紫蘇籽油抗菌活性研究

王素君，張良曉，李培武，王秀嬪，張 奇

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，武漢 430062；2農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；3農(nóng)業(yè)部油料作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢)，武漢 430062；4農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；5農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，武漢 430062))

紫蘇籽油抗菌活性研究

王素君1，2，張良曉1，3，5*，李培武1，3，4，5*，王秀嬪1，5，張 奇1，4，5

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，武漢 430062；2農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；3農(nóng)業(yè)部油料作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢)，武漢 430062；4農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；5農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，武漢 430062))

以革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌作為供試菌株，采用濾紙片法測(cè)定評(píng)估了紫蘇籽油經(jīng)過皂化提取之后其提取液抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的能力，并將所得的結(jié)果與大豆油的抑菌作用進(jìn)行比較。結(jié)果表明，紫蘇籽油提取液對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩個(gè)供試菌株的抑制效果較強(qiáng)，且對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑制效果要優(yōu)于大腸桿菌，且紫蘇籽油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果要優(yōu)于大豆油。

紫蘇籽油；抗菌活性；大腸桿菌；草芽孢桿菌

紫蘇(Perillafrutescens)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用價(jià)值，是衛(wèi)生部首批頒布的藥食兩用植物[1-3]，具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]等功效。紫蘇籽含油量達(dá)到40%～60%，紫蘇籽油富含α-亞麻酸[7-9]，具有降血脂[10]、預(yù)防心血管疾病[11]、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)和大腦發(fā)育[12]、提高學(xué)習(xí)記憶、預(yù)防老年癡呆癥[13]、抗腫瘤[14]等營(yíng)養(yǎng)功能[15]。除富含α-亞麻酸外，紫蘇籽油含有酚酸、植物甾醇、特質(zhì)性揮發(fā)成分等活性成分。

油脂的抗菌活性越來(lái)越受到重視。埃及和德國(guó)聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)冷榨孜然油具有抗菌作用[16]；西班牙圣地亞哥聯(lián)合大學(xué)研究了初榨山茶油、橘籽油、茶梅籽油的甘油酯組成、抗氧化與抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種初榨油脂均表現(xiàn)抗菌活性，其中山茶油對(duì)大腸桿菌的抑制效果最佳[17]。Gecgel等[18]分析比較了冷榨摩洛哥堅(jiān)果油、石榴籽油、海棗籽油、亞麻籽油、紅花籽油、黃金梅籽油、核桃油、葡萄籽油的水分及揮發(fā)物、折光指數(shù)、比重、碘值、皂化值、游離脂肪酸、酸價(jià)、色澤等理化指標(biāo)，脂肪酸組成和對(duì)病原菌和產(chǎn)毒霉菌的抗菌活性，結(jié)果顯示，冷榨石榴籽油和摩洛哥堅(jiān)果油的抗菌活性最高，核桃油次之。冷榨紅花油對(duì)病原菌S.enteridis ATCC 13076、冷榨石榴籽油對(duì)L.monocytogenes ATCC 7644的抑菌活性最好，而葡萄籽油對(duì)寄生曲霉NRRL 2999和NRRL 465的抑菌活性最好。近期研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇籽對(duì)口腔致齲鏈球菌、牙周牙齦卟啉單胞菌具有抑制作用[19]，能抑制去卵巢大鼠牙槽骨丟失[20]。對(duì)紫蘇籽油的抑菌活性尚無(wú)報(bào)道。

本研究采用濾紙片擴(kuò)散法，研究紫蘇籽油對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌活性，為進(jìn)一步全面研究紫蘇籽油中的有效抑菌成分及其抑菌作用提供技術(shù)支撐，為深入開展、挖掘紫蘇籽油新產(chǎn)品的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1儀器設(shè)備 有機(jī)系濾膜(孔徑0.22μm)；天平(感量0.000 1g)，德國(guó)Sartorius公司；KQ-300E超聲儀，中國(guó)昆山儀器公司；HQ-60型混合渦旋混合器，北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司。

1.1.2試劑 正己烷和乙醇均為色譜純，購(gòu)自安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；KOH(優(yōu)級(jí)純)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(分析純)，購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉(Yeast extract)、蛋白胨(Tryptone)，均購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm，25℃)。自榨紫蘇籽油和大豆油由實(shí)驗(yàn)室采用太古家用榨油機(jī)(佛山太電智能科技有限公司)物理壓榨制備。

1.1.3供試細(xì)菌 革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)購(gòu)買自武漢大學(xué)菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1紫蘇籽油提取液制備級(jí) 稱取0.2 g(精確到0.005g)植物油于具塞玻璃試管中，加入6mL 2mol/L KOH乙醇溶液溶解，于液體混勻器上快速混勻1min。超聲時(shí)間40 min，超聲溫度75℃，超聲功率100%的條件下進(jìn)行皂化，皂化結(jié)束后，3.5mL正己烷混勻，加超純水至管口位置渦旋混勻后靜置分層。取上層澄清層收集，重復(fù)3次，室溫條件下氮?dú)獯蹈?，?5%的乙醇定容至0.5mL。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)基的制備 胰蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、酵母提取物定容至1L純凈水中作為液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15.0g瓊脂完全溶解后在121℃、0.15 MPa條件下高溫高壓滅菌30 min備用。

1.2.3菌株的活化及菌懸液的制備 在超凈工作臺(tái)上，將供試菌株用平板劃線法接種在平板培養(yǎng)基上，待活化后挑取單克隆菌株，置于2 mL相適應(yīng)的液體培養(yǎng)基中37 °C搖床恒溫培養(yǎng)12h，使用平板計(jì)數(shù)法確定菌液稀釋度后稀釋至105～106 CFU/mL備后續(xù)的抑菌實(shí)驗(yàn)用。胰蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、酵母提取物定容至1L純凈水中作為液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15.0g瓊脂完全溶解后在121℃、0.15 MPa條件下高溫高壓滅菌30 min備用。

1.2.4濾紙片紫蘇籽油對(duì)受試菌株的抑菌作用

(1)使用打孔器對(duì)干凈且吸水性較強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)定性濾紙打孔為6 mm的圓形的濾紙片，并置于潔凈干燥的玻璃培養(yǎng)皿中，在121°C的條件下高壓蒸汽滅菌30 min，滅菌后置于無(wú)菌操作臺(tái)上備用。

(2)于無(wú)菌操作臺(tái)中將配好的不同菌種的菌懸液震蕩搖勻后吸取100 μL均勻的菌懸液置于平板上，并使用滅菌的涂布棒均勻涂布在一次性倒好的冷卻凝固的固體培養(yǎng)基表面上。用滅菌的鑷子夾取浸泡含有不同精煉程度的食用植物油提取液的圓形濾紙片放到涂有菌懸液的平板培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放5個(gè)紙片。其中，平板上放置無(wú)菌水空白對(duì)照在中間，提取溶劑對(duì)照觀察。

(3)將處理好的細(xì)菌平板于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，到培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后取出，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，用直尺測(cè)量抑菌圈的直徑，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性采用十字交叉方法，記錄數(shù)據(jù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的皂化提取液重復(fù)3次測(cè)定，最后計(jì)算的平均值轉(zhuǎn)換為抑菌率評(píng)價(jià)抑菌效果。

實(shí)驗(yàn)中將抑菌率作為評(píng)價(jià)抗菌效果的指標(biāo)，抑菌率的計(jì)算公式為式(1)：

(1)

1.3 統(tǒng)計(jì)分析法

所有的實(shí)驗(yàn)菌重復(fù)3次測(cè)定，所有結(jié)果以平均值來(lái)表示。使用SAS 9.5統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液對(duì)各種供試菌株的抑菌效果

采用濾紙片法測(cè)定紫蘇籽油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩種供試菌株的體外抑菌活性研究，抑菌活性通過測(cè)定抑菌圈的直徑換算抑菌率來(lái)表示，并將測(cè)定的結(jié)果與大豆油相比較。由表1和表2可見，紫蘇籽油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩種供試菌株的抑菌率菌均具有抑制作用，且紫蘇籽油的抑菌效果要優(yōu)于大豆油。

表1 紫蘇籽油提取物對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果

表2 大豆油提取物對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果

2.2 紫蘇籽油和大豆油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制效果

為了更顯著地反應(yīng)紫蘇籽油和大豆油的抑菌作用，進(jìn)行T-test檢驗(yàn)和方差分析。使用SAS 9.0軟件中的T-test的檢驗(yàn)分析表1和表2中的抑菌結(jié)果，檢驗(yàn)紫蘇籽油和大豆油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制效果的顯著性。由表3可以看出，紫蘇籽油和大豆油對(duì)于大腸桿菌的抑菌效果差異不顯著，而對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑菌效果差異顯著，且紫蘇籽油的抑菌效果明顯好于大豆油。

表3 紫蘇籽油和大豆油抑菌顯著性(T-test檢驗(yàn)分析)

使用SAS軟件中的一般線性模型(GLM)過程步驟對(duì)表1和表2中的抑菌率進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)紫蘇籽油和大豆油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制效果的顯著性(表4)。

表4 紫蘇籽油和大豆油的抑菌顯著性(方差分析)

注：因素A紫蘇籽油和大豆油；因素B大腸桿菌和枯草芽孢桿菌

由表4可以看出，紫蘇籽油和大豆油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果有極顯著的差異(P<0.000 1)，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩種供試菌株差異不顯著(P=0.093 1>0.05)。由表3和表4得出紫蘇籽油的抑菌效果要明顯優(yōu)于大豆油。

3 結(jié)論

本文測(cè)定了紫蘇籽油皂化提取液對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用以及其與大豆油提取液的對(duì)照結(jié)果。采用超聲輔助皂化后的提取液革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌如大腸桿菌均有較明顯的抑制作用，而大豆油提取液的抑菌效果則較差。總體抑菌效果比較，紫蘇籽油對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果要明顯好于大豆油。紫蘇作為一種食藥兩用的植物，研究其抑菌作用，發(fā)掘紫蘇籽油營(yíng)養(yǎng)功能潛力和優(yōu)勢(shì)，對(duì)綜合利用和開發(fā)紫蘇籽油新產(chǎn)品提供了必要的基礎(chǔ)。◇

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Antibacterial Effects of Perilla Seed Oil Against Escherichia Coli and Bacillus Subtilis

WANG Su-jun1，2，ZHANG Liang-xiao1，3，5*，LI Pei-wu1，3，4，5*，WANG Xiu-pin1，5，ZHANG Qi1，4，5

(1Oil Crops Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China；2Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；3Key Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Oil Crops(Wuhan)，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；4Key Laboratory of Detection for Mycotoxins，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；5Quality Inspection and Test Center for Oilseed Products，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China)

Taking gram negativeEscherichiacoliand the gram positive bacterium as tested strains，filter paper method was used to determine and evaluate antibacterial effects of the extract of Perilla seed oil againstEscherichiacoliandBacillussubtilis.Then，antibacterial effects of Perilla seed oil were compared with soybean oil.The results indicated that the extract of Perilla seed oil possessed strong antibacterial effects againstEscherichiacoliandBacillussubtilisthan soybean oil.Compared withEscherichiacoli，the extract of Perilla seed oil showed stronger antibacterial effects againstBacillussubtilis.

perilla seed oil；antibacterial effects；Escherichiacoli；Bacillussubtilis

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：GJFP201701、GJFP201715-02)；農(nóng)業(yè)部、財(cái)政部專項(xiàng)課題“國(guó)家油菜現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)”(項(xiàng)目編號(hào)：CARS-13)；中央級(jí)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：1610172017008)。

王素君(1988— )，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全。

*共同通信作者：張良曉(1981— )，男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品安全、化學(xué)計(jì)量學(xué)；李培武(1961— )，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)。

(責(zé)任編輯 唐建敏)