的水層、底棲生物有關(guān)，但其具體原因有待進(jìn)一步深入研究［21］。分諾酮類藥物進(jìn)行管理和控制，其使用量在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的減少有關(guān)［23］。盡管沒有檢測(cè)到耐藥性，但屎腸球菌均攜帶環(huán)丙沙星耐藥基因，這一現(xiàn)象應(yīng)該引起人們的關(guān)注，因此，加強(qiáng)抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的合理及規(guī)范化使用很有必要。

表7 13株屎腸球中毒力因子的分布

本研究腸球菌的抗生素耐藥表型及常見抗生素耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果表明冷水魚的安全性較高，不僅如此，13株菌不攜帶所檢測(cè)的任何一種毒力因子，而研究發(fā)現(xiàn)腸球菌要引起感染，必須攜帶毒力因子幫助其定殖宿主組織并逃避宿主免疫防御機(jī)制［24］，這又進(jìn)一步說明了冷水魚的安全性，因此冷水魚的消費(fèi)對(duì)消費(fèi)者身體健康并不存在安全隱患。

4 結(jié)論

應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素種類主要有喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等［16］，因此，本研究檢測(cè)了環(huán)丙沙星、四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素及氨芐青霉素的耐藥基因。其中喹諾酮類抗生素（如環(huán)丙沙星，諾氟沙星等）是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用率很高的抗生素，因此其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的檢出率很高［22］。Liu等［17］對(duì)234份中國(guó)漁業(yè)產(chǎn)品抗生素殘留的研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)漁業(yè)產(chǎn)品對(duì)6個(gè)種類的32種不同抗生素呈陽性，其中喹諾酮類抗生素是最常檢出的抗生素，分析抗生素具體種類發(fā)現(xiàn)，最少有10例研究對(duì)環(huán)丙沙星呈陽性。然而本研究中的屎腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星并未表現(xiàn)出耐藥性，該結(jié)果很可能與我國(guó)政府在2016年開始對(duì)食用動(dòng)物使用部

對(duì)13株阿勒泰冷水魚腸道屎腸球菌進(jìn)行了耐藥性、常用抗生素的耐藥基因、毒力基因的分析。13株屎腸球菌不攜帶任何毒力基因，且并未表現(xiàn)出對(duì)測(cè)試抗生素的耐藥性。此外，常用抗生素耐藥基因的整體檢出率很低。綜上所述，認(rèn)為新疆阿勒泰冷水魚食品安全性很高，對(duì)消費(fèi)者的身體健康不具有潛在危害。