中草藥抑制劑對中國對蝦致病菌哈維氏弧菌的抑制效果

樊英，蓋春蕾，王曉璐，許拉，刁菁，于曉清，葉海斌

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中草藥抑制劑對中國對蝦致病菌哈維氏弧菌的抑制效果

樊英，蓋春蕾，王曉璐，許拉，刁菁，于曉清，葉海斌*

(山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104)

用抑菌圈法和微量二倍稀釋法研究金銀花、車前草等16種中草藥提取液和納米鋅、納米銀對中國對蝦來源病原菌——哈維氏弧菌TCBS–G的抑制效果。結(jié)果表明：納米鋅對TCBS–G產(chǎn)生的透明抑菌圈直徑達(dá)35 mm，地錦的透明抑菌圈直徑約25 mm；采用96孔板倍數(shù)稀釋法測定最小抑菌濃度()，納米鋅、地錦的最小抑菌濃度均為12.5 mg/mL，納米銀的達(dá)6.25 mg/mL；采用MTT比色法檢測不同抑制劑對哈氏弧菌生物膜形成的影響，納米鋅、納米銀對TCBS–G生物膜形成具有明顯的抑制作用，藥液質(zhì)量濃度大于3.125 mg/mL時具有顯著差異(<0.05)；黃芪、地錦藥液質(zhì)量濃度大于12.5 mg/mL 時抑制作用顯著(<0.05)。普通藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌株對頭孢他啶、慶大霉素、復(fù)方新諾明等藥物極其敏感，抑菌圈直徑達(dá)20 mm以上，對頭孢氨芐、四環(huán)素等均不敏感。

中國對蝦；哈維氏弧菌；中草藥；納米鋅；納米銀；敏感性

目前，中國對蝦養(yǎng)殖品種主要有凡納濱對蝦、中國對蝦、斑節(jié)對蝦和日本對蝦。各品種養(yǎng)殖面積迅速增長，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大[1]。由于生產(chǎn)經(jīng)驗不足和可持續(xù)發(fā)展理念缺乏及養(yǎng)殖者對經(jīng)濟利益過分追求，養(yǎng)殖水質(zhì)及生態(tài)環(huán)境惡化，細(xì)菌病和病毒病等各種疾病蔓延，使蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟損失嚴(yán)重[2–3]。細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等各種病害在對蝦養(yǎng)殖過程中都有不同程度發(fā)生，細(xì)菌性疾病——弧菌病是其中危害對蝦育苗及養(yǎng)殖的重要病害之一。哈維氏弧菌()是一種條件致病菌。該菌通常在病灶處大量繁殖，使內(nèi)臟等發(fā)生嚴(yán)重病變，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖動物死亡[4–5]。

中草藥因其獨特的性質(zhì)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)越來越受到親睞。中草藥防治疾病的機理可能在于它的復(fù)雜成分。中草藥中的多糖類、生物堿類等有效活性成分既具有廣泛的抗病力，又可作為營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)動物機體的抗病因子，提高動物自身組織的防御能力和免疫功能[6–8]。筆者研究不同抑制劑對中國對蝦來源病原菌哈維氏弧菌的抑制效果，以期研發(fā)具有針對性的專用抗菌藥物或飼料添加劑，為對蝦養(yǎng)殖病害防控和實現(xiàn)綠色健康養(yǎng)殖提供參考。

1　材料與方法

1.1　供試菌株和中草藥及其他試劑

供試哈維氏弧菌從某海水養(yǎng)殖場瀕死中國對蝦病變組織(鰓、肝胰腺)中分離得到，保存于–80 ℃。納米鋅、納米銀均來自南京精德豐新材料科技有限公司。大黃()、公丁香()、雞血藤()、五倍子(–)、金銀花()、蘇木(–)、地錦()、艾草(–)、黃芩()、穿心蓮(–)、黃芪()、桑葉()、石韋()、車前草()、苜蓿()、金錢草(Forst)等均購自寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司。藥敏試劑盒購自杭州天和微生物試劑有限公司。MTT，又稱噻唑藍(lán) ，化學(xué)名為3–(4，5–二甲基噻唑–2)–2，5–二苯基四氮唑溴鹽購自Sigma。其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.2　菌液及中草藥提取液的制備

將供試菌株純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于2216E培養(yǎng)基上，28 ℃過夜培養(yǎng)，稀釋活化菌液至1.0×108cfu/mL，4 ℃保存，備用。

取16種中草藥提取物各1 g，分別用10 mL無菌水浸泡30 min，浸泡期間不斷攪拌，用雙層紗布過濾，微沸煎煮5 min滅菌，4 ℃保存，備用。

1.3　中草藥體外抑菌效果及最小抑菌濃度的測定

采用瓊脂擴散抑菌圈法判斷不同抑制劑對TCBS–G的體外抑制效果。將150 μL活化的TCBS–G均勻涂布于2216E平板，隨即放入無菌牛津杯4個(十字直徑擺放，保證每孔之間的距離不小于2 cm)，每孔加入50 μL滅菌藥液，以只涂有菌液的平板作為對照。28 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈；每孔取不同方向測量3次，取平均值。抑菌圈直徑≥20 mm 為強，以“+++”表示；抑菌圈直徑＞10～20 mm為中等，以“++”表示；抑菌圈直徑為＞3～10 mm 為弱，以“+”表示；抑菌圈直徑≤3mm 無抑菌作用，以“－”表示。

選取抑菌效果明顯的不同抑制劑 (納米鋅、納米銀、黃芪、地錦、雞血藤、天蠶素、車前草)，參照吳增華[9]的方法，用優(yōu)化的二倍稀釋法進(jìn)行測定。取無菌96孔酶標(biāo)板，每孔加入 100 μL滅菌2216E液體培養(yǎng)基；第一孔中加入100 μL無菌中草藥液，充分混勻后取出 100 μL混合液加入到第2孔中，充分混勻后再取100 μL混合液加入到第3孔，以此類推，獲得原藥液質(zhì)量濃度的 1/2、1/4、1/8，……，1/128；第8孔作為陰性對照組，加入 100 μL中草藥液后不加菌懸液，其余7孔均加入 100 μL菌懸液 (1×108cfu/mL)；將最后一行設(shè)為陽性對照組，不加中草藥液，加入 100 μL培養(yǎng)基，再加入 100 μL菌懸液，混勻后置于 28 ℃培養(yǎng) 24 h。參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)發(fā)布的水產(chǎn)細(xì)菌藥敏檢測標(biāo)準(zhǔn)(M49–A) ，將細(xì)菌存活率≤20%的最低藥物質(zhì)量濃度判定為最小抑菌濃度()。

1.4　哈維氏弧菌TCBS–G生物膜的形成及抑制劑對其形成的影響

參考黎家勤的方法[10]，將TCBS–G通過2216E液體培養(yǎng)基按1∶10和1∶100 的比例進(jìn)行稀釋，分別將稀釋好的菌懸液以每孔200 μL加入到無菌96 孔酶標(biāo)板(設(shè)3個平行)，以無菌液體培養(yǎng)基為對照，28 ℃恒溫靜置培育24、36、48 h；棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水清洗，60 ℃干燥固定，每孔加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫，室溫染色10 min，用無菌生理鹽水清洗多余染液3次；待干燥后，每孔加入200 μL 33%的乙酸充分溶解結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀測定590 nm。

研究納米鋅、納米銀、黃芪、地錦、雞血藤、天蠶素和車前草對生物膜形成的影響。TCBS–G活化菌液用2216E液體培養(yǎng)基按1∶100進(jìn)行稀釋、分裝；分別加入同體積7種不同的抑制劑，混勻，分別吸取200 μL加入到無菌96 孔酶標(biāo)板中，設(shè)3個平行，并設(shè)陽性對照(含0.1 mol/L EDTA)、陰性對照(僅含培養(yǎng)基和供試菌液) 、空白對照(僅含培養(yǎng)基)和無菌的藥物對照(僅含中草藥液和培養(yǎng)基)，倍比稀釋(1/2，1/4，1/128)后28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。待生物膜形成后，采用MTT 法檢測抑制生物膜量：將50 μL MTT 溶液(通過預(yù)溫的0.15 mol/L PBS按1∶5的比例進(jìn)行稀釋) 加入每孔中，28 ℃培養(yǎng)箱溫育5 h；棄每孔溶液，用PBS沖洗3次；每孔加入二甲基亞砜DMSO 150 μL，振蕩5 min，檢測540 nm。

1.5　不同藥物對致病菌的抑制效果

用藥敏紙片法檢測抑制效果。以無菌涂布棒將1.0×108cfu/mL菌液均勻涂布于2216E平板，將不同的藥敏紙片按照規(guī)則貼于涂布平板上，培養(yǎng)24 h后觀察，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑。

1.6　數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同抑制劑對哈維氏弧菌TCBS–G的體外抑制效果

由表1可見，納米鋅對TCBS–G的抑制作用最強，抑菌圈直徑達(dá)35 mm，其次是納米銀。這可能是納米級的鋅和銀更容易參與到細(xì)菌的代謝過程中，從而其抑菌效果比單純金屬鋅和單獨金屬銀的更好。黃芪和地錦對TCBS–G表現(xiàn)出了極強的抑制效果，抑菌圈直接均達(dá)25 mm，金銀花、五倍子、雞血藤的次之；石韋對TCBS–G表現(xiàn)出促生長現(xiàn)象?？梢?，中草藥以其復(fù)雜的成分對TCBS–G產(chǎn)生了不同的作用。

表1　不同抑制劑對哈維氏弧菌TCBS–G的體外抑制效果

“+++”示極敏感；“++”示中度敏感；“+”示敏感；“–”示不敏感。

2.2　最小抑菌濃度(MIC)檢測結(jié)果

通過二倍稀釋法測定優(yōu)勢抑制劑納米鋅、納米銀、黃芪、地錦、雞血藤、天蠶素、車前草對TCBS–G的最小抑菌濃度分別為12.5、6.25、12.5、12.5、25、25、25 mg/mL。

2.3　不同稀釋比例和不同培育時間下哈維氏弧菌TCBS–G生物膜的形成情況

哈維氏弧菌TCBS–G起始濃度不同、培育時間不同，生物膜的形成量不同。在590 nm下通過分光光度計比色法獲得其值，在稀釋比1∶10的情況下，36 h的生物膜形成量最高，590 nm為0.527 9；在稀釋比1∶100時，48 h的生物膜形成量最高，590 nm為0.586 8。對于生物膜的形成，并不是濃度越高生物膜的形成量就越高，生物膜的形成量與起始濃度和培育時間相關(guān)。本研究中選取稀釋比1∶100和培育時間48 h進(jìn)行后續(xù)試驗。生物膜的形成也與哈維氏弧菌的致病機理有關(guān)，這方面還有待研究。

2.4　不同抑制劑對哈氏弧菌TCBS–G生物膜形成的影響

由表2可見，不同濃度抑制劑對TCBS–G生物膜形成產(chǎn)生不同的抑制效果。濃度越高，抑制效果越強。當(dāng)質(zhì)量濃度大于3.125 mg/mL時，納米鋅、納米銀對TCBS–G生物膜的形成產(chǎn)生了明顯的抑制(<0.05)；當(dāng)?shù)劐\、黃芪等的濃度大于12.5 mg/mL時，可對TCBS–G生物膜的形成產(chǎn)生抑制(<0.05)，不同的抑制劑的抑制效果不同。

表2　不同抑制劑濃度下的OD540 nm

2.5　30種不同藥物對致病菌的抑制效果

由表3可見，復(fù)方新諾明、氯霉素、頭孢他啶對TCBS–G產(chǎn)生了及其敏感的抑制效果，透明抑菌圈直徑達(dá)20 mm以上；諾氟沙星、哌拉西林等的抑制作用相對較弱。

表3　 30種藥物對菌株TCBS–G的抑制效果

“+++”示極敏感；“++”示中度敏感；“+”示敏感；“–”示不敏感。

3　結(jié)論與討論

目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中預(yù)防或治療弧菌病主要使用抗生素類藥物，但治療效果并不理想，且抗生素的使用不僅使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，還會嚴(yán)重破壞水體質(zhì)量和生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而對人體健康造成危害[11]。通過中草藥等綠色安全藥物或飼料添加劑進(jìn)行病害防控是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢和需要，是藥物與營養(yǎng)價值的結(jié)合。中草藥具有殺菌、抗病毒、抗應(yīng)激、促生長、提高免疫等多重作用，且實際養(yǎng)殖過程中殘留少，不產(chǎn)生耐藥性[12–16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同中草藥對中國對蝦哈維氏弧菌TCBS–G產(chǎn)生的體外抑制作用不同，黃芪、地錦產(chǎn)生了較強的抑菌作用，能明顯抑制TCBS–G的生長。這可能是因為不同中草藥的主要活性成分不同，不同活性成分與病原菌產(chǎn)生了不同的拮抗作用(其具體抑制機理有待研究)。飼料中添加鋅對凡納濱對蝦養(yǎng)殖具有很強的促進(jìn)作用[17]。天蠶素抗菌肽具有殺菌效率高、穩(wěn)定性好、免疫原性低、不易產(chǎn)生耐藥性、產(chǎn)率高等優(yōu)點，是無毒、無害、無殘留的綠色產(chǎn)品，是新一代抗生素的替代品[18]，本研究中納米鋅和天蠶素對TCBS–G均產(chǎn)生了明顯的抑制作用，實際應(yīng)用中納米鋅和天蠶素的使用時間、使用劑量及應(yīng)用方式等還有待研究。

哈維氏弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要致病菌之一，它在水體中主要以生物膜的形式生存。生物膜是細(xì)菌聚集、粘結(jié)在一起分泌的黏性物質(zhì)，在環(huán)境中形成的一層黏膜狀物質(zhì)，能保護細(xì)菌對抗外界侵犯，增強其對抗菌藥物的抵御能力[19–20]。本實驗室分離獲得的哈維氏弧菌TCBS–G在生長過程中即形成生物膜，不同抑制劑以其不同成分對TCBS–G生物膜形成發(fā)揮影響。納米鋅作為一種新生材料，比金屬鋅制劑發(fā)揮的作用更大。質(zhì)量濃度100 mg/mL的納米鋅對TCBS–G生物膜的形成產(chǎn)生了極顯著的抑制作用(<0.05)；隨著質(zhì)量濃度的降低，納米鋅對TCBS–G生物膜形成的抑制作其減小，當(dāng)質(zhì)量濃度小于3.125 mg/mL時，納米鋅對TCBS–G生物膜的抑制作用與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。黃芪、地錦、雞血藤等中草藥液也抑制了TCBS–G生物膜的形成。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Effects of different inhibitors onfrom

FAN Ying, GAI Chunlei, WANG Xiaolu, XU La, DIAO Jing, YU Xiaoqing, YE Haibin

(Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104, China)

The inhibitory effects of,and other 16 herbal extracts and nano–zinc, nano–silver on(TCBS–G) fromwere studied by means of disc agar diffusion and micro double dilution methods. The results showed that nano–zinc had a strong inhibitory effect on TCBS–G with the diameter of 35 mm inhibition zone, followed bywith the diameter of 25 mm. Theof nano–zinc anddetected on 96 well plates via multiple dilution method was 12.5 mg/mL, the value was 6.25 mg/mL for that of nano–silver. From the test of different inhibitors on biofilm formation ofby mean of MTT assay, we found that the inhibitory effect of nano–zinc on the formation ofbiofilm was significant, especially when the solution concentration was above 3.125 mg/mL (<0.05), and there were also significant effects forand,when their concentration were above 12.5 mg/mL (<0.05). The result from susceptibility test of general drugs showed that the TCBS–G was very sensitive to Ceftazidime, Gentamicin, compound Sulfamethoxazole with less than 20 mm diameter of inhibition zone, however, it was not sensitive toCephalosporinsTetracycline etc.

;; herbal; nano–zinc; nano–silver; sensitivity

S945.1+9

A

1007-1032(2017)06-0657-05

2017–06–12

2017–11–07

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項基金(CARS–47)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蝦蟹類產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT–13)

樊英(1980—)，女，碩士，副研究員，主要從事水產(chǎn)動物養(yǎng)殖及病害防控研究，fy_fy123@126.com；

通信作者，葉海斌，副研究員，主要從事水產(chǎn)動物養(yǎng)殖及病害防控研究

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn