益氣解毒方基于線粒體保護(hù)的抗缺血性腦卒中研究

楊若聰 田朋朋 吳傳鴻 段飛鵬 陳修平 張麗紅 閆智勇 李韶菁

(1 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都,610031; 2 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700; 3 澳門大學(xué),澳門,519000; 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100029; 5 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,成都,610075)

實(shí)驗(yàn)研究

益氣解毒方基于線粒體保護(hù)的抗缺血性腦卒中研究

楊若聰1,2田朋朋2吳傳鴻3段飛鵬4陳修平3張麗紅5閆智勇1李韶菁2

(1 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都,610031; 2 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700; 3 澳門大學(xué),澳門,519000; 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100029; 5 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,成都,610075)

目的:基于線粒體呼吸功能,研究益氣解毒方對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用。方法:采取大鼠中腦動(dòng)脈閉塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),造模前15 min給予益氣解毒方及相應(yīng)拆方,造模12 h后,取材,提取腦組織線粒體,檢測(cè)線粒體三態(tài)呼吸速率、四態(tài)呼吸速率、磷氧比、呼吸控制率、氧化磷酸化率等指標(biāo),評(píng)價(jià)益氣解毒方對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)效果。此外,通過主成份分析(Principal Component Analysis,PCA)和變量重要性指標(biāo)(Variable Importance in Projection,VIP),評(píng)價(jià)益氣解毒方各組分在抗缺血性腦卒中的作用效果。結(jié)果:益氣解毒方能改善缺血性腦卒中病理過程中線粒體呼吸相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo),益氣解毒方各拆方對(duì)缺血性腦卒中也有較好的改善作用。PCA結(jié)果顯示,與各拆方組比較,益氣解毒方全方的治療效果最好;在各拆方組中,人參皂苷和黃連素配伍后的效果最好。VIP分析結(jié)果顯示,益氣解毒方基于保護(hù)線粒體呼吸功能來改善缺血性腦卒中的病理過程中,黃連素的貢獻(xiàn)度最大。結(jié)論:益氣解毒方能夠顯著降低缺血性腦卒中病理過程中所造成機(jī)體損傷,其機(jī)制可能與保護(hù)線粒體功能有關(guān)。

益氣解毒方;腦卒中;線粒體

近年來,隨著人們生活水平的提高和生活壓力的增大,腦卒中的發(fā)病率呈現(xiàn)迅速上升的趨勢(shì)[1]。在成年人的發(fā)病人群中,腦卒中是一種具有極高的高致死率且預(yù)后較差[2-3],給社會(huì)和患者家庭造成極大的負(fù)擔(dān)[4-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì),在2010年,全球范圍內(nèi)腦卒中的新增患者病例為3 300萬人,其中509萬患者死亡,1 020萬人因?yàn)槟X卒中喪失生活自理能力[8],這使腦卒中成為僅次于缺血性心臟病的第2大致死性疾病。然而,目前尚缺乏治療腦卒中的特效藥[9]。

能量代謝紊亂是腦卒中主要病理過程之一,能量代謝紊亂的嚴(yán)重程度及是否能夠及時(shí)得到糾正,會(huì)直接影響到患者的預(yù)后情況。作為細(xì)胞中最重要的能量供應(yīng)細(xì)胞器,線粒體的功能在腦卒中的病理過程中,受到了嚴(yán)重的影響[10]。如何及時(shí)消除線粒體功能的紊亂狀態(tài),成為能否保護(hù)并減少缺血狀態(tài)下細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。因此,能否及時(shí)保護(hù)腦卒中病理過程中線粒體的功能,對(duì)于腦卒中后的恢復(fù),有重要的意義[11]。

益氣解毒方是由人參、黃連、梔子等3味中藥組成,是基于“毒損腦絡(luò)”的病機(jī),采用扶正祛邪的治法治療中醫(yī)腦病的經(jīng)驗(yàn)方,臨床應(yīng)用中具有較為顯著的治療效果。為進(jìn)一步探討益氣解毒方抗腦缺血、治療缺血性中風(fēng)的作用及配伍機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)中分別選取人參、黃連、梔子的主要有效成分人參總皂苷(Ginsenosides,G)、黃連素(Berberine,B)、梔子苷(Jasminoidin,J)及3者按照臨床用藥比例組合而成的益氣解毒方(YJ)作為研究對(duì)象,以探討其對(duì)局灶性腦缺血腦組織線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康Sprague Dawley(SD)大鼠(SPF-VAF級(jí)),體重250～260 g,雄性,購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004;SCXK-(京)2014-0013。置于溫度(25±2)℃飼養(yǎng)室,動(dòng)物均自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 藥物 選取銀杏葉提取物(EGb761)作為陽性對(duì)照藥,購于德國威瑪舒培博士藥廠。人參總皂苷,人參皂苷Rg、Re、Rd總含量≥40.55%±2.10%,購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;黃連素,純度≥95.18%,購于咸陽航空一六八生物工程有限公司;梔子苷,純度≥99.68%,購于寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司。全部實(shí)驗(yàn)用藥物均用純水配制。

1.1.3 試劑與儀器 L-谷氨酸,L-蘋果酸,ADP-Na,BSA購自美國Sigma公司;Na2EDTA,TrisBase,購自美國Amresco公司;水合氯醛,購自中國國藥集團(tuán);蔗糖,購自北京北化精細(xì)化學(xué)有限責(zé)任公司;BCA蛋白定量試劑盒,購自中國普利萊生物技術(shù)公司;L-谷氨酸,L-蘋果酸,ADP-Na分別配制成1 000×儲(chǔ)液,-20 ℃保存;線粒體分離保存介質(zhì):由蔗糖(250 mmol/L)、Na2EDTA(0.5 mmol/L)、Tris-HCl(10 mmol/L)、BSA(0.1%)配制而成,pH=7.1,4 ℃儲(chǔ)存。SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);782 Oxygen System(英國Strathkelvin公司);組織勻漿器(涿州市琦瑞玻璃制品廠);微量加樣器(20、200、1000 μL)(德國Eppendorf公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司);萬級(jí)天平(型號(hào):FA2204B,上海精密科學(xué)儀器有限公司);實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)STARTER2100(奧豪斯儀器(上海)有限公司);數(shù)顯恒溫?cái)嚢韬銣厮?型號(hào):HH-60,常州國華電器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組(銀杏葉提取物，EGb7614 mg/kg)、益氣解毒方(YJ)高、中、低(25、5、1 mg/kg)劑量組和人參總皂苷(G)、黃連素(B)、梔子苷(J)劑量組(25、5 mg/kg)，人參總皂苷-黃連素(GB)劑量組(25、5 mg/kg)、人參皂苷-梔子苷(GJ)劑量組(25、5 mg/kg)，黃連素-梔子苷(BJ)劑量組(25、5 mg/kg)，每組8只。各給藥組均在手術(shù)前15 min灌胃給藥,假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 采用大鼠中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型。假手術(shù)組不進(jìn)行線栓,僅行術(shù)前麻醉以及血管分離;其余各組均復(fù)制MCAO模型。參照LongaEZ[12]建立的大鼠大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓阻斷方法,對(duì)SD大鼠行大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù),建立大鼠局灶性腦缺血模型,10%的水合氯醛腹腔注射(400 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。將大鼠仰臥固定,75%乙醇消毒頸部皮膚,于正中切口,分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈,并在近心端夾閉頸總動(dòng)脈,繼續(xù)分離出頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈,在頸總動(dòng)脈距分叉處1.5 cm處剪一小口,用制備好的5 cm魚線沿頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈。當(dāng)進(jìn)入頸總動(dòng)脈分叉處以上的魚線長(zhǎng)度為2 cm時(shí),停止并結(jié)扎開口上下的頸總動(dòng)脈。整個(gè)手術(shù)過程室溫保持在(22±2)℃。術(shù)后12 h,先對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分后,脫頸處死后取腦,進(jìn)行體外線粒體懸液的制備。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分:參照Bederson等[13]的5級(jí)評(píng)分法(0～4分),分?jǐn)?shù)越高,說明大鼠神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。2)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后,取大鼠缺血側(cè)腦組織制備腦線粒體懸液。為了保持線粒體活性,整個(gè)操作應(yīng)保持低溫,將缺血側(cè)腦稱重,加入4 ℃預(yù)冷的線粒體分離介質(zhì)沖洗2次(W∶V=0∶1),以去除皮層表面血管。制備質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為20%的腦勻漿液,后進(jìn)行梯度離心。將所得的線粒體懸液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,統(tǒng)一定量為10 mg/kg。

線粒體呼吸活性測(cè)定取新鮮的線粒體懸液,采用Clark氧電極法測(cè)定線粒體呼吸活性,采用782 Oxygen System進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)總體積1.0 mL,反應(yīng)溫度25 ℃。校準(zhǔn)電極后依次加入反應(yīng)體系、L-谷氨酸、L-蘋果酸、ADP-Na,觀察并記錄氧耗曲線。測(cè)定線粒體三態(tài)呼吸速率(State 3 Respiration Rate,V3)、線粒體4態(tài)呼吸率(State 4 Respiration Rate)及線粒體磷氧比(Oxidative Phosphorylation Efficiency,ADP/O),并且按照如下公式計(jì)算各參數(shù)值:RCR=V3/V4,OPR=V3×ADP/O(nmol ATP/min/mg Protein)。且所得指標(biāo)進(jìn)行主成分分析和VIP分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差反映,采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異分析,PCA用SPSS 17.0進(jìn)行分析,VIP分析采用SIMCA-P 13.0進(jìn)行。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 大鼠行MCAO手術(shù)后24 h,模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表示MCAO手術(shù)對(duì)大鼠產(chǎn)生了明顯的損傷;與模型組比較,益氣解毒高、中、低劑量組,人參皂苷和黃連素配伍高、低劑量組,黃連素和梔子苷配伍高、低劑量組,人參皂苷和梔子苷配伍高劑量組,黃連素高劑量組,梔子苷高劑量組、陽性藥組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明益氣解毒方總方高、中、低劑量及各單個(gè)組分高劑量給藥均可改善局灶性腦缺血引起的肢體行動(dòng)障礙。結(jié)果見圖1。

2.2 對(duì)線粒體呼吸的影響 與假手術(shù)組(Sham)比較,模型組(Model)各呼吸指標(biāo)明顯降低(P<0.01,P<0.05),表明大鼠行MCAO手術(shù)后,線粒體呼吸速率受到影響。在ADP/O的檢測(cè)中,EGb761明顯高于模型組(P<0.01);YJ高、中劑量組均明顯高于模型組(P<0.01),低劑量組與模型組比較沒有明顯的差異;GB配伍、BJ伍、GJ配伍的高劑量組均明顯高于模型組(P<0.01),各配伍的低劑量組均沒有明顯的效果;G高、低劑量組,B高劑量組,與模型組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),B低劑量組、J高、低劑量組沒有明顯效果。結(jié)果見圖2(A)。在RCR檢測(cè)中,EGb761明顯高于模型組(P<0.01);YJ高劑量組高于模型組(P<0.05),益氣解毒方中、低劑量組沒有明顯效果;B和J配伍組高于模型組(P<0.05),B和J配伍低劑量組、G和B配伍高、低劑量組、G和J配伍高、低劑量組均沒有明顯的差異;G、B、J各高、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2(B)。在OPR的檢測(cè)中,EGb761明顯高于模型組(P<0.01);YJ高、中劑量組高于模型組(P<0.01),益氣解毒方低劑量組具有較為明顯的效果(P<0.05);G和B配伍高劑量組較模型組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其他各兩兩配伍組無明顯效果;B高劑量組較模型組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),G低劑量組較模型組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其他各單方組沒有明顯效果。結(jié)果見圖2(C)。在V3的檢測(cè)中,EGb761明顯高于模型組(P<0.01);YJ高、中、低劑量組均明顯高于模型組(P<0.01);G和B配伍組、B和J配伍組及G和J配伍高劑量組均高于模型組(P<0.01),人參總皂苷和B配伍、B和J配伍及G和J配伍低劑量組效果不明顯;G高、低劑量組,B高劑量組均高于模型組(P<0.01),B低劑量組,J高、低劑量組無明顯效果。結(jié)果見圖2(D)。在V4的檢測(cè)中,EGb761明顯高于模型組(P<0.01);YJ高、中、低劑量組均明顯高于模型組(P<0.01);B高劑量、低劑量組明顯高于模型組(P<0.01);其余各組均無明顯效果。結(jié)果見圖2(E)。

圖1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)圖

注：益氣解毒方及有效成分對(duì)MCAO大鼠模型神經(jīng)行為學(xué)治療效果評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)值用mean±SDM值表示，數(shù)據(jù)用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行分析。圖中△、△△分別表示假手術(shù)組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05、P<0.01；圖中*、**分別表示同模型組比較，各觀察組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05、P<0.01

圖2 益氣解毒方保護(hù)線粒體紊亂效果

注：益氣解毒方及有效成分對(duì)MCAO大鼠腦內(nèi)線粒體功能的治療效果評(píng)價(jià)。(A)ADP/O值；(B)RCR值；(C)OPR值；(D)V3值；(E)V4值。數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SDM值表示(n=8)，數(shù)據(jù)用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行分析。圖中△、△△分別表示假手術(shù)組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05、P<0.01；圖中*、**分別表示同模型組比較，各觀察組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05、P<0.01。圖中計(jì)量單位為mg/kg

圖3 益氣解毒方組方PCA分析結(jié)果

注：圖中采用主成分分析(PCA)的方法對(duì)益氣解毒方配伍分析。(A)線粒體功能的主成份分析結(jié)果；(B)對(duì)G、GB、GJ及YJ各組的主成份分析結(jié)果；(C)對(duì)B、GB、BJ及YJ各組的主成份分析結(jié)果；(D)對(duì)J、BJ、GJ及YJ各組的主成份分析結(jié)果。以上數(shù)據(jù)用mean±SD值表示(n=8)，并且用單因素方差法進(jìn)行分析(one-way ANOVA)，圖中△、△△分別表示假手術(shù)組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05、P<0.01；圖中*、**分別表示同各組同G、B、J 3個(gè)成分觀察組比較，治療效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05、P<0.01

2.3 PCA分析與VIP分析 PCA結(jié)果顯示,模型組與假手術(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明MCAO模型對(duì)動(dòng)物造成了明顯的損傷。EGb761組,YJ全方高、中、低劑量組,G和B配伍高、低劑量組,B和J配伍高劑量組,G高、低劑量組,B高、低劑量組,J高劑量組相較于模型組,均有明顯的差異(P<0.01)。此外,YJ高劑量組較各兩兩組方高劑量組和各單方高劑量組,均具有較為明顯的效果(P<0.01或P<0.05),證明YJ方整體的治療效果最為理想。見圖3。

VIP結(jié)果顯示,在益氣解毒方整個(gè)組方中,G和B的VIP值大于1,在整個(gè)組方保護(hù)線粒體的作用中,為主要的貢獻(xiàn)成分。見圖4。

圖4 益氣解毒方成分VIP分析結(jié)果

3 討論

腦是機(jī)體能量代謝最快的器官之一,但腦中對(duì)能量和氧的儲(chǔ)存能力并不高,因此,維持腦部組織的正常運(yùn)行,需要足夠的氧氣和血流量。在腦卒中的病理過程中,局部供血、供氧被中斷,缺氧造成線粒體功能紊亂和線粒體結(jié)構(gòu)損傷,影響能量的生成,導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡,造成嚴(yán)重?fù)p傷[14]。

益氣解毒方(人參、黃連、梔子)是根據(jù)中醫(yī)腦病的癥候特點(diǎn),不同于傳統(tǒng)中風(fēng)治療“活血化瘀”,而針對(duì)“毒損腦絡(luò)”的關(guān)鍵病機(jī),應(yīng)用益氣加解毒的全新治法,采用辨證施治,扶正與解毒并舉治療腦病的臨床經(jīng)驗(yàn)方[15]。研究結(jié)果表明,益氣解毒方能夠通過保護(hù)線粒體呼吸及能量代謝的相關(guān)通路,減少腦卒中期間線粒體紊亂的相關(guān)損傷,降低細(xì)胞的凋亡情況。其中,在所有給藥組中,益氣解毒方全方效果最佳;兩兩組方中,黃連素和人參皂苷配伍總體效果最好;單方給藥中,黃連素的治療效果最好。并且,通過PCA和VIP分析發(fā)現(xiàn),在基于線粒體的保護(hù)效果中,人參皂苷和黃連素為全方最為有效的成分。

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StudyonEffectsofYiqiJieduFangonMitochondrialMetabolism-relatedEnergyFunctioninIschemicStrokeRats

Yang Ruocong1,2, Tian Pengpeng2, Wu Chuanhong3, Duan Feipeng4, Chen Xiuping3,Zhang Lihong5, Yan Zhiyong1, Li Shaojing2

(1SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China; 2InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 3UniversityofMacau,Macao519000,China; 4SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 5SchoolofClinicalMedicine,ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective:To study the effects of Yiqi Jiedu Fang on mitochondrial energy metabolism related functions in ischemic stroke rats, and to explore the possible protective mechanisms of Yiqi Jiedu Fang on ischemic stroke through intervening the mitochondrial energy metabolism disorder.MethodsMiddle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) was used. Yiqi Jiedu Fang and its separated formulas were given 15 min prior to MCAO. After 12 h of modeling, mitochondria were extracted. Indexes of mitochondrial three-state respiration rate, four-state respiratory rate, phosphorus-oxygen ratio, respiratory control rate, oxidative phosphorylation rate and other indicators were determined. The protective effect of Yiqi Jiedu Fang on ischemic stroke was evaluated. In addition, the effect of each component of Yiqi Jiedu Fang on anti-ischemic stroke was evaluated by Principal Component Analysis (PCA) and Variable Importance in Projection (VIP).ResultsYiqi Jiedu Fang can improve the mitochondrial respiration related indexes during the pathological process of ischemic stroke. The separated formula of Yiqi Jiedu Fang also has a better effect on ischemic stroke. PCA results showed that compared with other separated formula groups, Yiqi Jiedu Fang group had the best treatment effect. In each separated formula groups, the compatibility of Radix et Rhizoma Ginseng, Fructus Gleditsiae and berberine had the best treatment effect. The results of VIP analysis showed that berberine had the largest contribution to the pathological process of ischemic stroke based on the protection of mitochondrial respiratory function.ConclusionYiqi Jiedu Fang can significantly reduce the pathological damage caused by ischemic stroke, whose mechanism may be related to the protection of mitochondrial function.

Yiqi Jiedu Fang, Stroke, Mitochondrial

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274133,81303261);國家科技重大專項(xiàng)(重大新藥創(chuàng)制)資助項(xiàng)目(2012ZX09103201-055)

楊若聰(1992.02—),男,碩士研究生,研究方向:中藥藥理學(xué),E-mail:yangruocong@163.com

閆智勇(1971.11—),男,博士,教授,研究方向:中藥藥理學(xué)研究,E-mail:yzhiy@home.swjtu.edu.cn;李韶菁(1974.03—),女,博士,副研究員,研究方向:中藥組效關(guān)系和分子藥理學(xué)研究,E-mail:shaojingli2004@126.com

R255.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.042

(2017-01-09收稿 責(zé)任編輯：王明)