基于Plackett–Burma的湖南芥菜發(fā)酵菌種高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

侯愛香，王一淇，姜輝，鄭旭，李宗軍

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基于Plackett–Burma的湖南芥菜發(fā)酵菌種高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

侯愛香，王一淇，姜輝，鄭旭，李宗軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410028)

為實(shí)現(xiàn)湖南芥菜發(fā)酵菌種的高密度培養(yǎng)，以感官評分和亞硝酸鹽含量為評價指標(biāo)，從自然發(fā)酵湖南芥菜中篩選出合適作芥菜發(fā)酵劑的LA與R6組合混合菌種和R2單一菌種。采用Plackett–Burma從11種營養(yǎng)物質(zhì)中篩選出葡萄糖、硫酸銨、胰蛋白胨、牛肉膏為LA與R6混合菌種的主要增殖物質(zhì)；乳清粉、硫酸銨、胰蛋白胨、酵母浸出粉為R2菌種的主要增殖物質(zhì)。通過布列可特—博曼(Plackett–Burma)設(shè)計(jì)方法和正交試驗(yàn)，得出LA與R6混合菌種培養(yǎng)基最優(yōu)配方是葡萄糖3%、牛肉膏1.5%、硫酸銨0.5%、胰蛋白胨1%，pH 6.0，在此優(yōu)化條件下，以3%的接種量，于33 ℃培養(yǎng)發(fā)酵21 h，菌落總數(shù)達(dá)3.62×1010cfu/mL。R2菌種最優(yōu)培養(yǎng)基配方為乳清粉4%，硫酸銨1.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母浸出粉2%，pH 6.0，在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，以3%接種量于29 ℃培養(yǎng)發(fā)酵21 h，菌落總數(shù)達(dá)1.85×1012cfu/mL。

芥菜；發(fā)酵；高密度培養(yǎng)；乳酸菌；布列可特—博曼設(shè)計(jì)方法

優(yōu)良的發(fā)酵劑是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵食品優(yōu)良品質(zhì)的重要保證，發(fā)酵菌種的高密度培養(yǎng)技術(shù)是制備優(yōu)良發(fā)酵劑的基礎(chǔ)[1]。傳統(tǒng)的湖南發(fā)酵芥菜是由芥菜自然發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)健康發(fā)酵食品，不僅具有營養(yǎng)和保健功效[2–3]，而且具有脆嫩芳香、清爽可口、回味悠久、解膩開胃等特點(diǎn)[4]，深受大眾喜愛。目前，湖南發(fā)酵芥菜是方便面、方便米粉等快餐方便食品醬料包的重要組分，市場需求量大，但芥菜供應(yīng)具有周期季節(jié)性限制，傳統(tǒng)自然發(fā)酵不易控制因素多，發(fā)酵過程中雜菌容易繁殖，且傳統(tǒng)高鹽工藝還具有亞硝酸鹽污染和危害等，所以，發(fā)酵芥菜的風(fēng)味品質(zhì)難以保證。湖南發(fā)酵芥菜常用的發(fā)酵微生物是乳酸菌。乳酸菌具有許多益生功能[5]，實(shí)現(xiàn)乳酸菌的高密度培養(yǎng)是縮短湖南芥菜發(fā)酵生產(chǎn)時間、保證產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全性、減少甚至防止亞硝酸鹽產(chǎn)生的有效途徑。Plackett– Burma設(shè)計(jì)法適合從許多考慮因素中快速地篩選出最為重要的因素[6–8]，是進(jìn)行高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化的有效方法。筆者按照湖南芥菜自然發(fā)酵過程中菌相變化的規(guī)律，在湖南自然發(fā)酵芥菜中篩出適合芥菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌——植物乳桿菌() LA、戊糖片球菌(s) R6 和腸系膜明串珠菌() R2，并將篩得菌種的單個或組合進(jìn)行人工接種，發(fā)酵芥菜，選出芥菜感官評分高的組合發(fā)酵菌種或單一發(fā)酵菌種。采用Plackett–Burma試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合正交試驗(yàn)，從培養(yǎng)基組成成分和培養(yǎng)條件兩方面進(jìn)行優(yōu)化，旨在實(shí)現(xiàn)湖南芥菜菌種的高密度培養(yǎng)，為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵芥菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

植物乳桿菌() LA、戊糖片球菌() R6 和腸系膜明串珠菌() R2，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從湖南省華容縣芥菜基地的發(fā)酵芥菜中篩選得到；鮮芥菜由湖南省華容縣芥菜基地提供；番茄汁由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制得。

蔗糖、乳糖、乳清粉(乳糖70%，蛋白質(zhì) 11%)、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨均為分析純。

MRS培養(yǎng)基[9]組分：蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母提取物 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨 2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫–80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4?4H2O 0.25 g，蒸餾水1 L。MRS培養(yǎng)基pH為6.2~6.4，121 ℃滅菌20 min。

主要儀器：超凈工作臺(安徽蚌埠市瑞風(fēng)凈化設(shè)備工程)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械執(zhí)照有限公司)；恒溫干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(jì)UV－2550 (日本島津)；電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司) 。

1.2　方法

1.2.1人工接種發(fā)酵芥菜的制備

人工接種發(fā)酵芥菜參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行制備：芥菜切塊后稱取質(zhì)量，裝壇，壓實(shí)，倒入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的食鹽，按蔬菜質(zhì)量的0.04%加入發(fā)酵菌種，蓋蓋，加水密封，25 ℃控溫發(fā)酵60 d。按照此工藝流程，將自然發(fā)酵制備的芥菜命名為Z。按以下菌種組合制作出的7個發(fā)酵芥菜產(chǎn)品命名如表1。以發(fā)酵芥菜產(chǎn)品感官評價得分和亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，篩選合適的發(fā)酵菌種。

表1　人工接種發(fā)酵芥菜的命名

1.2.2生長曲線的確定

將2%的菌種接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔3 h測定發(fā)酵液的650 nm值，確定其生長穩(wěn)定期時間[11–12]。以空白培養(yǎng)基為對照。

1.2.3Plackett–Burma試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett–Burma試驗(yàn)流程[13–18]：菌種活化，混合，將2%接種量MRS培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)18 h，將2%接種量基礎(chǔ)培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h(培養(yǎng)基不同成分選擇)，收集菌體，烘干，稱取其質(zhì)量。此階段試驗(yàn)研究選取的影響因素見表2，評價指標(biāo)為菌體干質(zhì)量。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)需要用的軟件為Design–Expert (Version 7.0，Stat–Ease Inc，M inneapolis，M N. USA)和Minitab 16。

表2　Plackett–Burman試驗(yàn)因素的編碼水平

1.2.4菌體高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成成分優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用次數(shù)=11的Plackett–Burma試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對蔗糖、乳糖、乳清粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨影響LA+6 混合菌和R2單一菌的11個因素進(jìn)行研究。按表2進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)48 h后收集菌體，干燥，稱取質(zhì)量。

采用Plackett–Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MRS培養(yǎng)基配方為原型，把原有的碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物)剔除，從碳源(葡萄糖、蔗糖、乳清粉、乳糖)中選出1種，從氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨)和促進(jìn)因子(如番茄汁)中選出3種對發(fā)酵菌種增殖最明顯的因子。

根據(jù)Plackett–Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，選碳源(X1)、氮源(X2、X3)和促進(jìn)因子(X4)為考察因素，設(shè)4個水平，采用16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以菌體干質(zhì)量為評價指標(biāo)優(yōu)化培養(yǎng)基成分。

在培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，選起始pH 值、培養(yǎng)溫度、接種量和培養(yǎng)時間為考察因素，設(shè)4個水平，采用16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以菌液650 nm為評價指標(biāo)優(yōu)化菌種的培養(yǎng)條件。

1.2.5發(fā)酵芥菜的感官評價與發(fā)酵芥菜亞硝酸鹽含量測定

芥菜發(fā)酵60 d后，按照文獻(xiàn)[17]、文獻(xiàn)[18]中的方法，由10名專業(yè)食品化驗(yàn)員針對樣品的色澤形態(tài)、香氣、滋味、質(zhì)地進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)和權(quán)重參考表3，統(tǒng)計(jì)各評審化驗(yàn)員評分的平均值。

參照文獻(xiàn)[10]的方法，分別測定不同發(fā)酵芥菜產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量。

表3　發(fā)酵芥菜感官評分的標(biāo)準(zhǔn)

2　結(jié)果與分析

2.1　發(fā)酵芥菜的感官評分和亞硝酸鹽含量

由表4可見，7組人工接種發(fā)酵芥菜的亞硝酸鹽含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵產(chǎn)品，7組產(chǎn)品之間亞硝酸鹽含量的差異不明顯，說明篩選出來的3個發(fā)酵菌株都能一定程度上降低芥菜中的亞硝酸鹽含量，其組合或單獨(dú)發(fā)酵對亞硝酸鹽含量的影響不明顯。發(fā)酵芥菜產(chǎn)品A+6和R2的得分明顯高于其他組，說明這2組產(chǎn)品的發(fā)酵菌種植物乳桿菌LA和戊糖片球菌R6組合菌，以及腸系膜明串珠菌R2適合用于發(fā)酵芥菜，因此，選用這2個產(chǎn)品的發(fā)酵菌種進(jìn)一步進(jìn)行高密度培養(yǎng)，以獲得優(yōu)質(zhì)的直投式芥菜發(fā)酵劑。

表4　不同發(fā)酵芥菜的感官評分及亞硝酸鹽含量

2.2　A+6與R2產(chǎn)品發(fā)酵菌種的生長曲線

由圖1可知，A+6發(fā)酵菌種植物乳桿菌LA和戊糖片球菌R6組合菌發(fā)酵0~3 h處于遲緩期，發(fā)酵3~18 h處于對數(shù)期，在發(fā)酵18 h時，發(fā)酵液的值達(dá)最大值；發(fā)酵時間超過18 h時，值趨于平緩，表明該混合菌此時處于穩(wěn)定期。R2產(chǎn)品發(fā)酵菌種腸系膜明串珠菌R2在發(fā)酵0~3 h處于遲緩期，發(fā)酵3~12 h處于對數(shù)期，發(fā)酵12 h時，其發(fā)酵液的值達(dá)最大值，發(fā)酵超過12 h趨于平緩，表明該菌進(jìn)入了穩(wěn)定期。

圖1　A+6與R2產(chǎn)品發(fā)酵菌種的生長曲線

2.3　培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.3.1A+6混合菌培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

由表5和表6可知，成分a、d、e、f、h、i、j、k表現(xiàn)為正效應(yīng)，成分b、c、g表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。由效應(yīng)大小可看出，對A+6混合菌增值產(chǎn)生主要正效應(yīng)的為d、f、i、j，且效應(yīng)顯著，因此，A+6混合菌的培養(yǎng)基成分宜選葡萄糖、牛肉膏、硫酸銨和胰蛋白胨。

表5　A+6和R2的Plackett–Burma 試驗(yàn)結(jié)果(n=11)

表6　A+6和R2各因素的效應(yīng)值及顯著性分析(n=11)

2.3.2R2菌培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

由表5和表6可知，成分c、d、e、g、h、i、j、k表現(xiàn)為正效應(yīng)，成分a、b、f、h表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。由效應(yīng)大小可看出，對R2菌增值產(chǎn)生主要正效應(yīng)的為c、f、g、j，且效應(yīng)顯著，因此，R2菌的培養(yǎng)基成分宜選用乳清粉、硫酸銨、胰蛋白胨、酵母浸出粉。

2.4　培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.4.1A+6混合菌培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

表7中的極差A(yù)>C>B>D>E，表明對A+6混合菌增值的影響從大到小依次為A、C、B、D、E(空白)，A+6混合菌培養(yǎng)基成分的最佳組合為A3B3C1D2，即葡萄糖3%，牛肉膏1.5%，硫酸銨0.5%，胰蛋白胨1%。

表7　A+6培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2R2單一菌培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

表8中的極差A(yù)>C>E>D>RB，表明對R2混合菌增值的影響從大到小依次為A、C、E、D、B(空白)，R2單一菌培養(yǎng)基成分最佳組合為A4C3D1E4，即最佳組合為乳清粉4%、硫酸銨1.5%、胰蛋白胨0.5%、酵母浸出粉2%。

表8　R2培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5　培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1A+6混合菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

表9中極差C>D>A>B>E，對A+6混合菌增值的影響從大到小依次為C、D、A、B、E(空白)，在正交試驗(yàn)中得到A+6混合菌培養(yǎng)條件優(yōu)化的最優(yōu)組合為A2B2C2D4，即pH 6.0，接種量3%，在33 ℃的條件下發(fā)酵21 h。對最佳組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證，得到650 nm為0.621，菌落總數(shù)為3.62×1010cfu/mL，達(dá)高密度培養(yǎng)效果，因此，認(rèn)為在pH 6.0、接種量3%、33 ℃的條件下發(fā)酵21 h為A+6混合菌的最佳發(fā)酵條件。

表9　A+6培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2R2菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

R2培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果(表10)表明，極差D>B>A>C>E，對R2菌增值的影響從大到小依次為D、B、A、C、E(空白)，R2菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化最優(yōu)組合為A2B2C1D4，即pH 6.0，接種量3%，在29 ℃的條件下發(fā)酵21 h，此時650 nm為1.904 0，菌落數(shù)為1.85×1012cfu/mL，達(dá)高密度培養(yǎng)效果。

表10　R2培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

表10(續(xù))

4　結(jié)論與討論

采用Plackett–Burma設(shè)計(jì)法，從11種營養(yǎng)物質(zhì)中篩選出了A+6混合菌的主要增殖物質(zhì)為葡萄糖、硫酸銨、胰蛋白胨和牛肉膏；R2菌的主要增殖物質(zhì)為乳清粉、硫酸銨、胰蛋白胨和酵母浸出粉。

采用Plackett–Burma試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)，得出LA+6混合菌種培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為葡萄糖3%、牛肉膏1.5%、硫酸銨0.5%、胰蛋白胨1%，pH 6.0。在此優(yōu)化條件下，當(dāng)接種量為3%、培養(yǎng)溫度為33 ℃、發(fā)酵21 h時，菌落總數(shù)達(dá)3.62×1010cfu/mL。

采用Plackett–Burma試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)，得出R2菌種最優(yōu)培養(yǎng)基配方為乳清粉4%，硫酸銨1.5% ，胰蛋白胨0.5%，酵母浸出粉2%，pH 6.0。在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，當(dāng)接種量為3%、培養(yǎng)溫度為29 ℃、發(fā)酵時間為21 h時，菌落總數(shù)達(dá)1.85×1012cfu/mL。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Optimizing the high–density culture conditions for bacteria fermentation of chinese leaf mustard based on Plackett–Burman

HOU Aixiang, WANG Yiqi, JIANG Hui, ZHENG Xu, LI Zongjun*

(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410028, China)

In order to obtain high–density cultivation condition for the fermentation of Hunan brassica juncea, mixed strains of LA and R6, and single strain R2 which were suitable for the mustard starter culture, were screened out in the natural fermentation process based on indicators of sensory evaluation and nitrite content. 11 kinds of nutrients including glucose, ammonium sulfate, tryptone and beef extract were screened out as the main proliferation substances for mixed strains of LA and R6 according the result of Plackett–Burma design method; while whey powder, ammonium sulfate, tryptone and yeast extract powder were screened out for those of strain R2. The results showed that the optimum formula for mixed culture medium of LA and R6 was consisted of 3% glucose, 1.5% beef extract, 0.5% ammonium sulfate, and 1% tryptone in pH 6.0. The total number of colonies could reach to 3.62×1010cfu/mL in the formula with conditions of 3% inoculation, 33 ℃ culture temperature, and 21 h fermentation. For strain R2, the optimum culture medium was consisted of 4% whey powder, 1.5% ammonium sulfate, 0.5% tryptone, and 2% yeast extract in pH 6.0. The total number of colonies in the formula could reach to 1.85×1012cfu/mL at the temperature of 29 ℃ for 21 h of fermentation.

mustard; fermentation; high density culture; lactic acid bacteria; Plackett–Burma design method

TS252.53

A

1007-1032(2017)06-0669-07

2017–06–21

2017–11–15

湘潭市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(NY–ZD20161003)

侯愛香( 1982—)，女，湖南臨湘人，博士研究生，講師，主要從事食品微生物技術(shù)和食品文化研究，aixianghou@163.com；

通信作者，李宗軍，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究，hnlizongjun@163.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn