PD0332991在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞集落形成中的作用*

王芳 張新偉

·基礎(chǔ)研究·

PD0332991在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞集落形成中的作用*

王芳①②張新偉①

目的：探討細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6）靶向抑制劑PD0332991在套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）集落形成中的作用及機(jī)制。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD0332991對(duì)MCL細(xì)胞周期的影響；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)PD0332991處理后MCL細(xì)胞Rb蛋白和磷酸化Rb（phosphorylated retinal blastoma，p-Rb）蛋白的表達(dá)水平；采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD0332991、米托蒽醌及雙藥聯(lián)合對(duì)MCL細(xì)胞集落形成能力的影響。結(jié)果：采用流式細(xì)胞術(shù)研究證實(shí)PD0332991使G0/G1期MCL細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞明顯下降，導(dǎo)致細(xì)胞的G0/G1期阻滯。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)顯示PD0332991對(duì)Rb蛋白表達(dá)無影響，但能明顯下調(diào)磷酸化Rb蛋白的水平。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示PD0332991可抑制MCL細(xì)胞集落形成，并增強(qiáng)米托蒽醌對(duì)MCL集落形成的抑制作用。結(jié)論：CDK4/6靶向抑制劑PD0332991可通過抑制MCL細(xì)胞Rb蛋白磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞的G0/G1期阻滯，增強(qiáng)米托蒽醌抑制MCL集落形成的能力。

套細(xì)胞淋巴瘤 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6 細(xì)胞周期阻滯 PD0332991 集落形成

套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）是一種較為罕見具有獨(dú)立的臨床、生物學(xué)及分子遺傳學(xué)特點(diǎn)的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療方案臨床緩解期短、預(yù)后差，中位總生存期（median overall survival，mOS）僅為4～5年［1-3］。因此，進(jìn)一步研究MCL發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶標(biāo)并探索新的治療方案對(duì)其治療具有重要意義。本課題組前期研究工作提示，腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞濾泡樹突狀細(xì)胞（follicular dendritic cells，F(xiàn)DCs）與MCL細(xì)胞共培養(yǎng)后，可直接下調(diào)miR-548m的水平并上調(diào)CDK6的表達(dá)，且CDK6-3'UTR是miR-548m的直接作用靶點(diǎn)，F(xiàn)DCs通過FDCs-miR-548m-CDK6軸調(diào)節(jié)MCL細(xì)胞集落形成能力［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期調(diào)控異常導(dǎo)致的細(xì)胞過度增殖是人類腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，CDK4/6作為細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子，其過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前，以CDK4/6為靶點(diǎn)的腫瘤治療展現(xiàn)出廣泛的治療前景［5-8］。本研究旨在探討CDK4/6靶向抑制劑PD0332991在MCL集落形成中的調(diào)節(jié)機(jī)制，并進(jìn)一步明確CDK6在MCL中的作用機(jī)制，為CDK4/6靶向抑制劑PD0332991在MCL治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 MCL細(xì)胞系Jeko-1由美國(guó)Moffitt癌癥中心提供，Granta-519細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物技術(shù)研究室提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、PRMI-1640均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰酶購(gòu)自日本Taraka公司，PD0332991購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗人Rb單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Sigalling Technology公司，兔抗人磷酸化Rb單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Sigalling Technology公司，抗兔IgG、HRP-linked抗體、抗鼠IgG、HRP-linked抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Brdu試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCL細(xì)胞系Jeko-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中。MCL細(xì)胞系Granta-519細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中。

1.2.2 Brdu/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將MCL細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞，加入藥物，于37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h；之后向培養(yǎng)液中摻入Brdu 1mmol/L，同時(shí)將不加Brdu作為陰性對(duì)照；繼續(xù)培養(yǎng)12h后收集細(xì)胞于離心管中，經(jīng)固定破膜、滲透、再固定后離心棄上清，加入DNA酶，37℃孵育1 h并離心棄上清；然后加入Brdu抗體50 μL，室溫孵育20 min，離心棄上清；加入20 μL 7-AAD染總DNA，重懸細(xì)胞后1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。

1.2.3 應(yīng)用Western blot法檢測(cè) 收集細(xì)胞，通過細(xì)胞裂解液RIPA裂解、提取總蛋白，測(cè)定濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF印跡膜，封閉，分別滴加Rb蛋白抗體、磷酸化Rb蛋白抗體進(jìn)行孵育，PBST洗膜后，加入二抗室溫孵育，PBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.4 集落形成試驗(yàn) 將MCL細(xì)胞與甲基纖維素培養(yǎng)基按1：10的體積比進(jìn)行混合，并分別加入PD0332991、米托蒽醌、PD033299和米托蒽醌，并設(shè)置陰性對(duì)照。用連有16號(hào)無菌針頭的3 mL無菌注射器取1.1 mL細(xì)胞混合液放至35 mm的平皿里，輕輕傾斜并晃動(dòng)平皿以使培養(yǎng)基鋪勻，置于37℃含5%CO2、95%濕度的孵箱中培養(yǎng)14 d后計(jì)數(shù)集落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用表示，兩組定量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組以上定量資料的比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDK4/6靶向抑制劑PD0332991導(dǎo)致MCL細(xì)胞G0/G1期阻滯

本研究前期實(shí)驗(yàn)證明，腫瘤基質(zhì)細(xì)胞通過FDCsmiR-548m-CDK6軸調(diào)節(jié)MCL細(xì)胞集落形成能力，CDK6是MCL治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)［4］?；谏鲜鲅芯?，本研究進(jìn)一步探討CDK4/6靶向抑制劑PD0332991在MCL集落形成調(diào)節(jié)中的機(jī)制。首先，采用PD0332991分別處理MCL細(xì)胞系Jeko-1和Granta-519細(xì)胞24 h，并應(yīng)用Brdu/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)MCL細(xì)胞周期變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD0332991使Jeko-1和Granta-519細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而S期細(xì)胞數(shù)目明顯下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞的G0/G1期阻滯，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而對(duì)G2+M期細(xì)胞和細(xì)胞直接凋亡作用有限（圖1，表1，2）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)Jeko-1和Granta-519細(xì)胞周期變化Figure 1 Jeko-1 and Granta-519 cell cycle distribution was measured using flow cytometry assay

表1 PD0332991對(duì)Jeko-1細(xì)胞周期分布的影響Table 1 Effect of PDO332991 on cell cycle of Jeko-1 cells

表2 PD0332991對(duì)Granta-519細(xì)胞周期分布影響Table 2 Effect of PD0332991 on cell cycle of Granta-519 cells

2.2 CDK4/6靶向抑制劑PD0332991抑制MCL Rb蛋白磷酸化

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDK4/6靶向抑制劑PD0332991導(dǎo)致Jeko-1和Granta-519細(xì)胞G0/G1期周期阻滯，為了明確PD0332991是否通過Rb蛋白磷酸化導(dǎo)致上述現(xiàn)象，本研究應(yīng)用Western blot法進(jìn)一步檢測(cè)PD0332991對(duì)Granta-519和Jeko-1細(xì)胞中Rb蛋白及磷酸化Rb（p-Rb）蛋白的影響。將Granta-519和Jeko-1兩種細(xì)胞系分別用PD0332991處理24 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)Rb蛋白和p-Rb蛋白的表達(dá)水平。PD0332991對(duì)Rb蛋白表達(dá)無明顯影響，但卻能顯著下調(diào)p-Rb蛋白的水平，即PD0332991通過抑制Rb蛋白磷酸化從而導(dǎo)致細(xì)胞的G1期阻滯（圖2）。

圖2 應(yīng)用Western blot法檢測(cè)證明PD0332991對(duì)Rb蛋白表達(dá)無影響，但明顯下調(diào)p-Rb蛋白水平Figure 2 Western blot confirmed that PD0332991 exerted no effect on Rb protein but suppressed levels of phosphorylated Rb protein

2.3 CDK4/6靶向抑制劑PD0332991增強(qiáng)米托蒽醌對(duì)MCL集落形成能力的抑制作用

先前研究已經(jīng)證實(shí)，CDK6在MCL的發(fā)生發(fā)展及腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用（圖3）［4，9-13］。本課題組進(jìn)而研究了CDK4/6靶向抑制劑PD0332991及其聯(lián)合米托蒽醌對(duì)比米托蒽醌單藥對(duì)MCL集落形成能力的影響。將采用甲基纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)的Granta-519細(xì)胞分為4組，每組3個(gè)樣本，其中分別加入PD0332991、米托蒽醌、PD0332991和米托蒽醌，并設(shè)置陰性對(duì)照組，培養(yǎng)14 d后計(jì)數(shù)集落數(shù)目。統(tǒng)計(jì)4組集落數(shù)目如下，對(duì)照組為（55.75±7.93），PD0332991組為（37.75±3.77），米托蒽醌組為（32.00±3.16），PD0332991+米托蒽醌聯(lián)用組為（17.00±3.27）。本研究證實(shí)PD0332991和米托蒽醌均能抑制MCL集落形成能力，且相對(duì)于對(duì)照組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，米托蒽醌聯(lián)合PD0332991相對(duì)于米托蒽醌組，集落數(shù)目更少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

?圖3 CDK6在MCL發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用Figure 3 Critical role of CDK6 in pathogenesis of MCL

圖4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD0332991、米托蒽醌及雙藥聯(lián)合對(duì)MCL集落形成能力的影響Figure 4 Colony forming assay was performed to test the role of PD0332991 and mitoxantrone and their combination on colony forming activity in MCL

3 討論

MCL具有獨(dú)特的免疫表型和臨床特點(diǎn)，多數(shù)存在t（11；14）（q13；q32）和cyclin D1過表達(dá)，兼具彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）的侵襲性和低度惡性淋巴瘤的不可治愈性，其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療方案臨床緩解期短，預(yù)后不良，mOS較短［14］。雖然，多數(shù)MCL患者存在cyclin D1過表達(dá)，但轉(zhuǎn)基因小鼠證實(shí)單純cyclin D1過表達(dá)并不能導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生［15］。作為一種腫瘤異質(zhì)性疾病，MCL的發(fā)生發(fā)展需要多個(gè)因素的參與［16-17］。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞FDCs能夠明顯抑制MCL中miR-548m表達(dá)，從而導(dǎo)致c-myc和HDAC6的表達(dá)增加，并且miR-548m本身受c-myc負(fù)調(diào)控，從而形成miR-548m和c-myc環(huán)路，進(jìn)一步導(dǎo)致c-myc上調(diào)、miR-548m減少，而且過表達(dá)miR-548 m或直接抑制HDAC6能夠減少HBL-2的集落形成［9］。該研究結(jié)果表明，F(xiàn)DCs可通過調(diào)節(jié)MCL的miR-548m和c-myc環(huán)路，造成c-myc持續(xù)表達(dá)、miR-548m減少、HDAC6上調(diào)，MCL細(xì)胞增殖。此外，本研究證實(shí)CDK6是miR-548m的作用靶點(diǎn)，F(xiàn)DCs通過下調(diào)miR-548m表達(dá)，上調(diào)CDK6表達(dá)，促進(jìn)MCL集落形成能力，F(xiàn)DCs通過FDCs-miR-548m-CDK6軸調(diào)節(jié)MCL細(xì)胞集落形成能力［4］。另外，研究發(fā)現(xiàn)CDK6是miR-29和miR-34a的特異性靶點(diǎn)，且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)，并受c-myc表達(dá)調(diào)控，miR-29和miR-34a可能通過CDK6參與MCL的發(fā)生和發(fā)展［10-12］。本研究進(jìn)一步證實(shí)，c-myc通過HDAC3（組蛋白去乙?；?）募集SUZ12（多梳蛋白）和EZH2（多梳基因抑制復(fù)合物2的關(guān)鍵組成蛋白）抑制miR-29表達(dá)，促進(jìn)CDK6表達(dá)，參與MCL的發(fā)生和發(fā)展［11］。上述原因?qū)е翸CL過表達(dá)CDK6，從而協(xié)同cyclin D1引起Rb蛋白磷酸化，使轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)MCL細(xì)胞增殖［11，13］。上述研究表明，腫瘤微環(huán)境中的 FDCs與MCL細(xì)胞接觸后激活腫瘤細(xì)胞的c-myc和miR-548m環(huán)路，導(dǎo)致c-myc過表達(dá)，進(jìn)而影響miR-548m、miR-29和miR-34a等miRNAs表達(dá)，造成CDK6等蛋白過表達(dá)，協(xié)同cyclin D1引發(fā)Rb磷酸化，促進(jìn)腫瘤增殖、減少凋亡，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和耐藥。

鑒于CDK6在MCL發(fā)病機(jī)制中的重要作用，有關(guān)其抑制劑在MCL治療中的研究也越來越受到關(guān)注［18］。本研究進(jìn)一步探索了CDK4/6靶向抑制劑PD0332991在MCL治療中的作用及其可能的作用機(jī)制。綜上所述，本研究證實(shí)CDK4/6靶向抑制劑PD0332991通過抑制Rb蛋白磷酸化，導(dǎo)致MCL細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制MCL集落形成，并增強(qiáng)米托蒽醌對(duì)MCL集落形成能力的抑制作用。該研究進(jìn)一步豐富了MCL發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，揭示了CDK4/6抑制劑PD0332991在MCL集落形成中的作用，為MCL的治療提供新的思路和理論依據(jù)。

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The role of PD0332991 in clonogenicity of mantle cell lymphoma cells

Fang WANG1,2,Xinwei ZHANG1

1Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin 300060,China;2Department of Radiation Oncology,Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071000,China

Xinwei ZHANG;E-mail:zhangxinwei@tjmuch.com

Objective:To investigate the function and mechanism of cyclin-dependent kinase 4/6(CDK4/6)inhibitor PD0332991 on clonogenicity of mantle cell lymphoma(MCL)cells.Methods:The effect of PD0332991 on MCL cell cycle distribution was assessed by flow cytometry;Western blot was used to test expression level of Rb protein and phosphorylated Rb protein in MCL after treatment with PD0332991;colony forming assay was performed to test the role of PD0332991 and mitoxantrone and their combination on colony forming activity in MCL.Results:Flow cytometry revealed that PD0332991 can increase G0/G1 phase MCL cells and significantly decrease S phase cells,leading to G0/G1 cell arrest.Western blot confirmed that PD0332991 exerted no effect on Rb protein expression but suppressed levels of phosphorylated Rb protein.Colony forming assay showed that PD0332991 significantly suppressed colony formation and enhanced the effect of mitoxantrone on colony forming activity in MCL.Conclusion:This study revealed that CDK4/6 inhibitor PD0332991 induced G0/G1 cell arrest and increased the effect of mitoxantrone on MCL clonogenicity by suppressing levels of phosphorylated Rb protein.

mantle cell lymphoma,cyclin-dependent kinases 6,cell cycle arrest,PD0332991,colony formation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.22.754

①天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物技術(shù)研究室，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）；②河北大學(xué)附屬醫(yī)院放射治療科

*本文課題受國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2015BAI12B12）資助

張新偉 zhangxinwei@tjmuch.com

This work was supported by National Science and Technology Support Plan Projects(No.2015BAI12B12)

（2017-07-04收稿）

（2017-09-13修回）

（編輯：孫喜佳 校對(duì)：楊紅欣）

王芳 專業(yè)方向?yàn)閻盒阅[瘤免疫及放射治療。

E-mail：tumor@aliyun.com