水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量的影響

官玲亮，夏奇峰 ,2，龐玉新，于福來(lái)，黃梅，陳振夏

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水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量的影響

官玲亮1，夏奇峰1 ,2，龐玉新1，于福來(lái)1，黃梅1，陳振夏1

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 571737；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/貴州省中藥材重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

以艾納香為試材，用水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(各設(shè)濃度10、1、0.1、0.01 mmol/L)分別噴施艾納香葉片(嫩葉、成熟葉、老葉)，以噴施去離子水為對(duì)照，探索不同濃度SA、茉莉酸甲酯(MeJA)對(duì)艾納香葉片中左旋龍腦(L–龍腦)和總黃酮含量的影響效果。結(jié)果表明：除10 mmol/L MeJA處理外，其他濃度的MeJA處理艾納香嫩葉后，L–龍腦含量均在72 h達(dá)到最大值；用1.0 mmol/L MeJA處理成熟葉，L–龍腦在72 h達(dá)到最大值(3.043 mg/g)，顯著高于對(duì)照；除0.01 mmol/L MeJA處理外，用其他濃度的MeJA處理嫩葉，總黃酮的含量均在48 h達(dá)到最大值；用1.0 mmol/L MeJA處理老葉，總黃酮含量在72 h達(dá)19.246 mg/g；用0.01 mmol/L SA處理成熟葉、老葉，L–龍腦的含量在72 h時(shí)分別為2.418、2.034 mg/g，與對(duì)照差異達(dá)顯著水平；用0.1 mmol/L SA處理嫩葉、成熟葉、老葉，總黃酮含量在24 h較高，分別為6.287，8.172、11.827 mg/g。綜合本研究結(jié)果，1 mmol/L的MeJA對(duì)艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮的合成均具有較好的促進(jìn)作用，且在處理后72 h艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮含量相對(duì)較高；0.01 mmol/L SA對(duì)艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮含量的積累具有較好的效果，處理后，艾納香葉片中L–龍腦含量在72 h較高，總黃酮含量在24 h較高。

艾納香；水楊酸；茉莉酸甲酯；L–龍腦；總黃酮

艾納香()為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，是提取天然冰片(艾片)的主要來(lái)源[1]。艾納香具有鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、祛風(fēng)除濕、祛痰止咳、通經(jīng)止血等功效，在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著廣泛的應(yīng)用，是一種重要的民族藥物[2–6]。

左旋龍腦(L–龍腦)是艾納香主要的藥用成分。L–龍腦和艾油的含量受環(huán)境因素[7]、品種[8]以及栽培措施[9]等的影響較大。本課題組前期的研究表明，土壤因子對(duì)艾納香中L–龍腦活性成分含量也具有不同程度的影響[10]。黃酮類化合物是藥用植物中的重要活性成分，具有多種藥理活性，如抗癌、抗氧化、抗炎等[11–13]。5,3',5–三羥基–7–甲氧基二氫黃酮是存在于艾納香中的重要的黃酮類化合物，又被稱為艾納香素，是艾納香主要的活性成分之一[5]。許實(shí)波等[14]研究表明，艾納香素對(duì)肝損傷有保護(hù)作用，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞藥源性損傷的修復(fù)，提高肝細(xì)胞的再生活力。

植物的次生代謝產(chǎn)物能在一些外源誘導(dǎo)因子的作用下大量產(chǎn)生[15–16]。水楊酸(SA)與茉莉酸甲酯(MeJA)是與抗損傷相關(guān)的植物激素，能夠激發(fā)防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)基因的表達(dá)[17–20]。本研究中，以艾納香為試材，采用不同濃度的SA和MeJA噴施艾納香的葉片，研究艾納香葉片中L–龍腦和黃酮含量的變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1　材料

供試材料為種植于海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所南藥種質(zhì)資源圃一年生的艾納香()。

主要試劑：L–龍腦標(biāo)準(zhǔn)品(Alfa Aesar，純度＞98.0%)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080–200707，純度92.5%)；水楊酸甲酯(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度＞99.5%)；乙酸乙酯(廣州友聯(lián)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；水楊酸(Sigma，純度＞99.9%)；茉莉酸甲酯(Sigma，純度＞99.9%)；亞硝酸鈉(NaNO2)、硝酸鋁(Al(NO3)3·9H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、乙醇均為國(guó)產(chǎn)，分析純?cè)噭?/p>

主要儀器設(shè)備：安捷倫7890A氣相色譜儀；Sartarius CPA225D分析天平；KQ–500DB型超聲儀；UNICO2012–PCS紫外分光光度計(jì)。

1.2　方法

參照文獻(xiàn)[20]中的方法，將SA和MeJA均配制成10、1、0.1、0.01 mmol/L的溶液。

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、一年生的艾納香為試驗(yàn)材料，用上述不同濃度的SA和MeJA分別均勻噴施不同艾納香的整株葉片，以噴施去離子水為對(duì)照(CK)。每種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的每個(gè)濃度噴施3株，共24株。重復(fù)3次。

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，艾納香外源噴施水楊酸和茉莉酸甲酯后，24~72 h總黃酮和L–龍腦含量變化較明顯。為此，本研究中從處理結(jié)束后24、48、72 h采樣。同一植株分嫩葉(植株頂端未完全展開(kāi)的黃白色的幼嫩葉片)、成熟葉(植株中部已完全長(zhǎng)大的深綠色的葉片)、老葉(植株下方葉緣發(fā)黃的卷曲葉片)采集。

將采集的艾納香葉片迅即置于研缽中加液氮研磨成粉，精密稱取研磨粉末2 g，置于50 mL離心管中，加入25 mL乙酸乙酯，于40 kHz的超聲條件下提取30 min，冷卻，過(guò)濾，取1 mL濾液至10 mL容量瓶中，加入1 mL內(nèi)標(biāo)液，用乙酸乙酯定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.3　測(cè)定指標(biāo)與方法

采用氣相色譜法測(cè)定L–龍腦含量。色譜柱為HP–5石英毛細(xì)管(0.32 mm×30 m，0.25 μm)；以 80 ℃為起始溫度，保持2 min，以5 ℃/min升溫至100 ℃，再以20 ℃/min升溫至200 ℃；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；FID檢測(cè)器溫度為240 ℃；進(jìn)樣量為0.6 μL，不分流。

總黃酮含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　MeJA處理后艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮含量

由表1可以看出，除10 mmol/L MeJA處理外,其他濃度處理艾納香嫩葉的L–龍腦含量均在72 h達(dá)到最大值。濃度為1.0 mmol/L MeJA處理成熟葉中L–龍腦在72 h達(dá)到最大值(3.043 mg/g)，顯著高于對(duì)照。各濃度的MeJA處理老葉后，其L–龍腦含量均隨時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照相比，均無(wú)明顯差異。從表1可見(jiàn)，不同濃度的MeJA均能促進(jìn)艾納香葉片中L–龍腦的積累，其中以濃度為1 mmol/L的MeJA的效果較好。

除0.01 mmol/L MeJA處理外的其他濃度的處理，嫩葉中總黃酮的含量均在48 h達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)。在48 h時(shí)，10 mmol/L MeJA處理嫩葉中的總黃酮含量與對(duì)照有顯著差異。濃度為0.01 mmol/LMeJA處理對(duì)艾納香成熟葉中的總黃酮含量影響較小。濃度為1.0 mmol/L MeJA處理艾納香成熟葉中的總黃酮含量在72 h達(dá)最大值，為10.667 mg/g；濃度為10 mmol/L MeJA處理，在24 h成熟葉中總黃酮含量比對(duì)照低，之后迅速增加，48ｈ達(dá)最大(10.268 mg/g)。與其他濃度的MeJA處理相比，濃度為1.0 mmol/LMeJA處理，對(duì)老葉中總黃酮含量的影響較大，在72h達(dá)到最大值，為19.246 mg/g。濃度為10 mmol/L的MeJA處理，雖然能在48 h內(nèi)促進(jìn)葉片中總黃酮的積累，但在72 h略有降低。濃度為0.01、0.1 mmol/L MeJＡ處理，對(duì)艾納香老葉中總黃酮積累的影響較小。由此可見(jiàn)，1 mmol/L MeJA 處理促進(jìn)艾納香葉片總黃酮積累的效果相對(duì)較好。

表1　MeJA處理后艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮的含量

對(duì)照中L–龍腦和總黃酮含量在24、48、72 h基本一致，取平均值用于分析；同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.2　SA處理后艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮含量

由表2可知，用0.01 mmol/L SA處理艾納香嫩葉、成熟葉、老葉，其L–龍腦的含量隨時(shí)間的推進(jìn)呈增加的趨勢(shì)，在72 h達(dá)最大值，分別為2.365，2.418、2.034 mg/g，且成熟葉和老葉中的L–龍腦含量與對(duì)照的差異達(dá)顯著水平。用0.1 mmol/L SA處理艾納香嫩葉，其L–龍腦含量在72 h處達(dá)最大值，為1.985mg/g。成熟葉和老葉中L–龍腦含量對(duì)0.1 mmol/L SA響應(yīng)規(guī)律相似，均在48 h內(nèi)持續(xù)增加，在48 h達(dá)峰值，分別為1.836、1.521 mg/g，之后呈下降趨勢(shì)。1.0、10 mmol/L SA對(duì)艾納香葉片中L–龍腦的積累均有促進(jìn)作用，但效果不明顯。由此可見(jiàn)，0.01 mmol/L SA對(duì)艾納香嫩葉、成熟葉、老葉中L–龍腦含量的促進(jìn)效果較好。

用0.1 mmol/L SA處理艾納香嫩葉和成熟葉，艾納香嫩葉和成熟葉中總黃酮含量在24 h達(dá)最大，分別為6.287，8.172 mg/g。用1.0 mmol/L SA處理艾納香嫩葉和成熟葉，其總黃酮含量在24 h達(dá)最大，分別為7.848，8.026 mg/g。對(duì)于老葉，除1 mmol/L SA處理外，其余濃度處理老葉中的總黃酮含量在24 h的積累量均顯著高于對(duì)照，之后逐漸降低。由此可見(jiàn)，0.1 mmol/L SA促進(jìn)艾納香葉片總黃酮含量積累的效果較好，且在24 h總黃酮含量最高。

表2　SA處理后艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮的含量

對(duì)照中L–龍腦和總黃酮含量在24、48、72 h基本一致，取平均值用于分析；同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

3　結(jié)論與討論

研究[21–22]表明，高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可抑制單萜等次生代謝產(chǎn)物的合成。本研究結(jié)果表明，適宜濃度的MeJA能促進(jìn)艾納香葉片L–龍腦和總黃酮含量的積累。用1 mmol/L MeJA處理艾納香成熟葉和嫩葉，艾納香成熟葉和嫩葉中的L–龍腦含量在72 h顯著提高。該濃度下，老葉和成熟葉中的總黃酮含量在72 h也顯著高于對(duì)照。而嫩葉和成熟葉對(duì)10 mmol/L MeJA的響應(yīng)規(guī)律表現(xiàn)為48 h內(nèi)持續(xù)增加，隨后逐漸降低。噴施10 mmol/L MeJA，艾納香葉片生長(zhǎng)正常，無(wú)明顯不良反應(yīng)；而噴施10 mmol/L的SA，艾納香葉片出現(xiàn)了明顯的褐化、卷縮、枯萎現(xiàn)象，表明艾納香葉片對(duì)SA的耐受性低于MeJA。不同濃度的SA對(duì)艾納香總黃酮均有不同程度的促進(jìn)作用，低濃度(0.01、0.1 mmol/L)比高濃度(1、10 mmol/L)的促進(jìn)作用更明顯，這與前人的研究結(jié)果[23]相似。

綜合本研究結(jié)果，1 mmol/L MeJA對(duì)艾納香葉片中L–龍腦和總黃酮含量的積累均具有較好的效果；0.01 mmol/L SA能促進(jìn)艾納香葉片中L–龍腦的積累效果較好，處理后72 h艾納香葉片中L–龍腦含量較高。0.1 mmol/L SA促進(jìn)艾納香葉片中總黃酮含量的積累效果較好，在處理后24 h艾納香葉片中總黃酮含量較高。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

The influence of salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA) to concentrations of L–borneol and total flavonoids in leaves of

GUAN Lingliang1, XIA Qifeng1,2, PANG Yuxin1, YU Fulai1, HUANG Mei1, CHEN Zhenxia1

(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, China/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China/Blumea balsamifera Engineering Technology Research Center in Hainan province, Danzhou, Hainan, 571737, China; 2.College of life sciences, Guizhou University/ Key laboratory of traditional Chinese medicine in Guizhou province, Guiyang 550025, China)

L. DC. was used as test material in this study. Salicylic acid (SA) and Methyl Jasmonate (MeJA) with different concentrations (10, 1, 0.1, 0.01 mmol/L of aqueous solution) were sprayed respectively to the leaves of different position, the control was sprayed with water. Then the contents of L–borneol and total flavonoids were determined to explore the response of leaves to different concentrations of SA and MeJA. The results showed that except for the treatment of 10 mmol/L MeJA, the content of L–borneol of the other treatments reached the maximum value at 72 h after the young leaves sprayed with MeJA. The content of L–borneol reached maximum value at 72 h (3.043 mg/g) after the mature leaves sprayed with 1.0 mmol/L MeJA, which was significantly higher than that of the control. Except for the treatment of 0.01 mmol/L MeJA, the total flavonoids of the other treatments reached the maximum value at 48 h after the young leaves sprayed with MeJA. The total flavonoids reached maximum value at 72 h (19.246 mg/g) after the old leaves treated with 1.0 mmol/L MeJA. The L–borneol contents of the treatments of mature leaves and old leaves sprayed with 0.01 mmol/L reached 2.418 and 2.034 mg/g respectively at 24 h, which were significant higher than those of the control group. Compared with other concentrations, 0.1mmol/L SA had higher total flavonoids (young leaves 6.287 mg/g，mature leaves 8.172 mg/g and old leaves 11.827 mg/g ) at 24 h. In conclusion, 1 mmol/L MeJA could effectively promote the synthesis of L–borneol and total flavonoids and 0.01 mmol/L SA was advantageous to accumulate L–borneol.

; salicylic acid; methyl Jasmonate; L–borneol; total flavonoids

S567.23

A

1007-1032(2017)06-0610-05

2017–03–28

2017–05–31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202910)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(817263)；海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)(ZY201410)

官玲亮(1982—)，女，四川內(nèi)江人，博士，副研究員，主要從事藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及次生代謝調(diào)控研究，gllgirl123@163.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn