一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定養(yǎng)血止疼丸中3種丹參酮類成分

武愛玲

(1 河南省洛陽正骨醫(yī)院，洛陽，471002； 2 河南省洛正藥業(yè)有限責(zé)任公司，洛陽，471013)

一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定養(yǎng)血止疼丸中3種丹參酮類成分

武愛玲1,2

(1 河南省洛陽正骨醫(yī)院，洛陽，471002； 2 河南省洛正藥業(yè)有限責(zé)任公司，洛陽，471013)

目的：采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定養(yǎng)血止疼丸中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法(QAMS)的適用性。方法：以丹參酮ⅡA為內(nèi)參物，建立其與丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的相對(duì)校正因子，考察不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。分別用外標(biāo)法測(cè)定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，后者與計(jì)算值進(jìn)行比較。結(jié)果：10批養(yǎng)血止疼丸中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量可以用一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行測(cè)定，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ含量的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值間無顯著差異。結(jié)論：一測(cè)多評(píng)法可用于養(yǎng)血止疼丸中丹參酮類成分的含量測(cè)定。

一測(cè)多評(píng)；高效液相色譜法；養(yǎng)血止疼丸；丹參酮

一測(cè)多評(píng)法是通過測(cè)定中藥中一種代表性成分的含量，依據(jù)相對(duì)校正因子推算該中藥中多種待測(cè)成分含量[1-3]，并使計(jì)算值與實(shí)測(cè)值滿足定量方法學(xué)要求的一種多指標(biāo)成分同步含量測(cè)定方法。“一測(cè)多評(píng)”法作為一種適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式，到目前為止，已在木瓜[4]、虎杖[5]、黃柏[6]、甘草[7]等單味中藥材，以及金銀花復(fù)方制劑[8]、復(fù)方丹參片[9]、穿心蓮及其制劑[10]、濕疹軟膏[11]等制劑的多指標(biāo)含量測(cè)定中得到應(yīng)用。

養(yǎng)血止疼丸是河南省洛陽正骨醫(yī)院內(nèi)部制劑，處方組成：丹參、雞血藤、香附等，具有活血行氣，溫經(jīng)通絡(luò)。用于血瘀寒凝、膝關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生引起的膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限等癥。丹參是其主要藥味，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA均是丹參中脂溶性成分，具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，抑制血小板凝集等作用。為建立養(yǎng)血止疼丸的多成分含量測(cè)定方法，本文建立了養(yǎng)血止疼丸中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮的一測(cè)多評(píng)測(cè)定方法，并對(duì)一測(cè)多評(píng)法用于養(yǎng)血止疼丸中丹參酮類成分含量測(cè)定的可行性進(jìn)行了分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，2998 PDA Detector(美國Waters公司)，Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；METTLER AE200電子分析天平，AB135-S型梅特勒拖利多電子天平。色譜柱：Waters Symmetry C18，Inertsil? ODS-3，Agilent Pursuit5 C18，Wondasil? C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)。

1.2 試劑 對(duì)照品：中國食品藥品檢定研究院隱丹參酮(批號(hào)：110852-200806)、丹參酮Ⅰ(批號(hào)：110867-200406)、丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-200619)。水為蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 10批養(yǎng)血止疼丸，均由河南省洛陽正骨醫(yī)院制劑科提供。

2 方法與結(jié)果[12-18]

2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為268 nm，柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。以丹參酮ⅡA峰計(jì)理論塔板數(shù)不低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對(duì)照品，置容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得濃度分別為20.5、20.3、19.8 μg/mL對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取養(yǎng)血止疼丸細(xì)粉約0.4 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，并稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，得續(xù)濾液。

圖1 混合對(duì)照品(A)、養(yǎng)血止疼丸樣品(B)和陰性樣品(C)的色譜圖

注：1一丹參酮I；2一隱丹參酮；3一丹參酮ⅡA

2.4 專屬性試驗(yàn) 取缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液的方法制備，即得陰性對(duì)照液。在選定條件下，混合對(duì)照品和樣品中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA分離良好，而陰性對(duì)照顯示無干擾。見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液20、15、10、5、2、1 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，丹參酮Ⅰ的線性方程是Y=223.05X+10.27(r=0.999 7)，線性范圍0.0203～0.406 μg；隱丹參酮的線性方程是Y=192.71X+7.56(r=0.999 8)，線性范圍0.0205～0.410 μg；丹參酮ⅡA的線性方程是Y=269.33X+1.83(r=0.999 9)，線性范圍0.0198～0.396 μg；表明3種丹參酮類成分在各濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好。

2.6 相對(duì)校正因子計(jì)算 內(nèi)參物定為丹參酮ⅡA，參照相對(duì)校正因子的公式計(jì)算丹參酮Ⅰ、隱丹參酮相對(duì)丹參酮ⅡA的相對(duì)校正因子。見表1。

表1 丹參酮類成分相對(duì)校正因子

相對(duì)校正因子RCFs/k=fs/k=Ws.Ak/As.Wk；s為內(nèi)參物，k為待測(cè)組分。

2.7 中間精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5次，每次10 μL，分析得丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的峰面積積分值。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.39%、0.82%、0.67%。表明儀器較為穩(wěn)定。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、16、20 h進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行分析。丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的RSD分別為1.30%、1.96%、0.89%，表明在20 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)養(yǎng)血止疼丸6份,按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，每份進(jìn)樣10 μL，測(cè)定隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.11%、0.78%、085%，顯示該方法具有良好的重復(fù)性。

2.10 回收率試驗(yàn) 取0.2 g已知含量的養(yǎng)血止疼丸6份，分別加入適量的混合對(duì)照液，分別用“2.3”項(xiàng)下的方法制得供試品溶液，按照“2.1”條件測(cè)定。結(jié)果丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的平均回收率分別為100.2%、99.87%、101.9%，RSD分別為1.65%、1.37%、0.96%。

2.11 校正因子的重復(fù)性考察 1)色譜柱及高效液相色譜儀考察：精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液20、15、10、5、2、1 μL，進(jìn)行測(cè)定，以丹參酮ⅡA為內(nèi)參物，按“2.6”項(xiàng)下計(jì)算丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的相對(duì)校正因子。見表2。結(jié)果表明，相對(duì)校正因子在不同色譜系統(tǒng)和不同品牌色譜柱下具有良好的適應(yīng)性。2)待測(cè)組分色譜峰的定位：試驗(yàn)中利用3個(gè)成分色譜行為的不同，以丹參酮ⅡA為基準(zhǔn)峰計(jì)算各個(gè)化合物的相對(duì)保留時(shí)間，即確定其在色譜圖中的位置。相對(duì)保留值rk/s=tR(k)/(tR(s)，tR(k)：某指標(biāo)成分的保留時(shí)間，tR(s)：內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間。見表3。

表2 不同儀器和色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子

表3 不同儀器和色譜柱測(cè)得相對(duì)保留值

2.12 樣品測(cè)定結(jié)果 按“2.3”項(xiàng)下方法制備了10批養(yǎng)血止疼丸供試品溶液，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣分析。采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法分別計(jì)算丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量。見表4。對(duì)所得結(jié)果用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，表明外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，將“一測(cè)多評(píng)”法用于養(yǎng)血止疼丸中丹參酮類成分的含量測(cè)定是可行的。

3 討論

由于丹參酮類成分受熱不穩(wěn)定，故未考察熱提取方式。試驗(yàn)采用對(duì)樣品用甲醇超聲處理30 min。并考察了提取溶劑的用量，結(jié)果表明，甲醇在30、40、50 mL時(shí)測(cè)得的丹參酮I、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明甲醇用量對(duì)丹參酮類各成分的提取效率無顯著影響。最后確定甲醇用量為30 mL。

流動(dòng)相的選擇，試驗(yàn)對(duì)5種展開系統(tǒng)進(jìn)行了考察。曾采用甲醇-水(70∶30)、乙腈-0.02%磷酸溶液(80∶20)、乙腈-水(75∶25)等不同流動(dòng)相，結(jié)果測(cè)定流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)時(shí)丹參酮類成分峰形良好，可達(dá)到基線分離，與相鄰峰分離度較好。

本試驗(yàn)的重點(diǎn)是色譜峰的專屬性和校正因子問題。實(shí)驗(yàn)中3個(gè)丹參酮類成分在不同柱子和儀器上出峰時(shí)間有所變化，保留時(shí)間差之間有差異。但以丹參酮ⅡA為基準(zhǔn)峰計(jì)算的各個(gè)化合物的相對(duì)保留時(shí)間值變化不大，所以利用相對(duì)保留值能較好的解決各化合物的定位問題。

本實(shí)驗(yàn)只考察了丹參酮類3個(gè)成分的相對(duì)校正因子，且3個(gè)成分都屬于同一類化合物。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用一測(cè)多評(píng)法對(duì)不同類化合物之間的校正因子和專屬性進(jìn)行研究。

表4 外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定養(yǎng)血止疼丸中3種丹參酮類成分含量(mg/g)

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SimultaneousDeterminationof3TanshinonesinYangxueZhitengPillbyQAMS

Wu Ailing1,2

(1HenanLuoyangOrthopedic-TraumatologicalHospital，Luoyang471002，China; 2HenanLuozhengPharmaceuticalLimitedLiabilityCompany，Luoyang471013，China)

Objective:To determine the contents of three tanshinones in Yangxue Zhiteng Pill by QAMS and to validate its feasibility.MethodsThe tanshinone IIA as the internal reference substance，the relative correction factor of tanshinone I and cryptotanshinone were determined by HPLC on different instruments and chromatographic columns.The content of tanshinone IIA in Yangxue Zhiteng Pill was authentically determined by the external standard method，and the content of tanshinone I and cryptotanshinone was calculated by external standard method and relative correction factor respectively.ResultsThe QAMS could determine the content of tanshinone I，cryptotanshinone and tanshinone IIA.No significant differences between the quantitative results of QAMS and external standard method were observed.ConclusionThe QAMS can determine the quality of content of tanshinone in Yangxue Zhiteng Pill.

Quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS); HPLC; Yangxue Zhiteng Pill; Tanshinone

河南省洛正藥業(yè)有限責(zé)任公司科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(LZZKJ-BZ-032)——養(yǎng)血止疼丸質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提高研究

武愛玲(1978.05—)，女，碩士，主管藥師，研究方向：中藥制劑開發(fā)與研究，E-mail：wal2317@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.055

(2016-08-15收稿 責(zé)任編輯：張文婷)